Методические указания Главного управления ветеринарии Минсельхоза СССР от 25 апреля 1985 г. N 115-6а "По диагностике пебрины тутового шелкопряда"

1. Общие положения

1.1. Пебрина - инвазионная болезнь тутового шелкопряда, вызываемая микроспоридией Nosema bombycis, характеризующаяся ослаблением особей, их истощением, сморщиванием и гибелью. Пебрина поражает все стадии развития тутового шелкопряда.

1.2. Диагноз на пебрину ставят на основании клинических, эпизоотологических и лабораторных данных.

1.3. Для исследования в ветеринарную лабораторию направляют мертвую грену, гусениц, партии по 100 коконов из группы коконного брака (или 70 племенных и промышленных и дополнительно 30 коконов брака), а также 100 самцов, собранных из различных партий и всех погибших после откладки яиц и высохших бабочек.

2. Порядок исследования

2.1. При исследовании партий гусениц микроскопии подвергают шкурки, экскременты и сор с мест подстилки, их собирают в мерный цилиндр, доливают воду в расчете 1 мл на гусеницу и тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством песка (стеклянного порошка) или в гомогенизаторе. К приготовленной суспензии добавляют 10%-ный раствор щелочи (NаОН или KОН) - 2% к общему объему. Каплю суспензии помещают на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют в затемненном поле микроскопа при увеличении 400-600 раз. Погибших бабочек исследуют аналогичным способом.

При наличии спор N. bombycis видны овальные, преломляющие свет тела размером 2,0-2,5х3,5-4,2 мкм.

2.2. Для выявления и дифференциации спор используют окрашивание их карболовым фуксином. На предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости, препарат высушивают, фиксируют над пламенем горелки и подвергают окраске 0,6%-ным карболовым фуксином (0,5 г основного фуксина растворяют в 15 мл спирта и добавляют к 100 мл 5%-ного водного раствора фенола). Через 15 сек. карболовый фуксин смывают водой, докрашивают в течение 3 мин 3%-ным раствором малахитовой зелени, снова смывают водой и обесцвечивают 10-15 сек. 1%-ным раствором серной кислоты, снова смывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенные препараты исследуют под микроскопом при увеличении 400-600 раз. Споры ноземы окрашиваются в розовый цвет и контрастно выделяются на светло-зеленом фоне.

2.3. Для диагностики Nosema bombycis методом люминесцентного анализа готовят нативные препараты. Для этого гусениц тщательно растирают в ступке, наносят каплю растертой массы тонким слоем на предметное стекло и подсушивают. Препараты окрашивают раствором акридинового оранжевого в течение 5-10 минут. Раствор флуорохрома готовят на дистиллированной воде при рН 5,6-7,3 в разведении 1:10000. После окрашивания препараты промывают дистиллированной водой и исследуют в капле иммерсионного масла в люминесцентном микроскопе (светофильтры: ФС-1-2; CЗС-24; БС-8-2; запирающий фильтр ЖС-18; окуляры 8х, 10х; объектив х90; сила тока при микроскопировании 4,0-4,5 А). Живые споры светятся ярко-зеленым, а погибшие - желто-красным цветом.

2.4. Видовую принадлежность спор N. bombycis определяют непрямым методом реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Мазки из растертых гусениц (бабочек) подсушивают на воздухе и фиксируют в течение 30 мин в спирт-эфире 1:1. На мазок наносят несколько капель иммунной сыворотки (антиген и иммунные сыворотки против Nosema bombycis готовит ВИЭВ). Препараты помещают во влажную камеру при температуре 37°С на 1 час, а затем промывают физиологическим раствором в течение 30 мин. На подсушенные препараты наносят 1-2 капли антикроличьей люминесцирующей сыворотки (готовит ИЭМ им. Н.Ф. Гамелеи),# помещают снова во влажную камеру при 37°С на 1 час, затем промывают физиологическим раствором 30 мин, дважды заменяя его. После просушки на мазок наносят каплю нефлуоресцирующего иммерсионного масла или диметилфталата и исследуют в люминесцентном микроскопе (см. пункт 2.3). Реакция считается положительной при обнаружении спор с яркой зеленой люминесценцией их оболочки.

В контрольных мазках с нормальной сывороткой свечения не наблюдается.

Начальник Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР

А.Д. Третьяков