Методические указания по лабораторной диагностике пироплазмидозов животных (утв. Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ 9 ноября 2000 г. N 13-7-2/2183)

Методические указания по лабораторной диагностике пироплазмидозов животных
(утв. Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ 9 ноября 2000 г. N 13-7-2/2183)

1. Общие положения

1.1. Пироплазмидозы (бабезиоз, тейлериоз) - протозойные болезни животных, вызываемые возбудителями отряда Piroplasmida. Возбудители пироплазмидозов обладают видовой специфичностью.

Пироплазмидозы вызывают у лошадей - Рiroplasma сaballi (Bаbеsiа caballi), Nuttallia equi (В. equi): у крупного рогатого скота - Р. bigeminum (В. bigemina), Babesia bovis (Francaiella colchica), B. divergens; у овец и коз - P. ovis (В. motasi). B. ovis; у собак Р. canis (B. canis).

Тейлериоз вызывают у крупного рогатого скота - Theileria annulata и Th. sergenti; у овец и коз - Th. ovis.

Заболевания протекают остро, подостро, хронически и сопровождаются лихорадкой, анемией, желтушностью и кровоизлияниями на слизистых оболочках, гемоглобинурией (при пироплазмозе-бабезиозе), увеличением лимфатических узлов (при тейлериозе) и заканчиваются нередко гибелью животных.

1.2. Диагноз на пироплазмидозы ставят на основании эпизоотологических, клинических, патолого-анатомических данных и результатов лабораторных исследований (микроскопического, серологического).

1.3. Лабораторные исследования на пироплазмидозы включают:

микроскопию мазков из крови, внутренних органов, головного мозга, пунктатов лимфатических узлов;

морфологическую дифференциацию возбудителей;

постановку и учет реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с нуталлийным антигеном для диагностики пироплазмидозов лошадей.

2. Отбор и пересылка материала для исследования

2.1. В лабораторию для исследования направляют от подозреваемых в заболевании или больных животных: тонкие мазки крови из периферических сосудов уха, хвоста или венчика; на тейлериоз дополнительно - мазки из пунктатов лимфатических узлов; 1-2 куб. см нативной сыворотки крови для серологического исследования на нутталлиоз, пироплазмоз лошадей; от павших и убитых животных - часть печени, легких, селезенки, почки, сердца, головного мозга и лимфатические узлы.

2.2. Мазки крови берут в период развития симптомов болезни, при повышенной температуре, до применения специфического лечения.

2.3. Перед отбором материала у животного шерсть на месте взятия крови выстригают, кожу тщательно протирают вначале ватным тампоном, смоченным в растворе этилового спирта, а затем сухим. Стерильной иглой делают прокол вены ушной раковины или ножницами надрезают край верхушки уха или хвоста. К свободной выступившей капле крови легко прикасаются поверхностью сухого обезжиренного предметного стекла. Затем стекло быстро поворачивают вверх каплей и удерживают пальцами левой руки в горизонтальном положении. Шлифованным краем другого предметного стекла (или покровного) прикасаются к капле крови. Как только кровь равномерно распределится по ребру этого стекла, им быстро проводят по поверхности стекла справа налево под углом 45°. Ширина мазка должна быть уже предметного стекла. Для каждого нового мазка берут свежую каплю крови. От каждого животного готовят по 2 мазка.

При исследовании большого количества подозрительных в заболевании животных, размещенных в помещении при беспривязном содержании, можно брать кровь с соблюдением правил асептики из яремной вены (V. Jugularis) одновременно в 2 пробирки для приготовления мазков и получения сыворотки.

Для приготовления мазков кровь берут в пробирки, содержащие трилон Б* (из расчета 0,1 куб. см 10% раствора трилона Б на 1 куб. см), в объеме 1,0 куб. см, в другие пробирки - для получения сыворотки. Пробирки закрывают резиновыми пробками.

Мазки крови готовят из трилоновой крови в лабораторных условиях в день ее взятия. Готовые мазки крови высушивают на воздухе; подсушивать их над пламенем или на солнце нельзя. В холодное время года мазки делают в теплом помещении или на стеклах, подогретых на крышке стерилизатора. Правильно приготовленные мазки должны быть тонкими, равномерными, достаточной длины и заканчиваться на 0,5-1,0 см от края стекла.

Кровь для получения сыворотки ставят в термостат (+37°С) или другое теплое место; после полной ретракции сгустка, его отделяют от стенок пробирки, обводя вокруг тонкой стерильной металлической спицей, и ставят в темное (прохладное) место для отстаивания сыворотки. Используют для исследования в РДСК сыворотку без следов гемолиза эритроцитов.

2.4. При взятии пунктата из лимфатических узлов животное надежно фиксируют, на месте пункции выстригают шерсть, кожу протирают ватным тампоном, смоченным в растворе спирта или настойки йода. Левой рукой оттягивают лимфатический узел и удерживают большим и указательным пальцами левой руки. Затем вглубь узла вводят стерильную иглу надевают на нее шприц и поршнем отсасывают лимфу. После шприц отсоединяют, иглу извлекают, а содержимое шприца выдавливают поршнем на предметное стекло, делают тонкие мазки и высушивают на воздухе.

