Приложение А (справочное). Хроматографические исследования

Приложение А
(справочное)

Хроматографические исследования

А.1 Предварительное замечание

Поскольку оснащение (7.8) лабораторий может быть разным, для хроматографических исследований невозможно представить общие инструкции. Успешно испытаны и использованы следующие параметры.

А.2 Тонкослойная хроматография [ТСХ (TLC)]

А.2.1
Пластины (ВЭТСХ [HPTLC])	силикагель 60 с флуоресцентным индикатором F254, 20 x 10 см.
Применяемый объем	от 2 до 5 мм3, наносится в виде капли.
Подвижный растворитель 1	хлороформ/уксусная кислота (90 x 10) частей на объем.
Реактив 1	для NOx-образования в пустую камеру помещают стакан с приблизительно 1 см3 серной кислоты и добавляют небольшое количество твердого нитрита натрия. Закрывают камеру крышкой и проводят реакцию. В камеру помещают сухую пластину. Через 5 мин ее вынимают и сушат в потоке холодного воздуха.
Реактив 2	затем обрызгивают пластину 0,2 %-ным раствором -нафтола, приготовленного в растворе KОН в метаноле (с = 1 моль/дм3).
Детектирование	1. Пластины ТСХ (TLC) с флуоресцентным индикатором F254. 2. Ультрафиолетовая лампа и/или после последовательной обработки реактивом 1 и реактивом 2. Время реакции - приблизительно 5 мин.
А.2.2
Пластины (ТСХ [TLC])	силикагель 60, 20 x 20 см2 с флуоресцентным индикатором F254.
Применяемый объем	10,0 мм3, наносится в виде линии.
Подвижный растворитель 2	хлороформ/этилацетат/уксусная кислота (60 + 30 + 10) частей на объем.
Подвижный растворитель 3	хлороформ/метанол (95 + 5) частей на объем.
Подвижный растворитель 4	н-бутилацетат/толуол (30 + 70) частей на объем.
Проведение	насыщенная камера.
Подвижные растворители 2 и 3	один за другим без просушивания пластин.
Детектирование	1. Пластины ТСХ (TLC) с флуоресцентным индикатором F254. 2. Ультрафиолетовая лампа и/или после последовательной обработки реактивом 1 и реактивом 2. Время реакции приблизительно 5 мин.
А.2.3
Пластины (ТСХ [TLC])	силикагель 60, 20 x 20 см2.
Применяемый объем	10,0 мм3, наносится в виде линии.
Подвижный растворитель 2	хлороформ/этилацетат/уксусная кислота (60 + 30 + 10) частей на объем.
Подвижный растворитель 3	хлороформ/метанол (95 + 5) частей на объем.
Проведение	Насыщенная камера.
А.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография [ВЭЖХ (HPLC)]
А.3.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография/фотометрический детектор с диодной матрицей [ВЭЖХ/ДМД (HPLC/DAD)]
Элюент 1	метанол.
Элюент 2	растворяют 0,68 г дигидрофосфата калия в 1000 см3 воды, затем добавляют 150 см3 метанола.
Неподвижная фаза	Zorbax Eclipse XDB С18 (3,5 мкм); 150 x 4,6 мм.
Скорость потока	от 0,6 до 2,0 см3/мин (градиент потока, см. ниже).
Температура колонки	32 °С.
Вводимый объем	5 мм3.
Детектирование	фотометрический детектор с диодной матрицей [ДМД (DAD)].
Количественное определение	при 240, 280, 305 и 380 нм.
Градиент	Время, мин	Элюент 1, %	Поток, см3
	0,00	10,0	0,6
	22,50	55,0	0,6
	27,50	100,0	0,6
	28,5	100,0	0,95
	28,51	100,0	2,0
	29,00	100,0	2,0
	29,01	10,0	2,0
	31,0	10,0	0,6
	35,00	10,0	0,6
А.3.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-селективный детектор [ВЭЖХ/МС (HPLC/MS)]
Элюент 1	ацетонитрил.
Элюент 2	5 ммоль ацетата аммония в 1 000 см3 воды, уровень рН = 3,0.
Неподвижная фаза	Zorbax Eclipse XDB С18 (3,5 мкм), 2,1 x 50 мм.
Скорость потока	300 мм3/мин.
Градиент	начало 10 % элюента 1, увеличение до 20 % элюента 1 в течение 1,5 мин, линейное увеличение до 90 % элюента 1 в течение 6 мин.
Температура колонки	40 °С.
Вводимый объем	2,0 мм3.
Детектирование	квадрупольный детектор и/или детектор с ионной ловушкой в режиме сканирования и/или масс-спектрометрическое детектирование дочерних ионов.
Газ-спрей	азот (в сосудах/генераторный).
Ионизация	электрораспыление, положительные, по API, фрагментор 120 В.
А.4 Капиллярная газовая хроматография/масс-селективный детектор [ГХ/MC(GC/MS)]
Капиллярная колонка	DB-35-MS (J и W) , длина 35 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.
Система ввода	с делением или без.
Температура инжектора	260 °С.
Газ-носитель	гелий.
Температурная программа	100 °С (2 мин), от 100 °С до 310 °С (15 °С/мин), 310 °С (2 мин).
Вводимый объем	1,0 мм3, деление 1:15.
Детектирование	МС (MS).
А.5 Капиллярный электрофорез [КЭ (СЕ)]
200 мм3 раствора образца (9.4) смешивают с 50 мм3 HCl (с = 0,01 моль/л) и пропускают через мембранный фильтр (0,2 мкм). Этот раствор анализируют с помощью капиллярно-зонального электрофореза.
Капилляр 1	56 см, без покрытия, внутренний диаметр 50 мкм, с увеличенной толщиной светопоглощающего слоя (agilent ).
Капилляр 2	56 см, покрытый поливиниловым спиртом [ПВС (PVA)], внутренний диаметр 50 мкм, с увеличенной толщиной светопоглощающего слоя (agilent ).
Буферный раствор	фосфатный буферный раствор (с = 50 ммоль/дм3), уровень рН = 2,5.
Температура колонки	25 °С.
Напряжение	30 кВ.
Время ввода	4 с.
Время продувки	5 с.
Детектирование	ДМД (DAD) 214, 254 нм, спектрограф.

------------------------------

^*_{1,4-фенилендиамин.}

^**_{анилин-ароматические амины с 1 по 21 (см. таблицу 1).}

------------------------------

X - время, мин; Y - поглощение, а.е.м (mAU), при 240 нм

Рисунок А.1 - Хроматограмма ВЭЖХ/ДМД