Методические рекомендации МР 1.1.0120-18 "Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора - люминометра типа "Биотокс-10")" (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 13 февраля 2018 г.)

Методические рекомендации МР 1.1.0120-18
"Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора - люминометра типа "Биотокс-10")"
(утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 13 февраля 2018 г.)

I. Общие положения

1.1. Методические рекомендации содержат описание метода токсикологического тестирования парфюмерно-косметической (далее - ПК) продукции с применением в качестве тест-объекта (биосенсора) реактива люминесцентных бактерий "Эколюм" или иных препаратов бактериальной люциферазы и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК-продукции (далее - методические рекомендации, метод):

- продукция косметическая гигиеническая моющая;

- жиросодержащие косметические средства;

- продукция косметическая жидкая, не содержащая спирт;

- гели косметические;

- продукция декоративной косметики на эмульсионной основе;

- продукция косметическая для окрашивания, осветления, химической завивки и выпрямления волос;

- продукция косметическая на носителях;

- пилинги, скрабы, эксфолианты;

- интимная косметика;

- парфюмерная и косметическая спиртосодержащая продукция;

- дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке и не в аэрозольной упаковке;

- продукция декоративной косметики порошкообразная и компактная, тальк, присыпки, зубные порошки;

- кремы косметические для ухода за кожей лица, тела, волосами, ногтями, губами, кожей вокруг глаз;

- продукция декоративной косметики на жировосковой основе;

- средства для маникюра и ухода за ногтями;

- мыло туалетное твердое;

- соли для ванн, сухие средства для ванн;

- зубные пасты;

- средства гигиены полости рта жидкие;

- средства для домашнего отбеливания зубов;

- косметическая продукция индивидуальной защиты кожи от воздействия вредных производственных факторов.

1.2. Методические рекомендации предназначены для оценки общетоксического действия вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК-продукции.

Метод может быть применен для скрининговой оценки ПК-продукции в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

1.3. Методические рекомендации предназначены для учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК-продукции, контроль ее качества и оценки соответствия, а также для органов и организаций, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор.

II. Описание метода

2.1. В качестве тест-объекта используются препараты "Эколюм" лиофилизированных люминесцентных бактерий или иные препараты бактериальной люциферазы. Метод основан на определении изменения интенсивности бактериальной биолюминесценции при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

2.2. Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора типа "Биотокс-10" интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК-продукции, по сравнению с раствором, не содержащим токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

При изучении токсикологических свойств ПК-продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высших животных.

Токсическое действие исследуемой пробы определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте - 5 мин) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "Т".

2.3. Индекс токсичности "Т" равен отношению , где и I - интенсивность биолюминесценции контроля и опыта соответственно при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериальным препаратом.

Метод допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1-й уровень: допустимая степень токсичности образца - индекс токсичности "Т" меньше 20;

2-й уровень: образец токсичен - индекс токсичности "Т" равен или больше 20 и меньше 50;

3-й уровень: образец сильно токсичен - индекс токсичности "Т" равен или более 50.

Основанием для выбора эталонных разведений различных видов ПК-продукции с учетом допустимого интервала индекса токсичности послужила сравнительная оценка результатов исследования общей токсичности настоящим методом и кожно-раздражающего действия различных видов ПК-продукции в эксперименте на лабораторных животных.

III. Оборудование, химическая посуда и реактивы

3.1. Измерительный прибор - люминометр типа "Биотоке-10" с набором кювет на 1,5 мл.

3.2. Лиофилизированная культура микроорганизмов "Эколюм" или иных препаратов бактериальной люциферазы.

3.3. Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1-2011, высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

3.4. pH-метр любой марки с набором электродов.

3.5. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474.

3.6. Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до +4°С.

3.7. Пробирки с притертыми пробками объемом 3-5 мл, ГОСТ 1770-74.

3.8. Дозаторы лабораторные по ГОСТ 28311. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770.

3.9. Воронки делительные на 100 мл типа ВД-1-100.

3.10. Фильтры бумажные "синяя лента" или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678.

3.11. Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148.

3.12. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

3.13. Кислота соляная, ГОСТ 3118.

3.14. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328.

3.15. Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174.

3.16. Спирт этиловый, хч, ТУ 6-091710.

3.17. Кислота серная, ГОСТ 4204.

3.18. Термометр, предметное стекло (технические характеристики).

Допускается применение аналогичного оборудования и материалов с техническими и метрологическими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже указанных в п. 3 методических рекомендаций.

При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

IV. Проведение испытаний

4.1. Условия выполнения токсикологических испытаний

При проведении испытаний в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

- температура воздуха от 18 до 25°С;

- относительная влажность воздуха не более 80%;

- атмосферное давление 84-106 кПа (630-800 мм рт. ст.);

- частота переменного тока (501) Гц;

- напряжение сети (22010) В.

4.2. Отбор проб проводится по ГОСТ 29188.0-2014.

4.3. Приготовление экстрактов из образцов ПК-продукции

4.3.1. Из поступивших на испытания образцов одного наименования (не менее двух единиц) составляют объединенную пробу. Опытные образцы готовят путем разбавления испытуемых образцов в модельной среде (дистиллированная вода).

В сосуд помещают необходимое количество пробы ПК-продукции, заливают определенным объемом дистиллированной воды и выдерживают (настаивают) в термостате при температуре 37°С определенное время (продолжительность экстракции).

Соотношение массы (объема) испытуемой продукции и объема модельной среды, а также продолжительность экстракции, приведены в табл. 1.

После окончания экстракции полученные экстракты охлаждают до комнатной температуры и отделяют водную фазу фильтрацией или с помощью делительной воронки.

Испытуемые образцы продукции на носителях предварительно измельчают ножницами.

Испытуемые образцы ПК-продукции, представляющей собой жиросодержащие средства, порошкообразные и компактные, эмульсии и суспензии, продукцию на носителях, требуют периодического перемешивания в течение времени экстракции.

По продукции, применение которой согласно аннотации подразумевает смешивание нескольких компонентов перед применением (для окрашивания, осветления, мелирования волос, для химической завивки или распрямления волос, сухие косметические маски и другая аналогичная продукция), испытуемые образцы готовят в зависимости от полученной консистенции готовой композиции.

Средства для ухода за ногтями требуют предварительной подготовки. На предметное стекло (2x2 см) ровным слоем наносят исследуемую навеску (1 г) образца и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. Высушенную пробу переносят в сосуд с дистиллированной водой и готовят экстракт в соответствии с п. 4.3.1.

Таблица 1

Условия приготовления водных экстрактов в зависимости от вида продукции

N п/п	Вид ПК-продукции	Масса или объем образца	Объем дистиллированной воды, мл	Степень разведения	Продолжительность экстракции, мин
1	2	3	4	5	6
1	Продукция косметическая гигиеническая моющая	1 мл	20	1:20	10
2	Жиросодержащие косметические средства	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
3	Продукция косметическая жидкая, не содержащая спирт	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
4	Гели косметические	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
5	Продукция декоративной косметики на эмульсионной основе	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
6	Продукция косметическая для окрашивания, осветления, химической завивки и выпрямления волос	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
7	Продукция косметическая на носителях	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
8	Пилинги, скрабы, эксфолианты	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
9	Интимная косметика	0,1 мл или 0,1 г	100	1:1 000	60
10	Парфюмерная и косметическая спиртосодержащая продукция	1 мл	20	1:20	10
11	Дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке	0,1 мл	100	1:1 000	10
12	Продукция декоративной косметики порошкообразная и компактная, тальк, присыпки, зубные порошки	0,1 г	100	1:1 000	10
13	Кремы косметические для ухода за кожей лица, тела, волосами, ногтями, губами, кожей вокруг глаз	1 г	10	1:10	60
14	Продукция декоративной косметики на жировосковой основе	1 г	10	1:10	60
15	Дезодоранты и депиляторы не в аэрозольной упаковке	1 г	10	1:10	60
16	Средства для маникюра и ухода за ногтями	1 г	20	1:20	60
17	Мыло туалетное твердое, соли для ванн, сухие средства для ванн	0,1 г	100	1:1 000	60
18	Зубные пасты	1 г	1 000	1:1 000	60
19	Средства гигиены полости рта жидкие	1,0 мл	1 000	1:1 000	10
20	Средства для домашнего отбеливания зубов	1 г	1 000	1:1 000	60

Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.

4.4. Подготовка прибора "Биотокс-10" и тест-объекта "Эколюм"

4.4.1. Подготовка прибора "Биотокс-10"

Подготовку прибора "Биотокс-10" проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

4.4.2. Регидратация биосенсора "Эколюм"

4.4.2.1. Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом "Эколюм".

4.4.2.2. Добавить 10 мл дистиллированной воды комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Рекомендуется использовать стерилизованную дистиллированную воду, а также несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.

Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

4.4.2.3. Выдержать суспензию в течение 30 мин.

4.4.3. Определение рабочей концентрации биосенсора "Эколюм"

4.4.3.1. Измерить фоновое значение прибора "Биотокс-10" (по инструкции к прибору, при счете 10 с без кюветы) и записать это значение.

4.5. Проведение измерений

4.5.1. Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (комнатная температура).

4.5.2. Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 25-250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Если биосенсер стал меньше растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.

4.5.3. В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды. При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы ПК-продукции различного разведения в соответствии с табл. 1 методических рекомендаций. Температура дистиллированной воды и образцов должна быть одинаковой. Указать значение температуры.

Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора "Биотокс-10" в стандартном варианте через 30 мин экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 мин.

4.5.4. Контроль погрешности метода токсикологического анализа.

Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водному . Расчет проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 30 мин интенсивность биолюминесценции ингибируется на 50%, составляет 0,6-1,5 мг/л.

Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.

Процедура определения диапазона реагирования тест-системы "Эколюм" на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого, при времени инкубации 30 мин с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50% ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов.

4.6. Математическая обработка результатов измерений

4.6.1. Результат токсикологического анализа - индекс токсичности - в документах, предусматривающих его использование, представляется в виде:

при Р = 0,95, где

- среднее арифметическое определений, s - среднеквадратичное отклонение, Р - уровень вероятности.

За результат анализа () принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности "Т" вычисляется по формуле: , где и - интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах соответственно.

Среднее квадратичное отклонение () результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности - вычисляется по формуле:

, где

- i-й результат определений;

n - число параллельных определений.

Среднее арифметическое результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором "Биотокс-10" автоматически по команде оператора.

V. Оценка результатов испытаний

5.1. Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности "Т".

В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения "Т" делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на три группы в соответствии с табл. 2.

Таблица 2

Классификация токсичности проб

Группы	Индекс токсичности "Т"	Вывод о степени токсичности пробы
1	меньше 20	допустимая степень токсичности
2	от 20 до 50	образец токсичен
3	равен или больше 50	образец сильно токсичен

Если при оценке токсичности продукции по величине индекса токсичности получено значение индекса токсичности более 20, то вывод о токсикологической безопасности продукции должен быть сделан после испытаний продукции аналогичными альтернативными методами или методами in vivo.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова