Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных (утв. Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ 27 июля 2000 г. N 13-7-2/2117)

1. Общие положения

1.1. Колибактериоз (эшерихиоз, колидиарея, коли-инфекция) - остропротекающая инфекционная болезнь молодняка животных всех видов. Возбудителями болезни являются патогенные штаммы Escherichia coli, относящиеся к роду Escherichia, семейству Enterobacteriaceae.

1.2. Колибактериоз протекает в септической (колисептицемия) или энтеритной (колидиарея) формах; у поросят-отъемышей еще и форме отечной болезни (колиэнтеротоксемия) или колидиареи, у птиц - в септической форме. При септической форме возбудитель локализуется в крови, внутренних органах и тканях, кишечнике и регионарных брыжеечных лимфатических узлах; при энтеритной форме - в кишечнике и брыжеечных лимфатических узлах; при отечной болезни поросят - в тонком отделе кишечника, брыжеечных лимфатических узлах, реже - в паренхиматозных органах.

1.3. Ведущая роль в развитии колидиареи новорожденных телят, поросят и ягнят принадлежит энтеротоксигенным штаммам эшерихий с адгезивными антигенами К88, К99, 987Р, F41, F18, А20. Отечную болезнь поросят обусловливают эшерихии, продуцирующие вероцитотоксин VT2 и образующие адгезивный антиген F18a,b; в преобладающем большинстве случаев эти бактерии обладают гемолитическими свойствами. За счет адгезивных антигенов происходит прикрепление бактерий к эпителиальным клеткам ворсинок тонкого отдела кишечника и интенсивное их размножение (колонизация), приводящие к развитию воспалительного процесса и гибели клеток с последующим проникновением эшерихий в регионарные лимфатические узлы, а иногда и в кровоток. Диарею животных с признаками геморрагического гастроэнтерита вызывают эшерихии серологических вариантов (сероваров) О157:Н7 и О157:Н-, образующие шигоподобные вероцитотоксины.

1.4. Диагноз на колибактериоз в хозяйствах устанавливают на основании эпизоотологических данных (возраст заболевших животных, массовость поражения, стационарность и пр.), клинических признаков болезни, патолого-анатомических изменений и результатов бактериологического исследования материала от больных, павших или убитых с диагностической целью животных.

1.5. При бактериологической диагностике колибактериоза проводят выделение чистой культуры возбудителя болезни и изучение его морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных, антигенных, патогенных, а при подозрении на отечную болезнь поросят - еще и гемолитических свойств.

2. Материал для исследования

2.1. Для посмертной бактериологической диагностики колибактериоза в лабораторию направляют 2-3 свежих трупа или убитых с диагностической целью больных животных (желательно не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами). В случае невозможности доставки целого трупа в лабораторию направляют от телят, ягнят и поросят долю печени с желчным пузырем; сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов и аорты; селезенку, пораженный участок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух, концов лигатурой, с 2-3 пакетами регионарных лимфатических узлов, голову, трубчатую кость. Кишечник вместе с регионарными лимфатическими узлами упаковывают отдельно в полиэтиленовый пакет.

2.2. Для прижизненной бактериологической диагностики колибактериоза в лабораторию направляют фекалии больных диареей животных (не менее чем от 5 животных с одной фермы), не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий массой 1-2 г от каждого больного животного берут во время дефекации или из прямой кишки в стерильные пробирки с помощью прокипяченного резинового катетера, обвертывают их ватой и вместе с сопроводительной запиской упаковывают в пенал, коробку или полиэтиленовый пакет. При невозможности быстрой доставки проб фекалий в лабораторию (через 3-4 часа после взятия) их консервируют глицериновым раствором в соотношении 1:2 (приложение 2).

2.3. Для диагностики колибактериоза птиц в лабораторию направляют из неблагополучных птичников по 3-5 свежих трупа и 3-4 цыпленка с клиническими признаками болезни. Больную птицу убивают в лаборатории и подвергают бактериологическому исследованию.

3. Порядок исследования материала

Бактериологическое исследование проводят в соответствии с прилагаемыми ниже схемами.

3.1. Первый день - посевы из паренхиматозных органов, костного и головного мозга, брыжеечных лимфатических узлов, соскобов со слизистой тонкого кишечника павших и убитых животных делают на подсушенную среду Эндо или Левина, а также на плотную среду с сорбитом (сорбитолом) для обнаружения эшерихий сероваров 0157:Н7 и 0157:Н-. Посевы проводят путем проведения разрезанной поверхности кусочка органа (из предварительно профламбированного участка) по поверхности питательной среды или отпечатков разрезанной поверхности органа. Кровь, костный мозг, желчь наносят на поверхность среды пастеровской пипеткой и равномерно растирают их стеклянным шпателем.

При исследовании трупов птиц посевы делают из крови сердца, легких, печени, костного или головного мозга на среду Эндо или Левина. От погибших поросят-отъемышей с признаками отечной болезни или диареи проводят посевы суспензии из соскобов со слизистой оболочки пораженного участка тонкого кишечника, регионарных брыжеечных лимфатических узлов и паренхиматозных органов.

3.1.1. Каждую пробу фекалий (не более 0,5 г) от больных диареей или соскобов со слизистой кишечника погибших животных, взятую стерильным скальпелем, помещают в отдельную пробирку, содержащую 10 стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия; тщательно размешивают стеклянной палочкой и выдерживают 10-15 мин при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость засевают бактериологической петлей частыми, широкими штрихами на поверхность плотной селективной среды в чашках с целью получения роста изолированных колоний бактерий.

Перед посевом материала на среду Эндо или Левина ее поверхность орошают 1-2 96° спирта-ректификата для задержки роста роящейся формы протея. Невпитавшийся спирт отсасывают пастеровской пипеткой при наклонном положении чашки, после чего среду подсушивают в термостате в течение 10-15 мин, а затем используют для посева. Засеянные чашки помещают в термостат (37°С) на 18-24 часа.

3.2. Второй день - извлеченные из термостата чашки с культурами на агаре Эндо или Левина просматривают и отбирают 10 типичных для эшерихий колоний (5 - выросших после посева фекалий или соскобов со слизистой кишечника и 5 - из других органов и тканей, в том числе брыжеечных лимфатических узлов): круглые с гладкой, выпуклой поверхностью, ровными краями диаметром 2-4 мм, красно-малинового цвета на агаре Эндо и темно-фиолетового цвета на агаре Левина с металлическим блеском или без него, а затем нумеруют их. Из отобранных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. При наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек с закругленными концами, не образующих спор, расположенных одиночно и попарно, пересевают эти колонии на пластинчатый МПА и среду Минка в чашках, разделенных карандашом для стекла на 10 секторов (каждую колонию на две среды и соответствующий пронумерованный сектор). При этом в обязательном порядке пересевают лактозоположительные колонии, имеющие слизистую тягучую консистенцию, если такие колонии содержатся в культуре.

С чашек с культурами на среде с сорбитом, выделенных из разных органов и тканей животного, отбирают 3-4 колонии, характерные по структуре и цвету для эшерихий сероваров 0157:Н7 и 0157:Н- (средних размеров S-формы, серовато-белого цвета). Из этих колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. В случае типичных для эшерихий клеток бактерий указанные колонии пересевают в пробирки со скошенным МПА.

При исследовании на отечную болезнь поросят дополнительно пересевают с агара Эндо или Левина 5-6 колоний на кровяной агар в чашке, разделенной на соответствующее количество секторов, для изучения гемолитических свойств культур.

