Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 14718-2017 "Корма, комбикорма. Определение содержания афлатоксина В1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2017 г. N 1718-ст)

Feeds, compound feeds. Determination of aflatoxin В₁ by high-performance liquid chromatography method

МКС 65.120
IDT

Дата введения - 1 января 2019 г.
Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по международной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АО "ВНИИКП") на основе официального перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5, который выполнен Акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АО "ВНИИКП")

2 Внесен Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 сентября 2017 г. N 103-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2017 г. N 1718-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 14718-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 14718:1998 "Корма для животных. Определение содержания афлатоксина В₁. Метод с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B₁ content of mixed feeding stuffs - Method using high-performance liquid chromatography", IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 10 "Корма для животных" технического комитета по стандартизации ТС 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6) для увязки с наименованиями, принятыми в существующем комплексе межгосударственных стандартов.

В настоящем стандарте заменены единицы измерения объема: "литр" на "дециметр кубический", "миллилитр" на "сантиметр кубический", "микролитр" на "миллиметр кубический" - для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (пункт 4.14.1).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного международного стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма и комбикорма и устанавливает метод определения содержания афлатоксина В₁ высокоэффективной жидкостной хроматографией (далее - ВЭЖХ).

Нижний предел определения содержания афлатоксина В₁ составляет 1 мкг/кг.

Примечания

1 Настоящий стандарт может применяться для определения содержания афлатоксина В₁ в комбикормовом сырье и таких кормах, как кукурузный глютен, арахис, пальмовое ядро, копра, мякоть цитрусовых, тапиока, соя, рисовые отруби, ветки, семена рапса, нугаи и хлопчатника (см. [1] и [2]). Однако для этих продуктов не проводились межлабораторные испытания данным методом.

2 Настоящий стандарт также может применяться для определения содержания суммы афлатоксинов В₁, В₂, G₁ и G₂. Однако для этого показателя не проводились межлабораторные испытания метода.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на межгосударственные стандарты, которые являются обязательными. Для датированных ссылок применяют только указанное издание. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного документа (включая все его изменения).

ISO 6498:1998, Animal feeding stuffs - Preparation of test sample (Корма для животных. Подготовка проб)*(1).

3 Сущность метода

Анализируемую пробу экстрагируют хлороформом. Экстракт фильтруют и аликвоту очищают на картриджах Florisil*(2) и С₁₈. Окончательное разделение и определение афлатоксина В₁ достигается с использованием ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке С₁₈ с последующей постколоночной дериватизацией йодом или бромом и флуоресцентным детектированием.

------------------------------

*(1) Стандарт заменен на ISO 6498:2012, однако для однозначного соблюдения требования настоящего стандарта, выраженного в датированной ссылке, рекомендуется использовать только указанное в этой ссылке издание.

*(2) Картридж Florisil типа Sep-Pak номер артикула 51960 и С₁₈ типа Sep-Pak номер артикула 51910, от Waters Associates (Милуоки, США). Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является обязательной.

4 Реактивы

При анализе используют реактивы только признанной аналитической чистоты.

4.1 Вода, деминерализованная или деионизированная с удельным сопротивлением не менее 10 или вода эквивалентной чистоты.

4.2 Кислота серная концентрированная, c(H₂SO₄) = 18 моль/дм³, (H₂SO₄) = 1,84 г/см³.

4.3 Кислота серная, c(H₂SO₄) = 2 моль/дм³.

Осторожно добавляют 105 см³ концентрированной серной кислоты (см. 4.2) к 895 см³ воды и хорошо перемешивают. Избегают чрезмерного нагревания раствора.

4.4 Контрольная проба.

Готовят контрольную пробу массой около 2 кг, содержащую приблизительно 5 мкг/кг афлатоксина В₁, путем объединения нескольких предварительно проанализированных проб с содержанием афлатоксина В₁ около 5 мкг/кг. Тщательно перемешивают.

Для контрольной пробы проводят пять испытаний по два параллельных определения содержания афлатоксина В₁ в соответствии с разделом 8. Из полученных результатов вычисляют среднеарифметическое значение содержание афлатоксина В₁, стандартное отклонение и коэффициент вариации.

4.5 Целит 545, промытый кислотой, или продукт эквивалентного качества*(3).

4.6 Картридж Florisil, типа Sep-Pak, Waters No. 51960 или продукт эквивалентного качества*(4).

4.7 Картридж С₁₈, типа Sep-Pak, Waters No. 51910 или продукт эквивалентного качества*(4).

------------------------------

*(3) Продукт торговой марки Целит. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является обязательной. Могут быть использованы аналогичные картриджи, если они приводят к тем же результатам.

*(4) Картридж Florisil типа Sep-Pak номер артикула 51960 и С₁₈ типа Sep-Pak номер артикула 51910, от Waters Associates (Милуоки, США). Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является обязательной.

