Приложение N 2

Приложение N 2

1. Приготовление фенолизированных растворов хлорида натрия для РА

Для приготовления фенолизированного 0,85; 5 и 10%-ного раствора хлорида натрия в 1000 мл дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5; 50 или 100 г хлорида натрия и 5 г фенола. Доводят рН раствора до 6,8 - 7,2 и фильтруют через бумажный фильтр.

2. Приготовление физиологического раствора хлорида натрия с добавлением ионов магния и кальция (для РСК и РДСК)

Основные растворы солей магния и кальция готовят следующим образом: 1 г хлорида магния х.ч. растворяют в 11,8 мл и 1 г хлорида кальция х.ч. - в 54,4 мл дистиллированной воды. Основные растворы этих солей хранят в холодильнике.

Перед постановкой реакции берут на 1 л физиологического раствора хлорида натрия по 1,2 мл основных растворов хлорида магния и хлорида кальция. Смесь кипятят, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр и доводят рН до 6,8 - 7,2 прибавлением едкого натрия или соляной кислоты.

3. Получение и подготовка к работе эритроцитов барана для постановки РСК и РДСК

Кровь у барана (овцы) берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в сосуд со стеклянными или фарфоровыми бусами для дефибринирования или в сосуд с налитым в него раствором Алсивера в количестве, равном объему крови.

Для консервирования дефибринированной крови применяют раствор стрептомицина (1 г стрептомицина, растворенного в 20 мл физиологического раствора, на 100 мл крови).

Дефибринированная кровь пригодна для использования в течение 3 сут., консервированная стрептомицином или раствором Алсивера - до 12 сут.

Приготовление раствора Алсивера: в 1000 мл дистиллированной воды растворяют 18,7 г глюкозы, 4,2 г хлорида натрия, 8,0 г лимоннокислого натрия, 0,5 г лимонной кислоты. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют путем трехкратного автоклавирования текучим паром в течение 30 мин. или путем фильтрации через стерилизующую пластину фильтра Зейтца.

Для приготовления суспензии эритроцитов свежую дефибринированную или консервированную кровь барана вносят в центрифужный стакан, добавляют физиологический раствор в соотношении не менее чем 8:1, перемешивают и центрифугируют при 2000 - 3000 об./мин. в течение соответственно 15 - 10 мин., надосадочную жидкость сливают или отсасывают пипеткой, а осадок эритроцитов еще 2 - 3 раза отмывают в физиологическом растворе в указанном порядке до полного обесцвечивания надосадочной жидкости. После каждого центрифугирования осадок ресуспендируют путем перемешивания в новой порции физиологического раствора. После последнего центрифугирования надосадочную жидкость полностью отсасывают пипеткой при возможно более горизонтальном положении стакана, отмытую кровь вручную перемешивают активными круговыми движениями или с помощью пипетки и используют для приготовления гемсистемы.

4. Титрование комплемента в гемолитической системе в РСК

Комплемент титруют в разведении 1:20 в дозах от 0,02 до 0,2 мл, которые готовят по п. 4.3.3.

После внесения комплемента в каждую пробирку добавляют остальные компоненты по схеме, приведенной в таблице 1.

Таблица 1

Схема титрования комплемента в гемолитической системе

Компоненты	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Доза комплемента в разведении 1:20	0,02	0,04	0,06	0,08	0,1	0,12	0,14	0,16	0,18	0,2
Физиологический раствор	0,18	0,16	0,14	0,12	0,1	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
водяная баня 10 минут при 37 - 38°С
Примерный результат	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

Титром комплемента в гемолитической системе считают его наименьшее количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 мин. в водяной бане при 37 - 38°С.

Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.

В примере, приведенном в таблице 1, титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08.

5. Титрование гемолизина

Гемолизин титруют в разведении 1:500, 1:750, 1:1000, 1:1250, 1:1500, 1:1750, 1:2000 по схеме, приведенной в таблице 2.

Таблица 2

Схема титрования гемолизина

Компоненты	Разведения гемолизина
	1:500	1:750	1:1000	1:1250	1:1500	1:1750	1:2000
Гемолизин	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент в разведении 1:20	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Эритроциты (2,5%-ная взвесь)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
водяная баня 10 мин. при 37 - 38°С
Примерный результат	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ

Разведения гемолизина готовят из исходного 1:100 (0,1 мл гемолизина смешивают с 9,9 мл физиологического раствора) по следующей схеме:

Основное разведение гемолизина 1:100 (мл)	Физиологический раствор (мл)	Получаемые разведения
0,2	0,8	1:500
0,2	1,3	1:750
0,2	1,8	1:1000
0,2	2,3	1:1250
0,2	2,8	1:1500
0,2	3,3	1:1750
0,2	3,8	1:2000

Титром гемолизина считают наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 мин. 0,2 мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 мл комплемента, разведенного 1:20. В приведенной таблице 2 титр гемолизина равен 1:1500.

Рабочий титр гемолизина для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так, если титр гемолизина равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.

6. Бруцеллезные антигены, используемые в серологических реакциях

Антиген бруцеллезный, единый для РА, РСК и РДСК представляет собой гомогенную взвесь инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в физиологическом растворе. Специфическая активность антигена стандартизована по стандартному образцу сыворотки антибруцелла абортус, что позволяет выражать результаты реакции агглютинации в международных единицах (МЕ) антител.

Перед употреблением антиген тщательно встряхивают.

Антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы (РБП) представляет собой стандартизованную суспензию в буферном растворе инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет.

Перед употреблением антиген выдерживают 30 - 40 мин. при комнатной температуре, затем тщательно встряхивают.

Антиген бруцеллезный для кольцевой реакции (КР) с молоком представляет собой стандартизованную взвесь инактивированных нагреванием бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий или тетразолием в красно-вишневый цвет. Перед употреблением антиген тщательно встряхивают.

Антигены во флаконах без этикеток (без надписи) или с трещинами, содержащие постороннюю примесь, не разбивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию для применения не пригодны.

7. Вакцины, применяющиеся для специфической профилактики бруцеллеза у животных, условно принято делить на две группы: агглютиногенные и неагглютиногенные

7.1. Агглютиногенные вакцины (из шт. Б. абортус 19, Б. абортус 82, Б. абортус 75/79 - АВ, Б. мелитензис Рев-1 и др.) изготавливают из культур бруцелл, находящихся в S- или в SR (RS-)-форме. В организме животных, привитых такими вакцинами, синтезируются специфические антитела, гомологичные S-антигену, выявляемые стандартными бруцеллезными диагностическими препаратами в РА, РСК, РДСК, РБП, КР с молоком, РИД с 0-ПС антигеном и др.

7.2. Неагглютиногенные вакцины представляют собой убитые культуры бруцелл в R-форме, эмульгированные в масляном или другом адъюванте (французская вакцина "Абортокс", отечественная - из штамма Б. абортус 17/100 и др.). Такие вакцины в организме иммунизированных здоровых животных не вызывают образования антител, выявляемых антигенами, изготовленными из бруцелл в S-форме (антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК, антиген бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы, 0-ПС антиген для РИД, антиген бруцеллезный эритроцитарный для реакции непрямой гемагглютинации - РНГА и др.).