Лактозоположительные колонии на плотной селективной среде (Эндо или Левина), выросшие после посева материала от птиц, не пересевают на пластинчатый МПА и среду Минка. Для родовой и видовой идентификации культур и изучения их свойств отбирают 2-3 типичные для эшерихий колонии (с культур, выделенных из разных органов и тканей одной погибшей или убитой с диагностической целью птицы), из которых готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. При наличии в мазках морфологически характерных для эшерихий клеток бактерий пересевают эти колонии на скошенный МПА или среду Олькеницкого, или другую комбинированную среду.

Во всех случаях засеянные чашки и пробирки помещают в термостат (37°С) на 16-20 часов.

3.3. Третий день - полученные на пластинчатом и скошенном МПА, а также кровяном МПА культуры (обладающие гемолитическими свойствами) в количестве двух-трех от каждого животного и выделенные из разных органов и тканей или фекалий подвергают изучению по биохимическим тестам с целью родовой и видовой идентификации. Для этого их засевают на среды Гисса с глюкозой, лактозой и индикатором Андреде, среду с мочевиной, агар Симонса, среду с сернокислым железом (тест на сероводород), бульон Хоттингера или МПБ (тест на индол), а также в 2 пробирки со скошенным МПА для определения серогрупповой принадлежности или изучения патогенных свойств культур в биопробе (в случае необходимости).

Для идентификации культур по ферментативным свойствам можно использовать комбинированные среды (Олькеницкого, Клиглера или др.), полужидкие среды с сахарами и индикатором ВР, бумажные диски СИБ или системы мультимикротестов.

Засеянные пробирки инкубируют при 37°С в течение 48 часов, ежедневно учитывая изменения в средах.

3.4. Четвертый день - проводят предварительный учет результатов изучения ферментативных свойств культур. Бактерии рода Escherichia ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу (за исключением отдельных штаммов), не растут на агаре Симонса и не утилизируют цитратно-аммонийные соли, не расщепляют мочевину, образуют индол и не образуют сероводород.

Схема
бактериологического исследования патологического материала на колибактериоз животных

Схема
бактериологического исследования патологического материала на колибактериоз птиц

Культуры, отклоняющиеся по отдельным ферментативным свойствам от бактерий рода Escherichia, подвергают дополнительному изучению в соответствии с тестами и дифференциальной схемой, изложенными в "Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями", утвержденными Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 11 октября 1999 г.

Изоляты, отнесенные к виду Escherichia coli, исследуют в РА на стекле с агглютинирующими антиадгезивными колисыворотками: вначале с комплексной, а в случае положительной реакции - с моновалентными сыворотками. При этом культуры, выросшие на пластинчатом МПА, изучают с сыворотками К88, 987Р и А20; культуры на среде Минка - с сыворотками К99, F41, F18. РА проводят в соответствии с действующим наставлением по применению указанных сывороток.

3.4.1. Обнаружение эшерихий с адгезивными антигенами можно проводить ускоренным методом согласно "Методическим указаниям по ускоренной индикации морганелл, сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий с адгезивными антигенами в патологическом материале, кормах и объектах внешней среды в реакции коагглютинации", утвержденными Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 11 октября 1999 г. (приложение 3). Для приготовления коагглютинирующих диагностикумов используют 6 типов агглютинирующих антиадгезивных сывороток, указанных в п. 3.4.

3.4.2. Культуры эшерихий на скошенном МПА, полученные после пересева серовато-белых колоний на среде с сорбитом (не ферментирующие этот многоатомный спирт), исследуют с агглютинирующей колисывороткой 0157 в РА на стекле. Реакцию ставят с живыми культурами. При положительной реакции для исключения самоагглютинации клеток бактерий культуру исследуют с 0,85%-ным раствором хлорида натрия. В контроле с физиологическим раствором агглютинация бактерий должна отсутствовать.

3.4.3. Культуры эшерихий, не агглютинирующиеся с моновалентными антиадгезивными колисыворотками и колисывороткой серогруппы 0157, подвергают исследованию на патогенность в биопробе на белых мышах (или цыплятах) или серологическому типированию по 0-антигену с набором поливалентных и серогрупповых О-колисывороток в соответствии с действующим наставлением по применению этих сывороток.

Для биопробы используют две культуры на скошенном МПА, выделенные из разных органов и тканей или фекалий одного животного. Каждую культуру смывают 0,85%-ным стерильным раствором хлорида натрия, готовят суспензии в концентрации 1 млрд микробных по оптическому или бактерийному стандарту, затем смешивают их в равном объеме и вводят смесь бактерий внутрибрюшинно по 0,5 трем белым мышам массой 14-16 г или трем цыплятам 2,5-3-недельного возраста (при исследовании материала от птиц). При определении патогенности культур, выделенных от птиц, для биопробы используют культуры, выделенные от двух-трех цыплят каждого птичника. Наблюдение за зараженными мышами и цыплятами проводят в течение трех суток.

3.5. Пятый день - проводят окончательный учет результатов изучения ферментативных свойств культур, предварительный учет результатов биопробы и определение серогрупповой принадлежности культур эшерихий с поливалентными и моновалентными О-колисыворотками в РА на стекле (в случае необходимости).

Для РА используют 2-3 культуры эшерихий на скошенном МПА, которые не агглютинировали с колисывороткой О157. С этих культур готовят суспензии в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, переливают их в чистые сухие пробирки, устанавливают концентрацию бактерий 2-3 млрд микробных , а затем часть суспензии (1,5-2 ) переливают еще в одну чистую сухую пробирку. Пробирки с суспензиями одних и тех же культур бактерий маркируют одноименными номерами, после чего их подвергают термической обработке: прогреванию в водяной бане (100°С) в течение 1 часа (большую часть суспензии) и автоклавированию (меньшую часть суспензии) при 1 атм (121°С) в течение 2 часов с целью разрушения поверхностного термостабильного А-антигена, содержащегося у некоторых штаммов эшерихий серогрупп О8, О9, О101. РА с колисыворотками этих серогрупп ставят с прогретыми при 100°С и автоклавированными антигенами.

3.6. Шестой день - проводят предварительный учет результатов биопробы, постановку пробирочной РА с антигенами эшерихий, давшими положительную реакцию в РА на стекле.

3.7. Седьмой день - окончательный учет результатов определения патогенных свойств культур эшерихий в биопробе на мышах или цыплятах и серогрупповой типизации культур в пробирочной РА. Культуры, отнесенные к одной из патогенных серогрупп или вызывающие гибель двух и более мышей или цыплят, считают патогенными и признают возбудителями колибактериоза.

4. Оценка результатов бактериологического исследования

4.1. Бактериологический диагноз на колибактериоз считается установленным в каждом из следующих случаев:

- выделения чистых культур эшерихий не менее чем из двух таких органов и тканей как: селезенки, крови сердца, костного мозга, головного мозга свежего трупа или убитого клинически больного животного без определения их патогенности для белых мышей или цыплят и установления серогрупповой принадлежности;

- выделения из исследуемого материала культур эшерихий, содержащих какой-либо из следующих адгезивных антигенов: К88, К99, 987Р, F41, F18, A20;

- выделения из патологического материала культур эшерихий, относящихся к патогенным серогруппам или обладающих патогенностью для белых мышей или цыплят;

- выделения культур эшерихий от поросят-отъемышей, погибших с признаками отечной болезни, из содержимого тонкого отдела кишечника и брыжеечных лимфатических узлов, обладающих гемолитическими свойствами.

4.2. Результаты бактериологического исследования формулируют: "Из присланного материала (указать какого) выделен возбудитель колибактериоза" (указать тип адгезивного антигена или серогруппу в случае их установления) или "Из присланного патологического материала (указать какого) возбудитель колибактериоза не выделен".

4.3. Общий срок бактериологического исследования патологического материала до 7 суток.

Зам. руководителя Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации

В.В. Селиверстов