Инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ" (организация-производитель - ООО "Ветбиохнм", г. Москва) (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору от 21 сентября 2009 г. N ПВР-1-3.8/02157)

Инструкция
по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ" (организация-производитель - ООО "Ветбиохим", г. Москва)
(утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору 21 сентября 2009 г. N ПВР-1-3.8/02157)

1. Общие сведения

1. Набор для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ".

2. В состав набора входят иммуноспецифические и химические компоненты:

1). Планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках вирусом ИРТ - 2 штуки;

2). Положительный контроль (), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, - 1 пробирка;

3). Отрицательный контроль (), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, - 1 пробирка;

4). Антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена - 100-кратный концентрат (Конъюгат), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, - 1 пробирка;

5). 20-кратный концентрат буферного раствора для промывки планшетов (ФСБТ), бесцветная прозрачная жидкость, - 4 флакона;

6). Сыворотка крови лошади, лиофилизированная (CЛ), гомогенная масса желтоватого цвета, - 1 флакон;

7). Субстратный раствор (СР), бесцветная прозрачная жидкость, - 1 флакон;

8). Стоп-раствор, бесцветная прозрачная жидкость, - 1 флакон.

3. Набор "ИРТ-СЕРОТЕСТ" предназначен для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита (ИРТ) в сыворотке крови крупного рогатого скота (КРС) методом иммуноферментного анализа (ИФА) и определения титра антител.

Набор рассчитан на проведение на одном планшете одновременного анализа 46 испытуемых проб сыворотки крови (в 2-х повторах) и двух контрольных проб (в 2-х повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.

4. Упаковка и маркировка

Компоненты набора расфасовывают в пластиковые (стеклянные), герметично укупоренные флаконы (пробирки) соответствующей вместимости.

Пластиковые флаконы (пробирки) укупоривают завинчивающимися или защелкивающимися пластиковыми крышками. Стеклянные флаконы укупоривают резиновыми пробками, укрепленными алюминиевыми или пластиковыми завинчивающимися колпачками.

На флаконы (пробирки) с каждым компонентом наклеивают этикетки с указанием: названия и/или товарного знака организации-производителя и разработчика, краткого названия набора, краткого названия компонента, его номера, количества в упаковке, номера серии, номера контроля, срока годности (месяц и год).

Полистироловые планшеты упаковывают в индивидуальные полиэтиленовые пакеты. На пакеты наклеивают этикетки с указанием: названия и/или товарного знака организации-производителя и разработчика, краткого названия набора, названия адсорбированного компонента, номера серии и контроля, срока годности.

Флаконы (пробирки) с компонентами набора и планшеты упаковывают в картонные или пластиковые коробки с наличием гнезд.

На каждую коробку с диагностическим набором наклеивают этикетку, в которой указывают: страну, город, название и/или товарный знак организации-производителя и разработчика, полное название набора, номер серии и номер контроля, дату изготовления (месяц и год), срок годности (месяц и год), условия хранения, регистрационный номер, знак соответствия в системе ГОСТ Р, обозначение нормативного документа, надпись "для животных". В каждую коробку вкладывают инструкцию по применению набора.

5. Срок годности компонентов набора - 12 месяцев от даты изготовления при условии хранения и транспортирования их в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С. Не допускается замораживание компонентов набора! Запрещается смешивать компоненты наборов разных серий, переливать в другую посуду и использовать набор по истечении срока годности.

Флаконы без этикеток, с нарушением целостности, изменением консистенции или цвета компонентов, при наличии плесени или других примесей и не использованные в течение срока годности подлежат выбраковке. Планшеты и контрольные сыворотки обеззараживают 3% раствором хлорамина. Остальные компоненты набора не требуют специальных мер утилизации.

Примечание. Для проведения ИФА используют: одно- и многоканальные микропипетки переменных объемов со сменными наконечниками, мерную лабораторную посуду, дистиллированную или деионизованную воду, суховоздушный термостат с температурой 37°С, спектрофотометр с вертикальным лучом света длиной волны 450 нм, липкую пленку.

II. Принцип метода

6. Метод основан на взаимодействии иммобилизованного в лунках вируса инфекционного ринотрахеита КРС (BHV1) со специфическими антителами из исследуемой пробы сыворотки и последующем выявлении полученного комплекса конъюгатом (меченными пероксидазой хрена специфическими антителами к IgG крупного рогатого скота). Связанная пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антител в определяемой пробе.

III. Порядок применения

7. Подготовка биологического материала

Для анализа используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Если анализ проводят в течение 24 ч после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре 4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре минус 20°С. Перед исследованием замороженные образцы в течение 5-10 мин нагревают в водяной бане при температуре 37°С.

В случае выпадения осадка в пробах сыворотки крови их обязательно осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 2000g.

Не рекомендуется исследование проросших и гемолизированных сывороток, а также многократное замораживание и оттаивание образцов сыворотки крови.

8. Подготовка рабочих растворов

8.1. Перед началом работы все реагенты выдерживают не менее 30 мин при комнатной температуре (20-25°С) и тщательно перемешивают. Оставшиеся после частичного использования компоненты должны храниться плотно закрытыми в упаковке производителя.

8.2. Работчий раствор буфера для отмывания планшетов (ФСБТ). Содержимое флакона N 5 разводят в 20 раз свежеприготовленной дистиллированной водой. (Пример: для получения 500 мл рабочего раствора к 25 мл концентрата добавляют 475 мл воды). Следует иметь в виду, что для обработки одного стрипа требуется примерно 30 мл рабочего раствора. Рабочий раствор стабилен при температуре 4°С в течение 3 сут. Для более длительного хранения раствор замораживают и хранят при температуре минус 20°С.

8.3. Буфер для разведения (БР) испытуемых сывороток и контрольных образцов представляет собой рабочий раствор ФСБТ, приготовленный по п. 8.2.

8.4. Буфер для разведения конъюгата (БРК) представляет собой рабочий раствор ФСБТ, содержащий 5% сыворотки крови лошади. БРК готовят в 2 этапа:

1). Во флакон N 6 (СЛ) добавляют 1 мл рабочего раствора ФСБТ и тщательно перемешивают содержимое до полного растворения.

2). Далее готовят необходимое количество БРК. (Пример: для приготовления 10 мл БРК необходимо к 9,5 мл рабочего раствора ФСБT добавить 0,5 мл раствора CЛ).

8.5. Рабочий раствор конъюгата. Концентрат конъюгата (флакон N 4) разводят в 100 раз БРК, подготовленного по п. 8.4. (Пример: для получения 10 мл рабочего раствора конъюгата к 9,9 мл БРК добавить 100 мкл концентрата конъюгата и тщательно перемешать).

8.6. Субстратный раствор (СР, флакон N 8) и стоп-раствор (флакон N 9) - готовы к применению.

9. Проведение анализа

9.1. Испытуемые и контрольные пробы сыворотки крови разводят в 100 раз буфером для разведения (БР, приготовленным по п. 8.3.). (Пример: для получения 300 мкл пробы сыворотки для анализа к 297 мкл БР добавить 3 мкл сыворотки и тщательно перемешать).

9.2. В лунки А1-В1 и C1-D1 вносят по 100 мкл разведенных в 100 раз контрольных проб (, ).

В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл испытуемых проб сыворотки крови (по две лунки на каждый образец).

Закрывают планшет липкой пленкой и инкубируют 45 мин при температуре 37°С.

9.3. Планшет 4 раза промывают рабочим раствором ФСБТ, подготовленным по п. 8.2., на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (300 мкл/лунку) и каждый раз полностью удаляя жидкость постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.

Внимание. При этой операции возможно выпадение стрипов из рамки! Рекомендуется до начала работы промаркировать стрипы для восстановления их первоначального расположения.

9.4. В каждую лунку вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата (см. п. 8.5.). Планшет закрывают липкой пленкой и инкубируют 45 мин при температуре 37°С.

9.5. Планшет 5 раз промывают рабочим раствором ФСБТ (см. этап 9.3).

9.6. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора. Планшет инкубируют 15 мин при комнатной температуре в темноте.

9.7. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку по 100 мкл стоп-раствора.

9.8. После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм ().

10. Учет и интерпретация результатов

10.1. На первом этапе проводят оценку отрицательного и положительного контролей, входящих в состав набора. Результаты реакции считаются достоверными и могут быть учтены, если контрольные показатели соответствуют следующим критериям:

Если полученные значения не соответствуют вышеуказанным критериям, результаты ИФА считаются недостоверными и реакцию повторяют. Если отрицательного и положительного контролей соответствуют вышеуказанным критериям, далее проводят оценку результатов реакции в лунках с испытуемыми образцами.

Вычисляют среднее значение для каждой опытной пробы ().

Пробу считают отрицательной, если:

Пробу считают положительной, если:

Если: < < , то проба считается сомнительной и животное рекомендуется исследовать повторно.

10.2. Для определения титра антител в исследуемых образцах, на первом этапе высчитывают коэффициент связывания антигена сывороточными антителами по формуле:

Интерпретацию результатов проводят с использованием прилагаемой таблицы:

Значение Ксв	Титр антител
< 15%	Проба отрицательная
16% - 25%	1/100 проба сомнительная
26% - 40%	1/200 проба положительная
41% - 60%	1/400 -//-
61% - 90%	1/800 -//-
91% - 100%	1/1600 -//-
> 100%	-//-

IV. Меры личной профилактики

11. Работу с компонентами набора следует проводить с соблюдением правил техники безопасности. При попадании их на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промыть это место большим количеством водопроводной воды

12. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора.

13. Набор следует хранить в местах, недоступных для детей.

Инструкция разработана ООО "Ветбиохим" совместно с фирмой INGENASA (Испания). Организация-производитель - ООО "Ветбиохим". Адрес производства: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С утверждением настоящей инструкции утрачивает силу инструкция по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ-СЕРОТЕСТ", утвержденная Россельхознадзором 26.06.2008 г.

Рекомендовано к регистрации в Российской Федерации ФГУ ВГНКИ

Заместитель Руководителя Россельхознадзора

Н.А. Власов