Методические указания МУК 4.1.1431-03 "Определение остаточных количеств Прометрина в зеленой массе петрушки и укропа, клубнях картофеля, корнеплодах моркови и петрушки методом газожидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1431-03
"Определение остаточных количеств Прометрина в зеленой массе петрушки и укропа, клубнях картофеля, корнеплодах моркови и петрушки методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Дата введения: 30 июня 2003 г.

2. Методика определения остаточных количеств Прометрина в зеленой массе петрушки и укропа, клубнях картофеля, корнеплодах моркови и петрушки методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении Прометрина методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора после экстракции веществ органическим растворителем, очистки экстрактов путем перевода соединений в ионизированную форму и последующего перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода газожидкостной хроматографии приведена в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода газожидкостной хроматографии

Метрологические параметры, р = 0,95, n = 20
анализируемый объект	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S	доверительный интервал среднего результата, %
Клубни картофеля, корнеплоды моркови и петрушки	0,02	0,02-0,32	91,9	4,34
Зеленая масса петрушки и укропа	0,02	0,02-0,32	83,2	4,95

2.1.3. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых для защиты овощных и плодовых культур от вредителей и болезней (хлор- и фосфорорганические пестициды, амиды, тио- и дитиокарбаматы, синтетические пиретроиды).

Таблица 2

Доверительный интервал и полнота определения Прометрина в клубнях картофеля, корнеплодах моркови и петрушки и в зеленой массе петрушки и укропа

Среда	Добавлено Прометрина, мг/кг	Обнаружено Прометрина, мг/кг	Доверительный интервал,	Полнота определения, %
Клубни картофеля, корнеплоды моркови и петрушки	0,02	0,0185	0,0020	92,5
	0,04	0,0370	0,0020	91,3
	0,16	0,1440	0,0062	90,1
	0,32	0,3000	0,0140	93,7
Зеленая масса петрушки и укропа	0,02	0,0168	0,0020	84,4
	0,04	0,0330	0,0030	82,5
	0,16	0,1370	0,0091	85,6
	0,32	0,2570	0,0118	80,4

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

Аналитический стандарт Прометрина с содержанием не менее 95% д.в., фирма Сингента
Азот особой чистоты	ГОСТ 9293-74
Ацетон	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил	ТУ 6-09-3534-87
Гексан	ТУ 6-09-3375-78
Гелий очищенный марки "А"	ТУ-51-940-80
Кислота хлороводородная, 0,1 н водный раствор
Кислота хлороводородная, концентрированная, хч	ГОСТ 3118-77
Натрий сернокислый, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрия хлорид, насыщенный водный раствор
Натрия хлорид, хч	ГОСТ 4233-77
Неподвижные фазы для газожидкостной хроматографии: SE-30, 5% на Хроматоне-N-AW (0,16-0,20 мм), фирма Хемапол, Чехия
Флорисил для колоночной хроматографии с размером частиц 60-80 меш., фирма Мерк, или аналогичный
Хлороформ, ч	ГОСТ 20015-74
Этилацетат	ГОСТ 22300-76
Эфир диэтиловый (для наркоза, Фармакопея СССР)

2.2.2. Посуда и оборудование

Вакуумный ротационный испаритель МР-1М	ТУ 25-11-917-74
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные	ГОСТ 34104-80Е
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности г	ГОСТ 19491-74
Водоструйный насос	ГОСТ 10696-75
Воронки делительные 250, 500 мл	ГОСТ 25336-82Е
Воронки для фильтрования стеклянные	ГОСТ 8613-75
Встряхиватель механический	ТУ 64-1-1081-73
Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 мл	ГОСТ 10394-72
Колбы мерные на 25, 50 и 100 мл	ГОСТ 1770-74
Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5 (5% фенилсиликона +95% метилсиликона), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма Хьюлетт Пакард или аналогичная Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 2 м с внутренним диаметром 3 мм (заполненная носителем)
Концентраторы грушевидные (конические) 250 мл	ГОСТ 10394-72
Микрошприц для газового хроматографа на 1-10 мкл
Пипетки мерные на 1; 2,0; 5,0; 10 мл	ГОСТ 20292-74
Фильтры бумажные "красная лента"	ТУ 6-09-2678-77
Хроматограф газовый "Цвет-600" или другой марки, снабженный термоионным детектором на азот
Хроматограф газовый "Кристалл 2000 м" с термоионным детектором на азот и приспособлениями для капиллярной колонки
Центрифужные банки полипропиленовые с крышками объемом 250 мл, Nalgene, cat. N 3120-025

2.3. Подготовка к определению

2.3.1. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг Прометрина в мерной колбе на 50 мл, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Получают исходный стандартный раствор N 1 с концентрацией 1 мг/мл, который хранят в холодильнике в течение 6 месяцев.

Методом последовательного разведения готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией Прометрина 10 мкг/мл в ацетоне, который можно хранить в холодильнике 30 дней.

2.3.2. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика из стандартного раствора N 2 готовят методом последовательного разбавления ацетоном стандартные растворы с концентрацией: 4,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25 мкг/мл. Вводят в хроматограф по 2-3 мкл каждого стандартного раствора, измеряют высоту пиков и строят график зависимости высоты пика от концентрации раствора.

2.3.3. Подготовка колонки для очистки экстракта

2.3.3.1. Подготовка колонки с Флорисилом.

В стеклянную или пластмассовую колонку длиной 15 см, диаметром 1,5 см помещают на дно стекловату и заполняют колонку Флорисилом на высоту 10 см. На слой Флорисила насыпают слой безводного толщиной 1,0 см. За день до очистки экстракта колонку промывают последовательно 20 мл ацетона и 10 мл гексана. После промывки колонка готова к работе.

2.3.3.2. Проверка хроматографического поведения Прометрина на колонках с Флорисилом.

При отработке методики или поступлении новой партии сорбента (Флорисил) проводят изучение поведения Прометрина на колонке.

Для этого в концентратор (или пробирку) вносят 1 мл стандартного раствора Прометрина концентрацией 4 мкг/мл, упаривают растворитель на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°C досуха или в токе теплого воздуха.

Затем растворяют Прометрин в 1 мл смеси растворителей гексан:ацетон в соотношении 4:1 и наносят его на подготовленную, как указано выше, колонку. Промывают колонку 15 мл гексана, смыв отбрасывают. Затем пропускают через колонку 25 мл смеси гексан:этилацетат в соотношении 7:2, отбирая последовательно по 5 мл элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°C досуха.

Сухие остатки растворяют в 2 мл ацетона и вводят в хроматограф 2-3 мкл. По результатам обнаружения Прометрина в каждой фракции определяют объем смеси гексан:этилацетат, необходимой для полного вымывания Прометрина.

2.4. Отбор, хранение и доставка проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы корнеплодов и зеленой массы хранятся при температуре 0-4°C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживаются и хранятся при температуре -18°C.

2.5. Проведение определения

2.5.1. Клубни картофеля, корнеплоды моркови, петрушки и зеленая масса укропа и петрушки

Навеску измельченного растительного материала (корнеплоды моркови, корнеплоды петрушки, зеленая масса укропа или зеленая масса петрушки) массой 25 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, заливают 70 мл ацетонитрила и встряхивают в течение 30 мин. Экстракт отфильтровывают через воронку с бумажным фильтром в концентратор емкостью 250 мл. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя каждый раз по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь в течение 30 мин.

Экстракты отфильтровывают и объединяют в концентраторе. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°C досуха. (Упаривание проводить осторожно, т.к. возможно вспенивание ацетонитрила.)