2.5. На высушенных мазках из крови и пунктата острым предметом или простым карандашом пишут номер, вид животного и дату их приготовления.

2.6. Материал от павших или убитых животных отбирают до наступления трупного окоченения.

2.7. Мазки упаковывают в чистую непористую бумагу, складывая их попарно так, чтобы мазки располагались на противоположных (наружных) сторонах предметных стекол, патологический материал помещают во влагонепроницаемую тару; сыворотки крови сливают после полного отстоя в другие пробирки и плотно закрывают резиновыми пробками.

Упакованные материалы - мазки из крови и пунктатов или трилоновую кровь и сыворотки крови в пробирках, части органов доставляют в лабораторию в день отбора.

3. Микроскопическое исследование

3.1. Из доставленного для исследования патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта.

3.1.1. Мазки из головного мозга готовят путем заключения мелких кусочков между предметными стеклами. После растирания помещенного между ними материала стекла разъединяют в противоположные стороны в горизонтальном направлении, в результате чего получается два тонких мазка. Мазки высушивают на воздухе.

3.1.2. Из паренхиматозных органов готовят мазки-отпечатки. Для этого вырезанный острым скальпелем кусочек органа захватывают пинцетом и свободной поверхностью кусочка делают на стекле несколько тонких отпечатков. Мазки-отпечатки высушивают на воздухе.

3.2. Мазки фиксируют этиловым ректифицированным 95%-ным спиртом 20-25 мин или смесью этилового спирта и серного эфира в равных количествах - 15-20 минут. После высушивания мазки окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе (краску разводят дистиллированной водой рН 7,0-7,2 в соотношении 1:10) - 30-45 минут (в зависимости от качества краски и температуры помещения), промывают дистиллированной водой рН 7,0-7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа (х90). Качество окрашивания мазка определяют под микроскопом по окрашиванию лейкоцитов. Если лейкоциты бледно окрасились или не окрасились - исследовать препарат бесполезно, необходимо применить другую серию краски.

3.3. При микроскопии обнаруживают пироплазмы (бабезии) в эритроцитах, тейлерии и нутталлии (бабезии) экви - в эритроцитах и в клетках лимфоидной ткани в виде различной формы шизонтов. Цитоплазма пироплазмид окрашивается в голубовато-синеватый цвет, глыбки хроматина - в красно-фиолетовый или красный.

4. Дифференциальная диагностика возбудителей и оценка результатов

4.1. Пироплазмид дифференцируют между собой по их форме, углу соединения парных грушевидных форм, соотношению их размера к радиусу эритроцита, локализации в эритроците, а также от анаплазм и эперитрозоон. При определении пользуются следующей таблицей:

Возбудитель	Форма	Размер парных грушевидных форм по отношению к радиусу эритроцита	Угол соединения парных грушевидных форм	Локализация
1	2	3	4	5
Piroplasma (Babesia) caballi	Овальная, кольцевидная, круглая, амебовидная, грушевидная	Больше	Острый	В центре эритроцитов
Nuttallia (Babesia) equi	Овальная, кольцевидная, грушевидная, крестовидная	Меньше, равны	-	Чаще в центре эритроцитов, клетках лимфоидной ткани
Babesia (Francaiella) bovis	Кольцевидная, амебовидная, грушевидная	Равны	Тупой	В центре эритроцитов
Piroplasma (Babesia) bigeminum	Кольцевидная, овальная, амебовидная, грушевидная	Больше	Острый	В центре эритроцитов
Babesia divergens	Круглая, амебовидная, грушевидная	Меньше	Острый	По периферии эритроцитов
Piroplasma ovis (В. motasi)	Круглая, овальная, амебовидная, грушевидная	Больше	острый	В центре эритроцитов
Babesia ovis	Круглая, кольцевидная, грушевидная	Меньше	тупой	В центре эритроцитов
Piroplasma (Babesia) canis	Кольцевидная, овальная, амебовидная, грушевидная	Больше	острый	В центре эритроцитов
Theileria annulata	Круглая, запятовидная, овальная	Равны, меньше	-	В эритроцитах, клетках лимфоидной ткани
Theileria sergenti	Палочковидная, запятовидная, овальная, грушевидная	Равны, меньше	-	В эритроцитах, клетках лимфоидной ткани
Theileria ovis	Круглая, овальная, палочковидная, запятовидная	Меньше	-	В эритроцитах, клетках лимфоидной ткани
Anaplasma marginale	Круглая, в виде точки	-	-	Чаще по периферии, реже в центре эритроцитов
Anaplasma ovis	Круглая, в виде точки	-	-	Чаще по периферии, реже в центре эритроцитов
Eperythrozoon wenyoni	Круглая, овальная, палочковидная, гантелевидная, кольцевидная	-	-	На поверхности эритроцитов, тромбоцитов, в плазме крови
Eperythrozoon ovis	Круглая, овальная, палочковидная, гантелевидная, кольцевидная	-	-	На поверхности эритроцитов, тромбоцитов, в плазме крови

______________________________

* Трилон Б - динатриевая соль этилендиаминтетроуксусная кислота

Заместитель руководителя Департамента ветеринарии

Е.А. Непоклонов