2. Специальная часть

2. Специальная часть

2.1. Правила отбора проб молока (секрета)

2.1.1. Отбор проб молока сборного и подготовку его к исследованию проводят по ГОСТ 3622-68 и ГОСТ 13928-68.

2.1.2. Для бактериологического исследования молока на мастит отбирают пробы из четвертей вымени, реагирующих на быстрый маститный тест - мастидин или димастин и дающих положительную пробу отстаивания.

Пробы отбирает ветеринарная служба хозяйства один раз в месяц в период лактации и по мере запуска коров.

2.1.3. Молоко (секрет) для бактериологического исследования на мастит отбирают из четверти вымени с соблюдением правил асептики, для этого перед взятием пробы молока соски вымени коров и руки дояров протирают ватным тампоном, смоченным 70% спиртом (этиловым или денатурированным), и отбирают в конце дойки 5-10 мл альвеолярного молока. При взятии пробы следят за тем, чтобы сосок не касался края пробирки. При повторном взятии пробы с целью подтверждения диагноза на мастит могут быть использованы как цистернальное, так и альвеолярное молоко.

2.1.4. Для выявления бактерионосителей среди животных, предназначенных для комплектования стада фермы и комплексов, отбирают пробы цистернального молока после сдаивания первых 2-3 струек.

2.2. Правила доставки проб

2.2.1. Пробы молока после их отбора доставляют в лабораторию так, чтобы оно не смачивало пробки. Доставка должна осуществляться в течение 3-4 часов с момента взятия проб в специальных емкостях, обеспечивающих температуру не выше 8-10°С, или в термосах со льдом.

2.3. Проведение исследований секрета на наличие возбудителей мастита

2.3.1. Пробы молока на наличие возбудителей мастита исследуют сразу после доставки их в лабораторию. Оставшееся молоко хранят при температуре не выше 6°С.

2.3.2. Посев молока проводят на МПА с 5% цитратной крови крупного рогатого скота (рецепт 1) и на дифференциально-диагностические среды с целью выделения золотистого стафилококка, стрептококков различных серологических групп, эшерихий, синегнойной палочки, грибов рода Candida.

2.3.3. При первичном обследовании стада, особенно с большим поголовьем или с большим процентом выделения коров с раздражениями вымени, рекомендуется взятые образцы молока с соблюдением правил асептики из реагирующих четвертей вымени, высевать на мясопептонный агар с 5% крови крупного рогатого скота. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°C в аэробных условиях в течение 24 часов. В случае отсутствия роста посевы выдерживают еще 24-48 часов.

2.3.4. Для идентификаций выросших культур изучают их культуральные свойства. Крупные выпуклые колонии, вне зависимости от наличия зоны гемолиза, ориентировочно относят к стафилококкам; мелкие росинчатые - к стрептококкам; серые круглые колонии блестящие плоские обычно указывают на рост бактерий группы кишечной палочки. Появление колоний с зеленым оттенком дает основание предполагать наличие синегнойной палочки.

Слизистые гладкие или матовые колонии характерны для споровой микрофлоры, что свидетельствует о загрязнении молока при отборе пробы.

2.3.5. Из колоний, одинаковых по морфологическим свойствам, делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

При исследовании молока на наличие возбудителей мастита могут быть использованы также элективные среды.

Для выделения золотистого стафилококка - ДНК азно-новокаиновый агар, солевой агар, для стрептококков - среда Карташовой, для бактерий группы кишечной палочки - среда КОДА, для псевдомонад - МПБ, для грибов рода Candida - среда элективная дифференциально-диагностическая.

2.3.6. С целью исключения выделения случайных микроорганизмов, исследование образцов молока через 5-7 дней повторяют с применением элективных сред.

К возбудителям мастита относят бактерии с идентичными культуральными свойствами, которые выделены при повторном исследовании.

2.3.7. Допускается также производить первичный высев молока при обследовании стад на мастит на вышеуказанные среды в два этапа: в начале на среды для выделения золотистого стафилококка и стрептококков, так как им принадлежит преимущественная роль при возникновении мастита микробной этиологии. В случае получения отрицательных результатов, пробы высевают через 24 часа на другие питательные среды.

2.3.8. Выделение золотистого стафилококка

2.3.8.1. Для выделения и количественного учета золотистого стафилококка из молока от одного животного (из удоя или отдельных четвертей вымени), а также из сборного молока и молочных продуктов используют ускоренный метод, который основан на применении элективной, дифференциально-диагностической среды - ДНК-новокаинового агара (рецепт 2).

Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие - добавлением натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибонуклеазной активности.

Проведение исследований. Из доставленных проб молока готовят разведения 1:10 и 1:100 на стерильном физиологическом растворе.

В чашку Петри с ДНК-новокаиновым агаром (рецепт 2) вносят 0,1 мл молока из разведения 1:100 и равномерно распределяют стеклянным шпателем по всей поверхности питательной среды.

Засеянные чашки помещают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38° в течение 22-24 часов. На ДНК-новокаиновом агаре золотистый стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями.

Для выявления ДНК-азной активности золотистого стафилококка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают 5-7 мл 1 N раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают 2-3 минуты, за которые вокруг колоний образуются круглые зоны просветления. Затем кислоту осторожно сливают и приступают к учету результатов исследования. В том случае, если культура стафилококка была выделена на кровяном агаре, то ДНК-азная активность может быть определена путем пересева на ДНК-агар (рецепт 4)

Определение ДНК-азной активности может быть проведено при выращивании изолированной культуры.

Учет результатов исследования. Чашки просматривают в проходящем свете. Обнаружение колоний, окруженных зоной просветления с четкими границами, указывает на наличие в исследуемом материале золотистого стафилококка.

Для определения количества золотистого стафилококка в 1 мл исследуемого материала подсчитывают колонии с зонами просветления по всей поверхности среды, и полученное число колоний умножают на 10 (т.к. высевали 0,1 мл) и на степень разведения материала.

Например: Высеяно 0,1 мл молока из разведения 1:100. В результате подсчета получено 15 колоний. Следовательно в 1 мл молока - 15000 микробных клеток золотистого стафилококка (15x10x100).

2.3.8.2. При высеве образцов на кровяной агар учитывают рост выпуклых колоний с гладкой или шероховатой поверхностью, в которых при микроскопии обнаружены грамположительные кокки, расположенные в виде гроздеподобных скоплений, тетрами или одиночно, выделенную культуру относят к стафилококкам и проверяют на каталазную активность. Для этого часть колоний растирают в капле 10%-ной перекиси водорода, нанесенной на предметное стекло. Каталазоположительные стафилококки содержат фермент каталазу, которые при контакте с перекисью водорода образуют интенсивное газообразование. Одновременно по изменению кровяного агара учитывают гемолитические свойства стафилококков. На кровяном агаре с эритроцитами крупного рогатого скота растут стафилококки, обладающие свойствами (прозрачная зона вокруг колоний), свойствами (матовая зона гемолиза), чаще со смешанным ; иногда зона гемолиза отсутствует.

2.3.8.3. Для определения плазмокоагуляции стафилококков, делают высев полученной культуры в пробирки с мясо-пептонным бульоном и через 3 часа выращивания в термостате при 37°С ставят реакцию плазмокоагуляции с цельной или сухой плазмой крови кролика.

Плазму крови кролика разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5 и разливают в агглютинационные пробирки по 0,5 мл. Бульонную культуру стафилококка по 0,1 мл (2 капли) вносят в пробирки с разведенной плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуру, а в другую - засевают заведомо плазмокоагулирущий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при 37°C и через каждый час в течение трех часов, затем через 18 и 24 часа учитывают результаты.

При положительной реакции плазмокоагуляции образовавшийся сгусток не выпадает из пробирки при наклоне или плавает в плазме.

2.3.8.4. Определение отношения к манниту в анаэробных условиях 3-4 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка высевают в пробирку с 0,15%-ным полужидким агаром, содержащим 0,5% маннита и индикатор Андреде, под вазелиновым маслом (рецепт 5). Посевы инкубируют при температуре 37°С. Результат учитывают через каждые 24 часа. Окончательный результат через 5 суток. Изменение цвета индикатора (появление розового окрашивания) указывает на ферментацию маннита в анаэробных условиях, что является дифференцирующим характерным признаком для золотистого стафилококка.

2.3.8.5. Фаготипирование стафилококка.

Постановка реакции. Поскольку фаги высушивают в объеме 0,1 мл, то при добавлении 1 мл МПБ (с 0,4% глюкозы и 0,2% ) получают основное разведение (1:10). Из этого основного разведения готовят два рабочих разведения, соответствующие 1 тест-разведению (ТР) и 100 TP. Разведение, соответствующее 1 ТР, указано на этикетке фага.

Бактериофаги в жидком состоянии следует хранить при температуре 4°С. Основное разведение фагов при таком способе хранения можно использовать в течение 1,5-2 месяцев. Разведение, соответствующее 1 ТР, следует готовить заново каждые 7 дней из основного разведения .

Методика фаготипирования. Суточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в 2,5 мл бульона Хоттингера, Мартена или мясо-пептонного бульона (рН 7,2-7,4) и выращивают 3-4 часа при 37° (до появления заметной мути). Одновременно готовят чашки с 1,2%-ным агаром, приготовленным на бульоне Хоттингера, содержащего 200 мг аминного азота, 0,4% глюкозы и 0,02% (рецепт 6).

По 25-30 мл расплавленного агара разливают в чашки Петри и после застывания его подсушивают 30-40 минут при 37°. Выросшую трехчасовую бульонную культуру стафилококка вносят пастеровской пипеткой в чашки и орошают поверхность агара. Избыток культуры отсасывают пипеткой и удаляют, агар вновь подсушивают 30-40 минут при 37°.

Дно засеянной чашки расчерчивают карандашом на квадраты по трафарету соответственно числу используемых фагов и в каждый квадрат засеянной среды пастеровской пипеткой с тонко оттянутым концом вертикально наносят каплю соответствующего фага. Один квадрат оставляют для контроля без фага. После нанесения каждого фага пастеровскую пипетку выбрасывают. После подсыхания капель фага чашки переворачивают вниз и инкубируют 5-7 часов при температуре 37°, а затем оставляют на 18-20 часов при комнатной температуре. Для нанесения фагов на чашки с агаром может быть использован специальный аппарат для фаготипирования стафилококков. Аппарат состоит из 25 металлических стержней, вмонтированных в квадратную пластинку, соединенную с поршнем. Основанием прибора служит площадка из органического стекла, на которой находится свободно передвигающаяся вторая площадка с гнездом для фиксирования засеваемой чашки и пластинки из фторопласта с резервуаром для фагов. В резервуары стериальной фторопластовой пластинки, помещенной в стерильную чашку Петри, наливают по 3-5 капель фагов (всегда в одном порядке). Чашку с агаром и пластинку с фагами помещают на подвижную пластинку. Поочередным передвижением площадки устанавливают под металлическими стержнями сначала пластинку с фагами, а затем чашку с агаром. Опуская и поднимая стержни с помощью поршня, переносят капли фагов на чашку с агаром, едва касаясь его поверхности. Чашки меняют в зависимости от числа типируемых культур.

Чашки с фагами оставляют на столе на 30-40 минут и затем их орошают 4-часовой бульонной культурой стафилококков. После подсыхания культур чашки переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30°С или 5-6 часов при 37°С и оставляют до следующего утра при комнатной температуре.

Фаготипирование штаммов начинают с 1 ТР (тест-разведения). Штаммы, которые не лизировались хотя бы одним фагом, на следующий день типируют повторно со 100 ТР.

Учет и регистрация результатов. Степень лизиса культуры разными разведениями фага регистрируют по следующей схеме: (++++) - сливной полный лизис, (+++) - полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса), (++) - наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 пятен лизиса, (+) - от 20 до 50 пятен лизиса, (-) - полное отсутствие лизиса. Для упрощения схемы учета степени лизиса обозначения ++++, +++, ++ и называемые "сильной реакцией", можно регистрировать одним обозначением ++.

Штамм считается типируемым, если хотя бы один фаг вызвал сильную реакцию. Если при типировании культуры фагом 1 ТР получены только слабые реакции или лизис полностью отсутствует, то такой штамм типируют повторно фагом в 100 ТР или считают нетипируемым, (если его типировали 100 ТР). Результаты типирования регистрируют, записывая против названия штамма разведение фагов, с помощью которых был получен положительный результат (1 ТР или 100 ТР), а также номера фагов, обусловивших сильную реакцию. Отдельно в скобках следует записать наличие слабых реакций, если таковые имелись.

Стафилококковые штаммы чаще лизируются не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную фагомозаику.

Если культуры стафилококка при типировании в один и тот же день дают мозаики, различающиеся на одну сильную реакцию, их следует считать идентичными; если разница составляет две и более сильные реакции, штаммы следует признать разными.

2.3.8.6. Оценка результатов.

Стафилококки, обладающие гемолитической активностью, плазмокоагулирующими свойствами, разлагающие маннит в аэробных и анаэробных условиях, фаготитруемые относят к золотистым - Staph. aureus.

Срок лабораторного исследования идентификации стафилококков - 3 дня, при необходимости фаготипирования и определения отношения к манниту - 5 дней.

2.3.9. Выделение стрептококков.

2.3.9.1. Для выделения стрептококков используют среду Карташовой (рецепт 7), на которую высевают 1 мл исследуемого молока или пересевают выросшие на кровяном агаре росинчатые колонии. После 18-24 часов инкубирования посевов при 37°С из пробирок с измененным цветом среды делают мазки и окрашивают их по Граму.

2.3.9.2. Одним из отличительных признаков бактерий рода стрептококков от стафилококков является каталазная активность. Стрептококки - каталазоотрицательные, не содержат фермент-каталазу. Для определения каталазной активности исследуемую культуру отвивают на косячок сывороточного агара (рецепт 8), выращивают в течение 24-48 часов. Выросшую культуру снимают петлей и растирают в капле 10%-ной перекиси водорода (перегидроль разводят в соотношении 1:3) на предметном стекле. Выделение газа, в отличие от стафилококков, у стрептококков не наблюдается.

2.3.9.3. Наличие гемолитических свойств стрептококков определяют путем посева на кровяной агар (рецепт 1), который используют одновременно и для определения гемолитических свойств стафилококков. Большинство выделяемых из молока стрептококков дают непрозрачную (матовую) зону гемолиза. Дальнейшую идентификацию стрептококков ведут по таблице (приложение 2). Для определения свойств устойчивости к желчи культуру стрептококков выращивают предварительно на МПБ с 1% глюкозы (рецепт 9), а затем вносят 1 мл культуры в пробирки с 5 мл МПБ, содержащего 40% желчи (рецепт 10) и ставят в термостат при температуре 37°С на 24 часа. Полное просветление бульона указывает на лизис культуры, помутнение - на рост. Терморезистентность стрептококков определяют путем прогрева бульонной культуры стрептококка при 60°С в течение 30 минут. Пробирки с бульонной культурой ставят в водяную баню с указанным температурным режимом. После прогрева культуру высевают на МПБ и инкубируют в термостате в течение 24-48 часов. Наличие роста в бульоне указывает на терморезистентность культуры. Кроме того, проверяется способность роста на МПБ с содержанием 0,5% сорбита и на МПБ с рН 9,6.

2.3.9.4. Для определения способности культуры обесцвечивать метиленовый голубой производят посев культуры в пробирку с молоком, содержащим этот индикатор в концентрации 1:1000 (рецепт 11). Посевы инкубируют в термостате в течение 24 часов при температуре 37°C.

2.3.9.5. Постановка КАМП-теста. Суточную культуру стафилококка высевают на агар с 5% крови крупного рогатого скота (рецепт 1). Посев делают петлей сплошной линией по диаметру чашки. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8-10 культур. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37°C. КАМП-тест считают положительным, если четко выражена зона гемолиза испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне стафилококка. При необходимости серологической идентификации выделенных штаммов стрептококков, последние направляют в научно-исследовательские учреждения.

Оценка результатов исследований производится по таблице приложения - 2.

Срок лабораторного исследования на стрептококк - 3 дня.

2.3.10. Выделение бактерий группы кишечной палочки (БГКП)

Образцы молока или колоний о кровяного агара, морфологические свойства которых напоминают БГКП, высевают на среду КОДА (рецепт 12) и помещают в термостат при 37°C на 24 часа. Изменение цвета среды из фиолетового в зеленый свидетельствует о наличии в пробах молока БГКП. Для идентификации бактерий рода эшерихий производят посев из пробирок с измененным цветом на среду Симмонса (цитратный тест) и пептонную воду (для реакции на индолообразование). На среде Симмонса эшерихии не растут, а следовательно не изменяют цвета. При определении индолообразования покраснение фильтровальной бумажки, пропитанной реактивом Эрлиха-Бомэ, находящейся в пробирках с посевами на пептонной воде, свидетельствует о наличии эшерихий, в классической реакции - образование розового (индольного) кольца на границе двух жидкостей: эфирной вытяжки и реактива Эрлиха-Бомэ.

Посевом со среды КОДА на среду Олькеницкого (рецепт 13) можно идентифицировать эшерихий, бактерий рода энтеробактер от сальмонелл и протея.

Посев на среду Олькеницкого в пробирках производят петлей по поверхности скоса среды и внутрь столбика. Посевы культивируют в термостате при 37°C в течение 24 часов. Изменение цвета (глюкоза + лактоза +) столбика и скоса среды Олькеницкого из красного в желтый при отсутствии почернения внутри столбика свидетельствует о росте бактерий из рода эшерихии. Изменение скоса среды и столбика в малиновый цвет (мочевина +) и почернение внутри столбика (сероводород +) указывает на рост протея. Изменение скоса в красный, столбика в желтый цвет и почернение внутри столбика указывает на рост сальмонелл.

В случае необходимости дальнейшей идентификации БГКП следует пользоваться таблицей приложения 3. Срок лабораторного исследования - 3 дня.

2.3.11. Выделение Pseudomonas aeruginosa

Образцы молока или колонии с кровяного агара, при микроскопии которых обнаружены грамотрицательные палочки, высевают на МПА и МПБ, культивируют в термостате при 37°C в течение 24-48 часов. Появление сине-зеленого окрашивания МПБ и МПА, рост гладких плоских колоний с ровными или изрезанными краями - указывает на рост синегнойной палочки. Pseudomonas aeruginosa вырабатывает сине-зеленый пигмент пиоционин, за счет которого происходит окрашивание питательных сред. Имеются отдельные виды синегнойной палочки, которые не вырабатывают пиоционин. Pseudomonas aeruginosa не всегда активно вырабатывает пигмент. Пигментообразование можно наблюдать лишь на 2-3 сутки. Поэтому посевы на МПБ и МПА следует дополнительно просматривать через 48-72 часа. Сине-зеленое окрашивание МПБ лучше проявляется, если пробирку с МПБ встряхнуть и обеспечить доступ кислорода.

Из МПБ и МПА делают мазки и окрашивают их по Граму.

Pseudomonas aeruginosa представляет собой короткую, тонкую грамотрицательную палочку.

При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек и изменение цвета сред в сине-зеленый ставят реакцию для обнаружения пиоционина. Для этого в пробирку с МПБ добавляют 1 мл хлороформа, пробирку встряхивают, хлороформ приобретает зеленый цвет и опускается на дно.

У пигментообразующих сапрофитных бактерий в хлороформе пигмент не растворяется.

Принадлежность выделенной культуры к Ps. aeruginosa подтверждают следующими признаками. Синегнойная палочка может расти при температуре от +15 до +43°С, способна расти при пересеве в физиологическом растворе, вызывает гидролиз желатины, свертывание молока, не растет на среде Китт-Тароцци, не ферментирует углеводы за исключением глюкозы, индол не образует, выделяет аммиак, гидролизует мочевину. Реакция на каталазу - положительная.

Срок лабораторного исследования - 3 дня.

2.3.12. Выделение и идентификация грибов рода Candida.

Из доставленных в лабораторию проб молока делают высевы по 0,1-0,3 мл на чашки Петри со средой (рецепт 14). Посевы делают на 2 чашки П