4.8 Ацетон.

4.9 Метанол.

4.10 Ацетонитрил.

4.11 Хлороформ, стабилизированный этанолом (массовая доля от 0,5 % до 1,0 %).

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Хлороформ является токсичным веществом. Необходимо избегать вдыхания и воздействия хлороформа. Все работы с ним и его растворами проводят в вытяжном шкафу.

Если используют другие стабилизаторы, то адсорбционные характеристики картриджа Florisil (см. 4.6) могут измениться. В этом случае адсорбционные характеристики картриджа проверяют в соответствии с разделом 8.

4.12 Смесь ацетона с водой, в соотношении 98:2 по объему

Смешивают 980 см³ ацетона (см. 4.8) и 20 см³ воды (см. 4.1). Тщательно перемешивают.

4.13 Смесь ацетона с водой, в соотношении 15:85 по объему

Смешивают 150 см³ ацетона (см. 4.8) и 850 см³ воды (см. 4.1). Тщательно перемешивают.

4.14 Смесь ацетона с водой, в соотношении 5:95 по объему

Смешивают 50 см³ ацетона (см. 4.8) и 950 см³ воды (см. 4.1). Тщательно перемешивают.

4.15 Смесь метанола с водой, в соотношении 20:80 по объему

Смешивают 200 см³ метанола (см. 4.9) и 800 см³ воды (см. 4.1). Тщательно перемешивают.

4.16 Кислота азотная концентрированная, c(HNO₃) = 14 моль/дм³, (HNO₃) = 1,40 г/см³, для ВЭЖХ с дериватизацией бромом.

4.17 Калия бромид (КВr), для ВЭЖХ с дериватизацией бромом.

4.18 Подвижная фаза для ВЭЖХ

4.18.1 Подвижная фаза для ВЭЖХ с дериватизацией йодом

Смешивают 120 см³ ацетонитрила (см. 4.10), 210 см³ метанола (см. 4.9) и 390 см³ воды (см. 4.1) и перемешивают. Фильтруют раствор через мембранный фильтр из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с размером пор 0,45 мкм, используя систему фильтрации растворителя (см. 5.1), перед использованием дегазируют в течение 10 мин в ультразвуковой бане (см. 5.2).

Примечание - Допускается изменять состав подвижной фазы растворителя в зависимости от характеристик используемой колонки ВЭЖХ.

4.18.2 Подвижная фаза для ВЭЖХ с дериватизацией бромом

Смешивают 400 см³ ацетонитрила (см. 4.10), 700 см³ метанола (см. 4.9) и 1300 см³ воды (см. 4.1) и перемешивают. Добавляют в эту смесь 286 мг бромида калия (см. 4.17) и 152 мм³ концентрированной азотной кислоты (см. 4.16). Тщательно перемешивают и дегазируют потоком инертного газа в течение 15 мин.

4.19 Насыщенный раствор йода для ВЭЖХ с дериватизацией йодом

Добавляют 2 г йода в 400 см³ воды. Перемешивают не менее 90 мин и фильтруют через мембранный фильтр из ПТФЭ с размером пор 0,45 мкм (см. 5.1). Раствор готовят в день использования.

Насыщенный раствор защищают от света для предотвращения фотодеградации.

4.20 Раствор натрия гипохлорита (для бытового использования), (активного хлора) = 100 г/дм³.

4.21 Раствор натрия гипохлорита, объемной долей 1 %

Смешивают 10 см³ раствора гипохлорита натрия (см. 4.20) и 990 см³ смеси воды с ацетоном (см. 4.14).

4.22 Инертный газ, например азот.

4.23 Афлатоксин В₁ образец сравнения (С₁₇Н₁₂O₆), 2,3,6а,9а-тетрагидро-4-метоксициклопента[с]фуро[3, 2: 4,5]фуро [2,3-h] [1] бензопиран-1,11-дион; Chemical Abstracts Service Registry (CAS) номер 1162-65-8.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ

1 Микотоксины являются чрезвычайно токсичными веществами. Все манипуляции с ними необходимо выполнять в вытяжном шкафу. Следует принимать особые меры предосторожности при использовании микотоксинов в сухой форме из-за их электростатической природы и тенденции к диспергированию в рабочих зонах.

2 Афлатоксины чувствительны к УФ-излучению. Поэтому все процедуры следует проводить при отсутствии солнечного или искусственного белого света. Достаточное, но не чрезмерное, освещение обеспечивают лампами накаливания. Допускается использование энергосберегающих и люминесцентных ламп, но при этом следует использовать посуду из темного стекла (виалы, мерные колбы).

3 Стеклянную посуду, используемую в работе с растворами афлатоксина В₁, перед мытьем следует залить на ночь раствором гипохлорита натрия (см. 4.21) для удаления, следов афлатоксина B₁.

4.24 Стандартный раствор афлатоксина B₁, (афлатоксина В₁) = 10 мкг/см³

Содержимое ампулы с афлатоксином В₁ (см. 4.23) переносят в колбу и растворяют в хлороформе (см. 4.11).

В мерную колбу необходимого объема переносят раствор афлатоксина В₁ и разбавляют до метки хлороформом так, чтобы получить раствор массовой концентрации афлатоксина В₁ около 10 мкг/см³ и перемешивают.

Раствор помещают в виалу или герметичную емкость из темного стекла, плотно закрывают крышкой, заворачивают в алюминиевую фольгу и хранят в темноте при температуре 4 °С.

4.25 Основной раствор афлатоксина В₁

В мерную колбу вместимостью 50 см³ количественно переносят 2,5 см³ стандартного раствора афлатоксина В₁ (см. 4.24) и разбавляют до метки хлороформом (см. 4.11).

Раствор помещают в виалу или герметичную емкость из темного стекла плотно закрывают крышкой, заворачивают в алюминиевую фольгу и хранят в темноте при температуре 4 °С.

4.26 Градуировочные растворы афлатоксина В₁

4.26.1 Градуировочный раствор I, (афлатоксина В₁)  4 нг/см³

Перед использованием виалу с основным раствором афлатоксина В₁ (см. 4.25) в алюминиевой фольге выдерживают несколько часов до достижения комнатной температуры.

В отмытую кислотой мерную колбу вместимостью 50 см³ переносят 400 мм³ основного раствора афлатоксина В₁ (что эквивалентно примерно 200 нг афлатоксина В₁) и упаривают раствор досуха в токе инертного газа (см. 4.22). Остаток растворяют в 20 см³ смеси воды и ацетона (см. 4.13). Разбавляют до метки смесью воды с ацетоном и тщательно перемешивают.

4.26.2 Градуировочный раствор II, (афлатоксина В₁)  3 нг/см³

В отмытую кислотой мерную колбу вместимостью 10 см³ количественно переносят 7,5 см³ градуировочного раствора I (см. 4.26.1). Разбавляют до метки смесью воды с ацетоном (см. 4.13) и тщательно перемешивают.

4.26.3 Референтный градуировочный раствор, (афлатоксина В₁)  2 нг/см³

В отмытую кислотой мерную колбу вместимостью 50 см³ количественно переносят 25 см³ градуировочного раствора I (см. 4.26.1). Разбавляют до метки смесью воды с ацетоном (см. 4.13) и тщательно перемешивают.

Этот раствор используется для контрольных вводов во время проведения хроматографического анализа (8.5).

4.26.4 Градуировочный раствор III, (афлатоксина В₁)  1 нг/см³

В отмытую кислотой мерную колбу вместимостью 10 см³ количественно переносят 2,5 см³ градуировочного раствора I (см. 4.26.1). Разбавляют до метки смесью воды с ацетоном (см. 4.13) и тщательно перемешивают.

4.27 Хроматографический тестовый раствор

Вскрывают ампулу, содержащую приблизительно 1,0; 0,5; 1,0 и 0,5 мкг/см³ афлатоксинов В₁, В₂, G₁, G₂ соответственно в 1 см³ хлороформа.

Содержимое ампулы переносят в пробирку с притертой пробкой или виалу с завинчивающейся крышкой. В отмытую кислотой пробирку с притертой пробкой (см. 5.4) переносят 40 мм³ этого раствора. Хлороформ выпаривают в потоке инертного газа (см. 4.22) и остаток растворяют в 10 см³ смеси воды с ацетоном (см. 4.13).

5 Оборудование

Всю стеклянную лабораторную посуду, которая вступает в контакт с водными растворами афлатоксинов, перед использованием следует выдержать в растворе серной кислоты (см. 4.3) в течение нескольких часов, а затем тщательно ополоснуть (например, три раза) водой для удаления всех следов кислоты. Полноту удаления кислоты проверяют с помощью индикаторной бумаги.

Эта процедура необходима для круглодонной колбы роторного испарителя (см. 5.12), мерных колб, мерных цилиндров, виал или пробирок, используемых для приготовления и хранения градуировочных растворов, полученных экстрактов (в частности, виал автосемплера) и пипеток Пастера, которые используются для переноса градуировочных растворов или экстрактов.

Примечание - Указанная обработка посуды необходима, так как использование не промытой кислотой стеклянной посуды может привести к потерям афлатоксина B₁. Особое внимание следует обратить на новую стеклянную посуду и стеклянную посуду одноразового использования, например, виалы автосемплера и пипетки Пастера.

Используют следующее лабораторное оборудование:

5.1 Система фильтрации растворителя, с ПТФЭ мембранными фильтрами с размером пор 0,45 мкм.

5.2 Ультразвуковая баня.

5.3 Микрошприц, вместимостью 100 мм³, для приготовления градуировочных растворов.

Погрешность не должна превышать  2 % по массе, что проверяют взвешиванием.

5.4 Градуированные пробирки вместимостью 10 см³.

5.5 Спектрофотометр, предназначенный для измерений оптической плотности в УФ-области спектра, в комплекте с кварцевыми кюветами длиной оптического пути (10  0,1) мм.

5.6 Коническая колба вместимостью 500 см³, изготовленная из боросиликатного стекла, с широким горлом и притертой пробкой или завинчивающейся крышкой, снабженной ПТФЭ прокладкой.

5.7 Механический шейкер, горизонтально вращающийся или с возвратно-поступательным движением, с частотой от 250 до 300 мин^-1.

5.8 Складчатый бумажный фильтр диаметром 24 см.

5.9 Трехходовой запорный кран с разъемом типа Luer, устойчивый к хлороформу*(5).

5.10 Химически стойкий шприц вместимостью 10 см³, с разъемом типа Luer*(6).

5.11 Стеклянная колонка с внутренним диаметром от 10 до 15 мм, длиной от 30 до 50 см, снабженная наконечником для разъема типа Luer*(6).

------------------------------

*(5) Оборудование торговой марки Luer. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является обязательной. Может быть использовано аналогичное оборудование, если оно приводит к тем же результатам.

*(6) Оборудование торговой марки Luer. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является обязательной. Может быть использовано аналогичное оборудование, если оно приводит к тем же результатам.

Примечание - Если используется стеклянная колонка с внутренним диаметром около 10 мм и длиной около 30 см, то рекомендуется использовать пластмассовый резервуар (химически стойкий цилиндр шприца), вместимостью не менее 70 см³.

5.12 Роторный вакуумный испаритель, снабженный круглодонной колбой вместимостью от 150 до 250 см³.

5.13 Общая часть системы для ВЭЖХ

На рисунках 1 и 2 схематически представлены системы ВЭЖХ для дериватизации йодом и бромом соответственно.

5.13.1 Беспульсационный насос, способный поддерживать объемную скорость от 0,1 до 1,0 см³/мин.

5.13.2 Инжектор, обеспечивающий объем ввода 250 мм³.

5.13.3 Флуоресцентный детектор, с возбуждением при длине волны 365 нм и регистрацией излучения на длине волны 435 нм (для фильтровых детекторов - светофильтр с пропусканием при длинах волн более 400 нм), обеспечивающий обнаружение не менее 0,05 нг афлатоксина B₁. Допускается применение обратного давления (например, путем применения запорного устройства или спирали из нержавеющей стали или ПТФЭ, подключенных к выходу детектора) для подавления пузырьков воздуха в проточной кювете.

5.13.4 Регистрирующее устройство.

5.13.5 Предколонка: наполнитель С₁₈ с размером частиц от 37 до 50 мкм, длина от 10 до 20 мм, внутренний диаметр 3,9 мм; или аналогичного качества.

1 - подвижная фаза; 2 - насос высокого давления; 3 - инжектор; 4 - предколонка; 5 - аналитическая колонка; 6 - насыщенный раствор йода; 7 - насос для подачи реагента; 8 - смеситель-тройник; 9 - водяная баня (60 °С); 10 - реакционная спираль; 11 - флуоресцентный детектор; 12 - запорное устройство; 13 - сосуд для сбора сливов; 14 - самописец или интегратор

Рисунок 1 - Схема системы ВЭЖХ для дериватизации йодом

5.13.6 Аналитическая колонка: наполнитель С₁₈ с размером частиц от 3 или 5 мкм, длина 200 мм, внутренний диаметр 3,0 мм; или аналитическая колонка аналогичного качества.

5.13.7 Электронный интегратор (не обязательно).

1 - подвижная фаза; 2 - насос высокого давления; 3 - инжектор; 4 - предколонка; 5 - аналитическая колонка; 11 - флуоресцентный детектор; 12 - запорное устройство; 13 - сосуд для сбора сливов; 14 - самописец или интегратор; 15 - дериватизационная ячейка (KOBRA); 16 - вольтметр; 17 - блок питания постоянного тока 10 В; 18 - резистор, 100 кОм

Рисунок 2 - Схема системы ВЭЖХ для дериватизации бромом

5.14 Система ВЭЖХ при использовании постколоночной дериватизации йодом

5.14.1 Беспульсационный насос для подачи йодного реагента после колонки.

5.14.2 Тройник с нулевым мертвым объемом из нержавеющей стали, 1,59 х 0,75 мм.

5.14.3 Реакционная спираль, выполненная из ПТФЭ или нержавеющей стали.

Установлено, что для аналитических колонок с размерами частиц 5 или 3 мкм подходят спирали с размерами от 3000 x 0,5 мм до 5000 х 0,5 мм.

5.14.4 Термостатируемая водяная баня или термостат, поддерживающие температуру до 60 °С, способные регулировать температуру с точностью до  0,1 °С.

5.15 Система ВЭЖХ при использовании постколоночной дериватизации бромом

5.15.1 Система электрохимической дериватизации бромом (KOBRA*(7)).

------------------------------

*(7) Устройство торговой марки KOBRA. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является обязательной. Могут быть использованы аналогичные устройства, если они приводят к тем же результатам.

5.15.2 Блок питания, напряжение постоянного тока от 0 до 20 В.

5.15.3 Вольтметр с диапазоном измерения от 0 до 10 В постоянного тока, имеющий сопротивление более 50 кОм.

5.15.4 Резистор, 100 кОм.

5.16 Шприц для ВЭЖХ, с объемом ввода 250 мм³.

6 Отбор проб

Отбор проб для испытаний не является составной частью метода, описываемого в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в [7].

Поступающая в лабораторию проба должна быть представительной, не поврежденной и не загрязненной во время транспортирования и хранения.

7 Подготовка пробы для испытаний

Пробу для испытания готовят в соответствии с ISO 6498.

Лабораторную пробу (500 г) измельчают так, чтобы она полностью проходила через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Тщательно перемешивают.

8 Проведение испытания

8.1 Общие положения

С каждой серией проб проводят анализ холостой пробы, в которую внесена добавка афлатоксина В₁, равная 10 мкг/кг, или контрольной пробы (см. 4.4). Постоянно включают холостую пробу в каждую серию проб для проверки загрязнения стеклянной посуды.

Результаты должны соответствовать критериям, указанным в разделе 10.

8.2 Регистрация спектра поглощения стандартного раствора афлатоксина В₁

Спектр поглощения стандартного раствора афлатоксина В₁ (см. 4.24) регистрируют в диапазоне длин волн от 330 до 370 нм с помощью спектрофотометра (см. 5.5) с использованием хлороформа в качестве раствора сравнения. Регистрируют оптическую плотность (А) в максимуме поглощения около 363 нм.

8.3 Экстракция

В коническую колбу (см. 5.6) взвешивают (50,0  0,1) г подготовленной анализируемой пробы (см. раздел 7). Последовательно добавляют 25 г целита (см. 4.5), 250 см³ хлороформа (см. 4.11) и 25 см³ воды. Закрывают колбу, перемешивают и стравливают давление. Снова закрывают колбу и встряхивают ее в течение 30 мин на механическом шейкере (см. 5.7).

Примечание - Чтобы уменьшить расход хлороформа, допускается использовать половину указанного количества; т.е. 25,0 г подготовленной анализируемой пробы (см. раздел 7), 12,5 г целита (см. 4.5); 125 см³ хлороформа (см. 4.11) и 12,5 см³ воды.

Смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр (см. 5.8). Если фильтрация осуществляется медленно, воронку накрывают, чтобы предотвратить испарение хлороформа. Собирают 50 см³ фильтрата (V_s).

В случае необходимости отбирают аликвоту фильтрата и разбавляют до 50 см³ (V_f) хлороформом так, чтобы массовая концентрация афлатоксина В₁ не превышала 4 нг/см³.

Полученный фильтрат очищают в соответствии с 8.4.

8.4 Очистка

Процедуру очистки проводят без длительных перерывов.

8.4.1 Очистка на картридже Florisil

8.4.1.1 Подготовка узла колоночного картриджа

К более короткому концу картриджа Florisil (см. 4.6) присоединяют запорный кран (см. 5.9). Промывают картридж и удаляют воздух, взяв 10 см³ хлороформа (см. 4.11) и быстро пропуская 8 см³ через запорный кран и картридж с помощью шприца (см. 5.10).

Длинный конец картриджа присоединяют к стеклянной колонке (см. 5.11) и пропускают оставшиеся 2 см³ хлороформа через картридж в колонку. Закрывают запорный кран и удаляют шприц.

8.4.1.2 Очистка

На собранный колоночный картридж наносят фильтрат (V_s или V_f), полученный по 8.3, и пропускают под действием силы тяжести. Промывают 5 см³ хлороформа (см. 4.11), а затем 20 см³ метанола (см. 4.9). Элюаты отбрасывают.

Не допускается высыхание собранного колоночного картриджа.

Афлатоксин В₁ элюируют с помощью 50 см³ смеси воды и ацетона (см. 4.12) и собирают элюат в круглодонную колбу роторного испарителя (см. 5.12).

Примечание - Качество картриджа Florisil изменяется в зависимости от партии, поэтому 50 см³ смеси воды и ацетона (см. 4.12) может быть недостаточным для элюирования. В этом случае рекомендуется использовать от 60 до 70 см³ смеси воды и ацетона (см. 4.12).

Элюат концентрируют на роторном испарителе при температуре от 40 °С до 50 °С до удаления ацетона.

Примечание - К этому моменту в колбе остается около 0,5 см³ жидкости. Остатки ацетона могут привести к потерям афлатоксина В₁ на картридже С₁₈. Эксперименты показали, что когда остается 0,5 см³ жидкости, количество ацетона незначительно и дальнейшее испарение нецелесообразно.

Добавляют 1 см³ метанола (см. 4.9), вращая колбу для растворения афлатоксина В₁, осевшего на стенках колбы, добавляют 4 см₃ воды и перемешивают. Картридж отсоединяют и утилизируют. Промывают стеклянную колонку водой и оставляют для стадии очистки на картридже С₁₈ (см. 8.4.2).

8.4.2 Очистка на картридже С₁₈

8.4.2.1 Подготовка собранного колоночного картриджа

К более короткому концу картриджа С₁₈ (см. 4.7) присоединяют запорный кран (см. 5.9). Промывают картридж и удаляют воздух путем быстрого пропускания 10 см³ метанола (см. 4.9) через запорный кран и картридж с помощью шприца (см. 5.10). Воздушные пузырьки в картридже видны как светлые пятна на сероватом фоне. Отбирают 10 см³ воды и пропускают 8 см³ через картридж. Следует избегать попадания воздуха в картридж при замене метанола на воду.

Длинный конец картриджа присоединяют к стеклянной колонке (см. 5.11) и пропускают оставшиеся 2 см³ воды через картридж в колонку. Закрывают запорный кран. Удаляют шприц.

8.4.2.2 Очистка

Полученный в 8.4.1.2 экстракт количественно переносят в стеклянную колонку (см. 5.11), промывая колбу дважды 5 см³ смеси воды с метанолом (см. 4.15), и пропускают под действием силы тяжести.

В ходе этих операций необходимо контролировать, чтобы колонка с картриджем не высохли. Если в картридже появляются воздушные пузырьки, то поток останавливают, слегка постукивают по верхней части стеклянной колонки для удаления пузырьков воздуха, затем продолжают очистку.

Элюируют 25 см³ смеси воды с метанолом (см. 4.15). Элюат отбрасывают. Афлатоксин В₁ элюируют 25 см³ смеси воды с ацетоном (см. 4.13) и собирают элюат в мерную колбу вместимостью 50 см³. Объем раствора в колбе доводят до метки водой и перемешивают. Полученный раствор используют для хроматографии (см. 8.5).

Примечание - Фильтрование конечного экстракта перед хроматографическим анализом не является обязательным. Если оно признано необходимым, то не следует использовать фильтры из целлюлозы, поскольку они могут приводить к потерям афлатоксина В₁. Рекомендуется использовать фильтры из ПТФЭ.

8.5 Проведение хроматографического анализа

8.5.1 Общие рекомендации

Объемные скорости, приведенные для подвижной фазы и постколоночного реагента, являются лишь ориентировочными. Они должны быть скорректированы в зависимости от характеристик аналитической колонки.

Отклик детектора для афлатоксина В₁ зависит от температуры, поэтому необходимо корректировать дрейф.

Регулярно вводят (например, каждый третий ввод) фиксированное количество референтного градуировочного раствора (см. 4.26.3). Характеристики пика афлатоксина В₁ корректируют с помощью среднеарифметического значения результатов для референтного градуировочного раствора при условии, что разница между результатами последовательных измерений референтного градуировочного раствора очень мала (менее 10 %). Поэтому рекомендуется вводить растворы без перерывов. Если перерыв необходим, то последний ввод до него и первый ввод после него должны быть вводами референтного градуировочного раствора (см. 4.26.3).

Поскольку градуировочная зависимость линейна и проходит через начало координат, то массу афлатоксина В₁ в анализируемом экстракте определяют на основе ближайших результатов для референтного градуировочного раствора.

8.5.2 Параметры насоса высокого давления

Насос (см. 5.13.1) регулируют таким образом, чтобы получить объемную скорость подвижной фазы (см. 4.18) 0,5 или 0,3 см³/мин для аналитической колонки с размером частиц 5 или 3 мкм (см. 5.13.6) соответственно.

Если используется дериватизация йодом, продолжают процедуру по 8.5.3.

Если используется дериватизация бромом, продолжают процедуру по 8.5.4.

8.5.3 Параметры насоса для подачи реактива при дериватизации йодом

Регулируют насос (см. 5.14.1) таким образом, чтобы получить объемную скорость насыщенного раствора йода (см. 4.19) в интервале от 0,2 до 0,4 см³/мин. В качестве приблизительного ориентира рекомендуется значение объемной скорости около 0,4 или 0,2 см³/мин в сочетании со значениями объемной скорости подвижной фазы (см. 4.18) 0,5 и 0,3 см³/мин соответственно.

8.5.4 Флуоресцентный детектор

Флуоресцентный детектор (см. 5.13.3) настраивают на длину волны возбуждения 365 нм и длину волны регистрации излучения 435 нм (с фильтром - более 400 нм). Аттенюатор (ослабитель) детектора устанавливают таким образом, чтобы отклик от 1 нг афлатоксина В₁ составлял приблизительно 80 % от полной шкалы регистрирующего устройства.

8.5.5 Инжектор

Для всех растворов вводят объем, равный 250 мм³, в соответствии с инструкцией изготовителя инжектора.

8.5.6 Проверка хроматографического разделения

Вводят хроматографический тестовый раствор (см. 4.27). Долины между соседними пиками должны составлять менее 5 % суммы их высот.

8.5.7 Проверка стабильности системы

Перед каждой серией исследований вводят референтный градуировочный раствор (см. 4.26.3) до тех пор, пока не будут достигнуты стабильные высоты пика. Характеристики пиков афлатоксина В₁ для последовательных вводов этого раствора не должны отличаться больше чем на 6 %. Затем сразу же переходят к проверке линейности (см. 8.5.8).

8.5.8 Проверка линейности

Вводят градуировочные растворы афлатоксина В₁ (см. 4.26.1-4.26.4). При каждом третьем вводе используют референтный градуировочный раствор (см. 4.26.3) для коррекции дрейфа отклика. Характеристики пика для вводов референтного градуировочного раствора не должны отличаться больше чем на 10 % за 90 мин. Дрейф корректируют в соответствии с формулой, приведенной в 9.3.

Градуировочный график должен быть линейным и проходить через начало координат в пределах удвоенного стандартного отклонения оценки отклика. Найденные значения не должны отличаться более чем на 3 % от номинальных значений.

Если эти требования выполнены, то испытания продолжают. В противном случае, выявляют и устраняют источники несоответствий.

8.5.9 Ввод экстрактов проб

Последовательно вводят референтный градуировочный раствор (см. 4.26.3), экстракт холостой пробы, экстракт холостой пробы с добавкой афлатоксина В₁ референтный градуировочный раствор (см. 4.26.3), экстракт стандартного образца или контрольной пробы (см. 4.4) и снова референтный градуировочный раствор (см. 4.26.3).

Вводят очищенный по 8.4.2.2 анализируемый экстракт. После каждых двух экстрактов проб повторяют ввод референтного градуировочного раствора (см. 4.26.3). Если серия содержит более 10 проб, то последними вводами должны быть градуировочные растворы афлатоксина В₁ (см. 4.26.1-4.26.4).

9 Вычисление результатов

9.1 Вычисление массовой концентрации афлатоксина В₁ в стандартном растворе афлатоксина В₁

Содержание афлатоксина В₁ в стандартном растворе афлатоксина В₁ (см. 4.24) , мг/см³, вычисляют по формуле

,

(1)

где М - молярная масса афлатоксина B₁, г/моль (М = 312 г/моль);

А - оптическая плотность, измеренная относительно раствора сравнения (см. 8.2);

d - длина оптического пути в кювете, см (d = 1 см);

k - молярный коэффициент поглощения афлатоксина В₁ в хлороформе при длине волны 363 нм, (k = 22300 ).

9.2 Вычисление массы афлатоксина В₁ во введенном референтном градуировочном растворе

Массу афлатоксина В₁ во введенном референтном градуировочном растворе (см. 4.26.3) m_c, нг, вычисляют по формуле

,

(2)

где f - коэффициент, учитывающий разбавление и согласование единиц массы, нг/мг (f = 200 нг/мг);

- массовая концентрация афлатоксина В₁ в стандартном растворе афлатоксина В₁ (см. 4.24), вычисленная по формуле (1), мг/см³;

- объем введенного референтного градуировочного раствора (см. 4.26.3), см³ (V_ic = 0,25 см³).

9.3 Вычисление массы афлатоксина В₁ в анализируемом экстракте

Массу афлатоксина В₁ в анализируемом экстракте m_а, нг, вычисляют по формуле

,

(3)

где - площадь пика, соответствующего афлатоксину В₁, в анализируемом экстракте, в единицы площади;

- масса афлатоксина В₁ во введенном референтном градуировочном растворе (см. 4.26.3), рассчитанная по 9.2, нг;

- площадь пика, соответствующего афлатоксину В₁, для предыдущего ввода референтного градуировочного раствора (см. 4.26.3), единицы площади;

- площадь пика, соответствующего афлатоксину В₁, для последующего ввода референтного градуировочного раствора (см. 4.26.3), единицы площади.

Примечание - В вычислениях вместо площади пика допускается использовать высоты пика (в единицах длины).

9.4 Вычисление содержания афлатоксина В₁ в пробе

Содержание афлатоксина В₁ в пробе w_a, мкг/кг, вычисляют по формуле

,

(4)

где - масса афлатоксина В₁ в анализируемом экстракте, вычисленная по формуле (3), нг;

- объем неразбавленного экстракта пробы, полученного в 8.3, используемого в последующей процедуре, см³; (V_s = 50 см³, если не нужно разбавлять фильтрат, полученный по 8.3);

- масса анализируемой пробы, г (m_s = 50,0 г);

- объем введенного анализируемого экстракта, см³ (V_is = 0,25 см³);

- объем фильтрата, использованного для очистки (см. 8.4), см³, (V_f = 50 см³);

- объем хлороформа, использованного для экстракции образца (см. 8.3), см³, (V_c = 250 см³).

Если m_s = 50,0 г, V_s = 50 см³, V_is = 0,25 см³, V_f = 50 см³ и V_c = 250 см³, то формула приобретает следующий вид:

.

(5)

10 Точность

10.1 Систематическая погрешность

Метод верифицируют путем повторных испытаний сертифицированных стандартных образцов или контрольных проб. Если они недоступны, то метод верифицируют с помощью экспериментов по оценке выхода, проведенных на холостых пробах с добавками афлатоксина B₁. Отклонение среднего значения от фактического значения, выраженное в процентах, должно находиться в пределах от минус 20 % до 10 %.

10.2 Прецизионность

10.2.1 Межлабораторные испытания

Детали межлабораторных испытаний прецизионности метода приведены в приложении А. Значения, полученные в этих межлабораторных испытаниях, могут быть не применимы к диапазонам концентраций и пробам, отличающимся от указанных в настоящем стандарте.

В приложении В приведена сводка статистических результатов межлабораторных испытаний по подтверждению эквивалентности дериватизации йодом и бромом.

10.2.2 Повторяемость

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных независимых испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на одной лабораторной пробе в одной лаборатории одним и тем же оператором на одном и том же оборудовании в пределах короткого промежутка времени, более чем в 5 % случаев не должно превышать предела повторяемости r, мкг/кг, полученного по формуле

,

(6)

где - среднеарифметическое значение двух результатов испытаний, мкг/кг.

10.2.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на идентичных пробах в разных лабораториях разными операторами на различных экземплярах оборудования, более чем в 5 % случаев не должно превышать предела воспроизводимости R, мкг/кг, полученного по формуле

,

(7)

где - среднеарифметическое значение из двух результатов испытаний, мкг/кг.

11 Протокол испытания

Протокол испытания должен включать следующее:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

- использованный метод отбора проб, если известен;

- использованный метод испытаний, со ссылкой на настоящий стандарт;

- все детали работы, не установленные в настоящем стандарте, или считающиеся необязательными, наряду с описанием всех случаев, которые могли повлиять на результат(ы) испытаний;

- полученный результат испытания или полученный окончательный результат, если была проведена проверка повторяемости.

Сведения
о соответствии ссылочного международного стандарта межгосударственному стандарту

Таблица ДА.1

Обозначение ссылочного международного стандарта	Степень соответствия	Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта
ISO 6498:1998	MOD	ГОСТ 31218-2003 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб"
Примечание - В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандарта: - MOD - модифицированный стандарт.

Библиография

[1]	Traag W.A., van Trijp J.M.P., Tuinstra L.G.M.Th. and Kok W.Th. Sample clean-up and post-column derivatization for the determination of Aflatoxin B1 in feedstuffs by liquid chromatography. J. Chrom., 396, pp. 389-394 (1987)
[2]	RIKILT-DLO, SOP A0446, State Institute for the Control of Agricultural Products, Agricultural Research Department (DLO), Grondstoffen voor veevoeder. Screening op het gehalte aan aflatoxine B1 - High Performance Liquid Chromatography - Post-column derivatisering - Fluorescentiedetectie (Screening of straight feedingstuffs on aflatoxin B1 by HPLC and fluorescence detection)
[3]	van Egmond H.P., Heisterkamp S.H. and Paulsch W.E. EC-collaborative study on the determination of aflatoxin B1 in animal feeding stuffs. Food Additives and Contaminants, 8, pp.17-29 (1991)
[4]	van Egmond H.P., Patel S., Paulsch W.E., Sizoo E.A. Tuinstra L.G.M.Th., Wood G., Boenke A., Schurer B. and Wagstaffe P.J. The development of five animal feed reference materials, certified for their aflatoxin B1 content. Food Additives and Contaminants, 11, pp. 449-477 (1994)
[5]	ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 1: General principles and definitions. (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. - Часть 1. Общие принципы и определения)*(8)
[6]	ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basicmethod for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. (Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. - Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения)*(8)
[7]	ISO 6497 Animal feeding stuffs - Sampling (Корма для животных. Отбор проб)*(8)
[8]	ISO 6651 Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B1 content (TLC methods). (Корма для животных. Полуколичественное определение содержания афлатоксина В1. Методы тонкослойной хроматографии)*(8)

------------------------------

*(8) Официальный перевод этого стандарта находится в Федеральном информационном фонде стандартов.