Приложение 2. Рецепты приготовления реактивов, питательных сред и методы определения ферментативных свойств культур бактерий

Приложение 2

Рецепты
приготовления реактивов, питательных сред и методы определения ферментативных свойств культур бактерий

1. Глицериновый раствор для консервирования фекалий

Состав:	глицерин нейтральный	-	300
	натрий хлористый	-	5 г
	вода дистиллированная	-	700

Раствор стерилизуют при 1 атм (121°С) в течение 20 мин или прогревают в водяной бане (100°С) в течение 30-40 мин.

2. Забуференный физиологический раствор с рН 7,0-7,2

К 1 0,85%-ного раствора хлорида натрия добавляют 10 смеси 1/15 М растворов двузамещенного фосфорнокислого натрия и однозамещенного фосфорнокислого калия в соотношении 7:3 или 8:2 (в зависимости от исходной величины рН воды), компоненты в колбе тщательно размешивают. Хранят раствор в темном месте в течение 6 мес.

3. Селективные среды Эндо, Левина

Коммерческие сухие среды готовят в соответствии с указаниями на этикетках.

4. Селективная среда с сорбитолом (сорбитом) для выделения и идентификации Е.соli сероваров O157:Н7 и O157:Н-

Коммерческая сухая среда изготовляется в Государственном научном центре прикладной микробиологии АМН (142279, пос. Оболенск, Серпуховского р-на Московской обл.). Готовят среду в соответствии с указанием на этикетке.

Эшерихии серогруппы O157 (варианты O157:Н7 и О157:Н-) образуют на данной среде колонии серовато-белого цвета; колонии других серологических групп эшерихий - красно-малинового цвета.

5. Среда Минка для выявления адгезивных антигенов эшерихий К88, F41, F18

Для приготовления среды вначале готовят следующие исходные растворы:

а) фосфатно-буферный раствор с рН 7,4-7,5. Для его приготовления предварительно получают 1/15 М растворы двузамещенного фосфорнокислого натрия и однозамещенного фосфорнокислого калия . С этой целью добавляют к 1 дистиллированной воды 23 г (в первую колбу) и 9 г (во вторую колбу), компоненты растворяют путем встряхивания колб. Колбы с полученными 1/15 М растворами солей закрывают резиновыми или корковыми пробками и хранят в темном месте при комнатной температуре в течение 6 месяцев. Для получения фосфатно-буферного раствора с рН 7,4-7,5 к 1 дистиллированной воды добавляют 10 смеси 1/15 М растворов и в соотношении 9:1, компоненты в колбе тщательно перемешивают.

б) Раствор микроэлементов:

магний сернокислый	-	1 г
марганец хлористый	-	0,1 г
кальций хлористый	-	0,04 г
железо хлорное	-	0,02 г
вода дистиллированная	-	100

Компоненты тщательно размешивают в воде, отверстие колбы закрывают резиновой или корковой пробкой, хранят раствор микроэлементов при комнатной температуре в течение 1 мес.

в) 4%-ный раствор агар-агара. Для его приготовления в колбу с 1 дистиллированной воды добавляют 40 г предварительно отмытого агар-агара, колбу нагревают до полного расплавления агара, затем фильтруют через ватный фильтр и стерилизуют при 1 атм (121°С) в течение 30 мин. Перед употреблением застывший агар расплавляют в водяной бане.

Среду Минка готовят по следующему рецепту:

фосфатно-буферный раствор (рН 7,4-7,5)	-	950
раствор микроэлементов	-	2
40%-ный раствор глюкозы	-	25
10%-ный раствор дрожжевого экстракта	-	10
10%-ный раствор гидролизата казеина	-	20

Примечание: для приготовления среды используют сухой очищенный дрожжевой экстракт и сухой гидролизат казеина.

Компоненты в колбе размешивают, затем нагревают смесь до температуры 45-50°С, после чего к ней добавляют 1 расплавленного 2%-ного раствора агар-агара. Готовую среду (2%-ный агар Минка) разливают в колбы по 100-200 и стерилизуют при 0,5 атм (112°С) в течение 15 мин, хранят среду не более 1,5 мес. Перед употреблением ее расплавляют в водяной бане и разливают в стерильные чашки Петри.