Водный остаток в концентраторе растворяют в 25 мл 0,1 н раствора соляной кислоты и фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор еще раз ополаскивают 25 мл 0,1 н раствора соляной кислоты и через фильтр переносят в ту же делительную воронку. Объединенный в делительной воронке раствор промывают смесью гексан:эфир в соотношении 7:1 по объему, 2 раза порциями по 20 мл. Сливают из делительной воронки нижний водный слой в химический стакан объемом 100 мл, а смесь гексан:эфир отбрасывают. После промывания водную фазу в стакане подщелачивают 1 н раствором едкого натрия (около 4,5 мл) до рН = 8.

Переносят полученный раствор в делительную воронку и реэкстрагируют Прометрин тремя порциями хлороформа по 20 мл каждая. Сливают из делительной воронки каждый раз нижний слой (хлороформ) в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Объединенные экстракты упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°C досуха.

Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона и вводят в хроматограф 2-3 мкл раствора. При наличии мешающих пиков в контрольных образцах экстракт очищают на колонках с Флорисилом.

2.5.2. Очистка образцов на колонке

При очистке образцов на колонке сухой остаток в концентраторе, полученный при упаривании хлороформа, растворяют в 1 мл смеси гексан:ацетон в соотношении 4:1 и наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 15 мл гексана и 5 мл смеси гексан:этилацетат - 7:2, смывы отбрасывают.

Элюируют Прометрин 15 мл смеси гексан:этилацетат (7:2). Элюат собирают в концентратор и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40°C досуха. Сухой остаток разводят в 2 мл ацетона и вводят в хроматограф 2-3 мкл.

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

2.6.1. Условия хроматографирования

Хроматограф "Цвет-600" с термоионным детектором по азоту.

Рабочая шкала электрометра . Скорость движения ленты самописца 10 мм/мин.

Колонка стеклянная спиральная, длина 2 м, внутренний диаметр 3 мм.

Носитель - Хроматом N-AW, неподвижная фаза SE-30, 5%, размер частиц 0,20-0,25 мм.

Температура испарителя - 270°C, термостата колонки - 190°C, переходной камеры - 364°C.

Газовый режим:	азот - 45 мл/мин;
	водород - 13 мл/мин;
	воздух - 180 мл/мин.

Абсолютное время удерживания Прометрина - 1 мин 16 с.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,75-12,00 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией Прометрина 4,0 мкг/мл соответственно, разбавляют.

2.6.1.1. Альтернативные условия хроматографирования.

Хроматограф газовый "Кристалл 2000 м" с термоионным детектором на азот.

Капиллярная кварцевая колонка HP-5 (5% фенилсиликона + 95% метилсиликона), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Программированная температура термостата колонки: начальная температура - 160°C, выдержка - 2 мин; нагрев колонки по 30°C/мин до 250°C, выдержка 5 мин.

Температура испарителя -	260°C;
детектора -	350°C.

Регулятор расхода гелия - РРГ-11; режим - Splitless.

Газ 1 - гелий, линейная скорость - 20 см/с, давление на входе - 27,29 кПа.

Газ 2 - гелий (продувка испарителя), расход - 1,0 мл/мин; сброс 1:50.

Газ 3 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 40 мл/мин.

Расход водорода - 15 мл/мин, воздуха - 180 мл/мин.

Абсолютное время удерживания Прометрина - 4 мин 30 с.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,25-4,00 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией Прометрина 4,0 мкг/мл соответственно, разбавляют.

2.6.2. Обработка результатов анализов

Содержание Прометрина рассчитывают по формуле:

, где

X - содержание Прометрина в пробе, мг/кг;

- высота (площадь) пика стандарта, мВ;

- высота (площадь) пика образца, мВ;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание Прометрина в аналитическом стандарте, %.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

4. Разработчики

Калинин В.А., профессор, канд. с.-х. наук, Довгилевич Е.В., канд. биол. наук, Калинина Т.С., канд. с.-х. наук, Довгилевич А.В., канд. хим. наук.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (095) 976-37-68, факс: (095) 976-43-26.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко