Методические указания по лабораторной диагностике септицемии пчел (утв. Государственным агропромышленным комитетом СССР 18 августа 1986 г. N 433-6)

1. Общие положения.

1.1. Септицемия - инфекционная болезнь пчелиных семей, сопровождающаяся размножением возбудителя в гемолимфе пчел.

Болезнь проявляется преимущественно весной и осенью на пасеках, расположенных в низких заболоченных местах и вызывает гибель взрослых пчел. Больные пчелы не способны к полету, тело их легко расчленяется на части, а гемолимфа приобретает мутный или молочно-белый цвет.

1.2. Возбудитель болезни - Pseudomonas apisepticum - полиморфная, подвижная грамотрицательная палочка, не образующая спор и капсул, факультативный аэроб.

1.3. Диагноз на септицемию ставят на основании эпизоотологических данных, характерных признаков поражения пчелиных семей и результатов лабораторного исследования.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют не менее 50 живых пчел с признаками заболевания. Пчел помещают в стеклянные банки, закрытые 2-3 слоями марли.

1.5. Лабораторная диагностика включает микроскопию мазков из патологического материала и выделение культуры возбудителя с последующей ее идентификацией.

2. Микроскопическое исследование.

2.1. Для приготовления мазков от 10-15 пчел, обездвиженных парами эфира или хлороформа, берут гемолимфу, делая прокол перепонки между 3 и 4 сегментами брюшка тонко оттянутой пастеровской пипеткой, и наносят ее на предметное стекло. Мазки высушивают, фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают по Граму.

2.2. В положительном случае в мазках обнаруживают однородные грамотрицательные палочки.

3. Бактериологическое исследование.

3.1. Гемолимфу высевают в МПБ и на МПА. Для этого поверхность хитинового покрова 10-15 пчел слегка обжигают над пламенем горелки и берут гемолимфу, как указано в п. 2.1.

3.2. Посевы инкубируют в термостате в аэробных условиях при температуре 37-38°С в течение 20-24 ч.

3.3. Pseudomonas apisepticum вызывает помутнение МПБ с образованием легкого осадка.

На поверхности МПА образует крупные, хорошо очерченные бесцветные колонии с темным центром. Позднее появляется сплошной рост и культура приобретает зеленовато-мутный оттенок.

3.4. Идентификацию возбудителя проводят по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.

Pseudomonas apisepticum ферментирует с образованием газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит и лактозу (наиболее вирулентные штаммы маннит и лактозу не расщепляют), восстанавливает нитраты в нитриты, образует сероводород, реакция Фогес-Проскауэра положительная.

3.4.1. Ферментативные свойства выделенных культур изучают на средах Гисса через 2-3 суток инкубирования в термостате при 37-38°С.

3.4.2. Для определения способности восстановления нитратов в нитриты культуру высевают в МПБ с 1% нитрата калия. Через 48-72 ч инкубирования при 37-38°С в пробирку вносят 0,5 мл 0,5%-ного водного раствора крахмала и такое же количество 0,5%-ного водного раствора йодистого калия. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, добавляют одну каплю 5%-ного раствора серной кислоты и взбалтывают. В присутствии нитрита калия цвет среды становится темно-синим.

3.4.3. Определение образования сероводорода проводят на среде Кристенсена (см. приложение).

Исследуемую культуру засевают уколом в столбик. При выделении сероводорода через 2-3 сут инкубирования в термостате при 37-38°С наблюдается почернение столбика.

3.4.4. Постановка реакции Фогес-Проскауэра. К 1 мл 4-суточной культуры, выращенной на среде Кларка (см. приложение), добавляют 0,2 мл 40%-ного водного раствора едкого калия и 0,5 мл 6%-ного спиртового раствора и встряхивают.

При появлении розовой окраски среды реакцию считают положительной.

4. Диагноз на септицемию считается установленным при выделении из патологического материала культуры со свойствами, характерными для Pseudomonas apisepticum.

5. Срок исследования 5 сут.

Начальник Главного управления ветеринарии Государственного агропромышленного комитета СССР

А.Д. Третьяков