6. Среда с мочевиной (по Преусу)

Состав:	бульон Хоттингера или мартеновский бульон	-	1000
	агар-агар	-	15 г
	глюкоза	-	5 г
	50%-ный водный раствор мочевины	-	20
	0,2%-ный раствор бромтимолблау	-	12

Приготовление: к стерильному расплавленному агару на бульоне Хоттингера или мартеновском бульоне с рН 6,9-7,0 добавляют глюкозу, растворы мочевины и индикатора бромтимолблау. Расплавленную среду разливают в стерильные пробирки по 5 и стерилизуют однократно текучим паром 20-30 мин или при 112°С 15 мин. Перед употреблением среду скашивают. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет. Посев с агаровой среды проводят обильный частыми штрихами.

При расщеплении мочевины среда приобретает синий цвет, при отсутствии расщепления мочевины она окрашивается в желтый цвет.

6.1. Среда с мочевиной (по Кристенсену)

Состав:	пептон	-	1 г
	натрия хлорид	-	5 г
	калий фосфорнокислый однозамещенный	-	2 г
	агар-агар	-	20 г
	глюкоза	-	1 г
	феноловый красный (0,2%-ный водный раствор)	-	6
	мочевина (20%-ный водный раствор)	-	100
	вода дистиллированная	-	1000

Приготовление: пептон, соли, индикатор и агар растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,9-7,0, среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 0,5 атм (112°С) 15 мин. Раствор мочевины после фильтрования через фильтр Зейтца добавляют в стерильную среду и тщательно его перемешивают, готовую среду разливают в пробирки по 5 и скашивают.

При расщеплении мочевины среда приобретает малиновый цвет, при отсутствии расщепления мочевины она окрашивается в желтый цвет.

7. Цитратный агар Симонса

Для определения способности бактерий усваивать цитратно-аммонийные соли используют коммерческую сухую среду, которую готовят согласно указаниям на этикетке препарата, или агар Симонса, приготовленный на основе жидкой среды Козера.

Состав среды Козера:

натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный	-	1,5 г
калий фосфорнокислый однозамещенный	-	1 г
магний сернокислый	-	0,2 г
натрий лимоннокислый	-	3 г
дистиллированная вода	-	1000

Для приготовления агара Симонса к 1 среды Козера добавляют 20 г агар-агара и 10 индикатора бромтимолблау. Последний готовят из расчета: бромтимолблау - 1 г, 0,1N раствор NaOH - 25 (для получения указанного раствора к 100 дистиллированной воды добавляют 0,4 г NaOH), дистиллированной воды - 475 .

Среду нагревают до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем разливают в пробирки по 5 и стерилизуют при 0,5 атм (112°С) в течение 15 мин. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет. Перед употреблением среду скашивают. Посев проводят культурой, выращенной на МПА.

Бактерии, способные усваивать цитратно-аммонийные соли, дают рост на агаре Симонса с изменением его в синий цвет. При отсутствии указанного свойства роста культуры не наблюдается и цвет среды не изменяется.

8. Среда для обнаружения сероводорода

К 1 расплавленного стерильного 1,7%-ного МПА добавляют 0,2 г сернокислого железа ; 0,3 г серноватистокислого натрия-тиосульфата , 1 г лактозы, 12 0,2%-ного водного раствора фенолрота. После размешивания компонентов среду разливают в стерильные пробирки по 6-7 и стерилизуют текучим паром однократно в течение 20 мин. Готовая среда имеет бордово-красный цвет. Перед употреблением среду скашивают так, чтобы она имела столбик размером не менее 2,5-3 см.

Среду засевают агаровой культурой бактерий вначале на скошенную поверхность, а затем уколом в столбик. В случае образования сероводорода среда в столбике окрашивается в черный цвет. При отрицательном результате почернения среды не наступает.

9. Среды и реактивы для определения индолообразования

Для исследования применяют одну из следующих сред:

- бульон на триптическом переваре казеина (1,2-1,4% аминного азота);

- МПБ или бульон Хоттингера (1,2-1,4% аминного азота);

- 2%-ную пептонную воду.

9.1. Реактивы для обнаружения индола

9.1.1. Реактив Эрлиха

Состав:	пара-диметиламинобензальдегид	-	1 г
	спирт этиловый 96°	-	95
	соляная кислота концентрированная	-	20

Приготовление и хранение: альдегид растворяют в спирте, затем, добавляют кислоту, хранят реактив в закрытом темном флаконе при температуре 4-6°С.

Применение реактива: к двухсуточной культуре бактерий, выращенной на любой из сред для определения индола, добавляют 0,5 реактива Эрлиха, пробирку встряхивают и через 1-2 мин учитывают результаты. В случае образования индола верхний слой жидкости приобретает розовый цвет, при отрицательной реакции он окрашивается в желтый цвет.

9.1.2. Реактив Ковача

Состав:	пара-диметиламинобензальдегид	-	5 г
	спирт амиловый	-	75
	соляная кислота концентрированная	-	25

Приготовление, хранение и применение реактива аналогичны реактиву Эрлиха. В случае образования индола за счет реактива Ковача верхний слой жидкости окрашивается в красный цвет, при отрицательной реакции - в желтый цвет.

9.1.3. Индикаторные бумажки для определения индола

Предварительно готовят следующий реактив:

пара-диметиламинобензальдегид	-	5 г
концентрированная ортофосфорная кислота	-	10
спирт этиловый 96°	-	50

Приготовленный реактив переливают в эмалированный металлический кювет, в который помещают кусочки фильтровальной бумаги. Пропитанные реактивом бумажки высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем нарезают полосками размером 0,7-0,8х10-12 см. Бумажки имеют желтый цвет. Хранят их в банке из темного стекла, закрытой резиновой или корковой пробкой.

Для приготовления индикаторных бумажек можно использовать реактив Эрлиха или Ковача.

Применение: после посева изучаемой культуры бактерий на любую из сред для определения индола помещают в пробирку полоску индикаторной бумажки, верхний конец которой прижимают ватной пробкой. Нижний конец бумажки должен быть на расстоянии не менее 3-4 см от поверхности среды. Засеянные пробирки инкубируют в термостате в течение двух суток. При наличии индолообразования нижний конец индикаторной бумажки окрашивается в малиново-красный цвет, при отрицательной реакции цвет бумажки не изменяется.

10. Комбинированные среды для первичной идентификации культур

10.1. Агар Клиглера

Коммерческая сухая среда готовится в соответствии с указаниями на этикетке. Готовая к употреблению среда имеет красновато-бурый или оранжево-красный цвет, при скашивании среды оставляют столбик высотой не менее 2-2,5 см.

10.2. Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому

Состав:	агар питательный сухой	-	25 г
	лактоза	-	10 г
	сахароза	-	10 г
	глюкоза	-	1 г
	аммоний-железо/11/сульфат	-	0,2 г
	натрий тиосульфат	-	0,3 г
	мочевина	-	10 г
	феноловый красный (0,4%-ный водный раствор)	-	4
	вода дистиллированная	-	1000

Приготовление: соли предварительно растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в небольших объемах воды при подогревании в водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешивании. Затем все ингредиенты смешивают с расплавленным агаром, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4. После добавления индикатора среду хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 6-7 . Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин или при 0,5 атм (112°С) 15 мин. Среду скашивают, оставляя столбик не менее 2-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

О ферментации лактозы в среде Клиглера и Олькеницкого судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы - по окрашиванию столбика в аналогичный цвет. В культурах, ферментирующих лактозу и сахарозу, вся среда (столбик и косяк) приобретает желтый цвет. Газообразование устанавливают по наличию пузырьков в среде, разрывов агара или его отслоению от стенок пробирки. При образовании сероводорода происходит почернение среды в столбике, а при значительной его продукции - почернение всей среды. В случае гидролиза мочевины происходит окрашивание столбика и косяка среды а малиновый цвет.

Учет ферментативных свойств культуры проводят через 24 и 48 часов.