Методические указания МУК 4.1.1247-03 "Определение остаточных количеств бентазона в семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 16 марта 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1247-03
"Определение остаточных количеств бентазона в семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 16 марта 2003 г.)

Дата введения - 1 июля 2003 г.

2. Методика определения бентазона в семенах и масле сои методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении бентазона методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов этил-ацетатом или водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1.

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг (л)	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (л)	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, P = 0 ,95
Семена сои	0,01	0,01-0,1	86,2	7,60	6,08
Масло сои	0,02	0,02-0,2	87,6	7,20	5,76

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, чда	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или хч	ТУ 6-09-3534-87
Бумажные фильтры "красная лента"	ТУ 6.091678-86
Вода бидистиллированная, деионизированная	ГОСТ 6709-79
Бентазон, аналитический стандарт с содержанием д. в. 99,9%
Дихлорметан, хч	ТУ 2631-019-44493179-98
Калий углекислый, хч	ГОСТ 4221-76
Калий фосфорно-кислый 2-замещенный 3-водный, чда	ГОСТ 2493-75
Калия перманганат	ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, хч	ГОСТ 4161-77
Кислота ортофосфорная, чда 85%-ный раствор, хч	ГОСТ 6552-80
Кислота серная, хч	ГОСТ 4204-77
Натрий серно-кислый безводный, ч, свежепрокаленный	ГОСТ 4166-76
Натрия гидроксид, хч	ГОСТ 4328-77
Натрий двууглекислый	ГОСТ 83-79
н-Гексан, хч свежеперегнанный	ТУ 2631-003-05807999-98
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,02 М ортофосфорная кислота (40 : 60, по объему)
Силикагель 60 (40-63 ) (имп., производства Германии или Чехии)
Стекловата
Фосфора пентоксид, ч	МРТУ 6-09-5759-69
Элюент N 1 для колоночной хроматографии:
смесь гексан-этилацетат (50 : 50, по объему)
Элюент N 2 для колоночной хроматографии:
смесь гексан-этилацетат (20 : 80, по объему)
Этиловый эфир уксусной кислоты, чда	ГОСТ 22300-76

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный
Колонка Symmetry - C18 () мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная
Предколонка Waters Symmetry - С18 () мм, зернение 5 мкм (Waters, USA)
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные	ГОСТ 34104-80Е
Установка ультразвуковая "Серьга"	ТУ 3.836.008
Мельница лабораторная зерновая ЛM3	ТУ 1-01-0593-79
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М или аналогичный	ТУ 25-11-917-74
Бидистиллятор
рН-метр универсальный ЭВ-74	ГОСТ 22261-76
Насос водоструйный	МРТУ 42861-64
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС	ГОСТ 10384-72
Колбы круглодонные на шлифах KШ50 29/32 ТС	ГОСТ 10384-72
Воронки лабораторные В-75-110	ГОСТ 25336-82
Воронки делительные на 100 и 250
ВД-3-100 (250)	ГОСТ 8613-75
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1 000	ГОСТ 1774-74
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1 000	ГОСТ 1770-74
Пипетки на 1, 2, 5, 10	ГОСТ 22292-74

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы семян хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18°С, перед проведением анализа их измельчают на лабораторной зерновой мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г и 2 г ). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005М раствора ортофосфорной кислоты 2 г 98% (или 2,24 г 87%) кристаллической помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,5 М раствора 114 г кристаллического помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки, 0,25 М раствор готовят разбавлением в 2 раза 0,5 М раствора. Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 400 мл ацетонитрила с 600 мл 0,02 М ортофосфорной кислоты в колбе на 1 000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1 000 мл смешивают 500 мл н-гексана и 500 мл этил-ацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1 000 мл смешивают 200 мл н-гексана и 800 мл этилацетата.

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску бентазона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-0,02 М ортофосфорная кислота [40 : 60, по объему]). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

Внимание! Бентазон в растворах достаточно быстро разлагается под воздействием света, поэтому следует избегать длительного нахождения проб и стандартных растворов на свету.

При определении полноты извлечения для внесения в образец используют растворы бентазона, приготовленные из стандартного раствора последовательным разбавлением ацетонитрилом.

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация бентазона в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации бентазона в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан-этилацетат (50 : 50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан-этилацетат (20 : 80, по объему) и 30 мл смеси гексан-этилацетат (50 : 50, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения бентазона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора бентазона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 50 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание бентазона по п. 2.6.4.

Фракции, содержащие бентазон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание бентазона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания бентазона и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение бентазона в семенах сои

Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян сои, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 40 мл этилацетата и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды с 30 мл этилацетата. Объединенный экстракт концентрируют на вакуумном ротационном испарителе до объема 25-30 мл при температуре не выше 40°С, переносят в делительную воронку объемом 100 мл, бентазон экстрагируют трижды 0,25 М раствором , порциями по 40 мл*. Экстракт промывают дважды 50 мл гексана (верхний органический слой отбрасывают) и дважды 50 мл хлористого метилена (нижний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз по 2-3 мин. Водный раствор подкисляют 2М ( 30 мл) до pH 3 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют хлористым метиленом трижды по 25 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (3 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3**.

2.6.2. Определение бентазона в масле сои

Навеску масла, массой 10 г растворяют в 60 мл гексана и экстрагируют бентазон 50 мл системы ацетон-вода (в соотношении 1 : 1) в делительной воронке объемом 100 мл. Смесь встряхивают в течение 2 мин., нижний водно-ацетоновый слой отделяют***. Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт помещают в морозильную камеру с температурой -18°С на 1 час, после чего фильтруют через бумажный фильтр (красная лента) и упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40°С до полного удаления ацетона (объем 50 мл). Водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 мл, дважды промывают гексаном, порциями по 50 мл, встряхивая смесь в течение 2 мин. и отбрасывая верхний органический слой. Добавляют к водному раствору 50 мл 0,5 М раствора . Экстракт промывают дважды в делительной воронке хлористым метиленом, порциями по 50 мл, встряхивая смесь в течение 2 минут и отбрасывая нижний органический слой. Водный раствор подкисляют 2 М ( 30 мл) до pH 3 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют хлористым метиленом трижды по 25 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (3 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 2.6.1 и 2.6.2 экстрактов семян или масла сои, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан-этилацетат (50 : 50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Бентазон элюируют 60 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry - С18 () мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Температура колонки .

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,02М ортофосфорная кислота в соотношении 40 : 60 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 214 нм.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания бентазона  мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1-2,00 мкг/мл.

2.6.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание бентазона в образце семян или масла сои (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- площадь пика бентазона в стандартном растворе, ;

- площадь пика бентазона в анализируемой пробе, ;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора бентазона, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств бентазона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор бентазона 2 мкг/мл, разбавляют.

3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. Разработчики

Долженко В.П., Цибульская И.А., Юзихин О.С., Короткова Н. В.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений.

_____________________________

* В процессе экстракции бентазона из этилацетатного раствора возможно изменение pH водного экстракта вследствие частичного гидролиза этилацетата. Во избежание потерь определяемого компонента следует после экстракции довести pH раствора до 9 путем добавления 0,5 М раствора (контроль осуществлять рН-метром).

** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.3) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с селикагелем можно исключить.

*** В случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии экстракции бентазона водным ацетоном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко