Методические указания по лабораторной диагностике парагнильца пчел (утв. Государственным агропромышленным комитетом СССР 18 августа 1986 г. N 433-6)

1. Общие положения.

1.1. Парагнилец - инфекционная болезнь пчелиных семей, поражающая открытый и печатный расплод, а при хроническом течении и куколки.

Болезнь проявляется чаще в первую половину лета. На сотах обнаруживают много потемневших утолщенных крышечек, а в ячейках под ними - гнилостную тягучую массу с неприятным запахом. После высыхания личинок образуются корочки, легко отделяющиеся от стенок ячеек.

1.2. Возбудитель болезни - Bac. paraalvei - грамположительная, крупная, подвижная палочка. В погибших личинках и на питательных средах образует споры.

1.3. Диагноз на парагнилец ставят на основании эпизоотологических данных, характерных признаков поражения расплода и данных лабораторного исследования.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют образцы сотов размером 10х15 см с больными и погибшими личинками (в случае гибели открытого расплода образец должен содержать неразложившиеся личинки). Образцы пересылают в деревянном или фанерном ящике, отделяя их друг от друга и от стенок ящика деревянными планками. Соты нельзя обертывать бумагой.

Заплесневевший материал для исследования непригоден.

1.5. Лабораторная диагностика парагнильца включает микроскопию мазков из патологического материала и выделение культуры возбудителя с последующей ее идентификацией.

2. Микроскопическое исследование.

2.1. Из ячеек сотов стерильным пинцетом извлекают погибшие личинки или высохшие корочки, помещают их в ступку со стерильным физиологическим раствором и растирают до получения однородной суспензии (сухие корочки предварительно размачивают в стерильном физиологическом растворе в течение 15-20 мин). Для приготовления мазков на поверхность предметного стекла наносят каплю приготовленной суспензии, распределяют ее тонким слоем и подсушивают. Мазки фиксируют и окрашивают по Граму и для обнаружения спор - 2%-ным спиртовым раствором карболового фуксина в течение 1,5-2 мин.

В положительных случаях в мазках обнаруживают одиночные грамположительные палочки с закругленными концами и крупные овальные споры, расположенные центрально.

3. Бактериологическое исследование.

3.1. Для выделения культуры Вас. paraalvei из суспензии, приготовленной как указано в п. 2.1., делают высевы в МПБ и на МПА с добавлением 10% нормальной сыворотки крови лошади.

3.2. Через 24-48 ч культивирования при 37-38°С Bac. paraalvei вызывает легкое помутнение бульона. Позднее МПБ просветляется, а на дно пробирки выпадает осадок, поднимающийся при встряхивании в виде косички.

На МПА через 24-48 ч возбудитель образует плоские расплывчатые колонии с неровными краями или дает нежный ползучий рост.

В мазках из типичных колоний обнаруживают одиночные крупные грамположительные палочки. При микроскопии 2-3-суточных культур обнаруживают споры, расположенные центрально.

3.3. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.

Вас. paraalvei ферментирует с образованием кислоты без газа сахарозу, мальтозу, не ферментирует арабинозу, не восстанавливает нитраты, каталазоположителен, не вызывает гемолиза (см. приложение 2).

3.3.1. Ферментативные свойства возбудителя изучают путем выращивания его в течение 2-3 сут на жидких средах Гисса с добавлением 10% нормальной сыворотки крови лошади.

3.3.2. Восстановление нитратов в нитриты. Выделенную культуру засевают в сывороточный МПБ с 1% нитрата калия. Через 48-72 ч инкубирования при 37-38°С в пробирку вносят 0,5 мл 0,5%-ного водного раствора крахмала и такое же количество 0,5%-ного водного раствора иодистого калия. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, добавляют 1 каплю 5%-ного раствора серной кислоты и взбалтывают. Цвет среды не изменяется или становится голубоватым.

3.3.3. Для определения каталазной активности на предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода и в нее петлей вносят суточную агаровую культуру возбудителя. Интенсивное газообразование указывает на наличие каталазы.

3.3.4. Гемолитическую активность выделенной культуры определяют на глюкозо-кровяном агаре (агар Цейсслера).

Через 24-72 ч культивирования при 37-38°С на глюкозо-кровяном агаре возбудитель образует расплывчатые колонии с неровными краями без зоны гемолиза.

4. Диагноз на парагнилец считается установленным при выделении из патологического материала культуры со свойствами, характерными для Bac. paraalvei.

5. Срок исследования до 6 дн.

Начальник Главного управления ветеринарии Государственного агропромышленного комитета СССР

А.Д. Третьяков