Методические указания "Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды" (документ не действует)

Методические указания "Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды"

1. Общие положения

1.1. Сальмонеллезы - инфекционные заболевания человека, животных и птиц, вызываемые возбудителем рода Salmonella семейства Enterobacteriaceae. Этот род включает один вид, который подразделяют на семь подвидов. Патогенностью для теплокровных обладают в основном сальмонеллы I и II подвидов, реже - остальных подвидов.

Несмотря на выраженную полипатогенность, в большинстве случаев у человека заболевание вызывает S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi C; у крупного рогатого скота - S. dublin; у мелкого рогатого скота - S. abortusovis; у лошадей - S. abortusequi; у свиней - S. choleraesuis, S. typhisuis; у кур - S. gallinarum-pullorum и т.д. Некоторые виды сальмонелл без каких-либо клинических проявлений болезни могут в течение некоторого времени находиться в организме животного, способствуя обсеменению окружающей среды и продуктов животного происхождения. Чаще такое явление отмечают у птиц.

1.2. Сальмонеллы - грамотрицательные палочки, подвижные (кроме S. gallinarum-pullorum), при ферментации глюкозы выделяют газ (кроме S. typhi, S. typhisuis и некоторых штаммов других сероваров). Идентификацию сальмонелл внутри семейства энтеробактерий проводят с помощью биохимических тестов (приложение 1).

1.3. Сальмонеллы внутри рода идентифицируют по антигенной структуре, выявляемой в реакции агглютинации на стекле с монорецепторными O- и H-агглютинирующими сыворотками.

У сальмонелл различают два основных антигенных комплекса: O-антиген - соматический и H-антиген - жгутиковый (отсутствует у неподвижных штаммов). Последний имеет две фазы. Некоторые сальмонеллы обладают еще vi-антигеном.

В настоящее время известно более 2200 серологических вариантов сальмонелл, каждый из которых характеризуется определенной комбинацией O- и H-антигенов, что позволяет определить серовар возбудителя.

1.4. Сальмонеллы достаточно устойчивы во внешней среде (pH 4-9, температурный режим 7-45°С), способны длительно сохраняться в почве, навозе, воде и пищевых продуктах; хорошо растут на обычных питательных средах (оптимальная температура 37°С, pH - 7,0-7,4). Кипячение убивает сальмонелл мгновенно, при 80°С они сохраняют жизнеспособность до 15 мин.

1.5. Болезнь проявляется у человека в виде гастроинтестинальной и генерализованной форм. Кроме того, человек может быть носителем острого, транзиторного или хронического сальмонеллеза. У животных и птиц наблюдаются первичные и вторичные сальмонеллезы, а также сальмонеллоносительство.

2. Показания к исследованию

Исследование на сальмонеллез проводят с целью диагностики заболеваний людей и животных, выявления сальмонеллоносительства, обсемененности объектов внешней среды, а также при расследовании вспышек заболеваний и анализе эпидемической и эпизоотической ситуации.

3. Взятие и пересылка материалов для исследования

3.1. Для исследования на наличие сальмонелл у человека отбирают испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка, кровь, мочу, а при наличии специальных показаний - желчь, дуоденальное содержимое, спинномозговую жидкость и секционный материал.

3.2. Для бактериологического исследования от трупов животных отбирают паренхиматозные органы или части их (печень с желчным пузырем и лимфатическими узлами, селезенку, почку, мезентериальные лимфатические узлы, трубчатую кость, сердце, перевязанное лигатурой у основания аорты). Погибшие в 12-18-дневном возрасте эмбрионы птиц (до 30 шт.) и павшую птицу (до 10 гол.), абортированные плоды с плодовыми оболочками и околоплодной жидкостью, а также свежие трупы мелких животных направляют в лабораторию целиком. При подозрении на хроническую форму, кроме перечисленных органов, от телят берут измененные участки легких, от кур - измененные фолликулы яичника.

Для установления сальмонеллоносительства исследуют печень, селезенку, фолликулы.

Материалом для прижизненной диагностики служат фекалии больных животных.

3.3. Объектами исследования являются и остатки пищи, употребляемой заболевшими, а также исходные продукты и полуфабрикаты, которые использовали при ее приготовлении; суточные пробы готовой пищи, корма животного и растительного происхождения, смывы с различного оборудования и других предметов, подозреваемых в качестве источника или фактора передачи возбудителя.

3.4. Патологический материал следует доставлять в лабораторию в возможно короткий срок, но не позднее 12 ч после отбора, испражнения (фекалии) - не позднее 3-4 ч; кровь высевают у постели больного.

В случае невозможности доставки в установленные сроки материал посылают в консервированном виде (приложение 3). Консервированный материал до исследования хранят при 4-6°С не более 24 ч. Патологический материал от животных допускается направлять в замороженном виде - в термосе со льдом.

При отборе проб необходимо исключить возможность контаминации их за счет смежных областей кожи, других органов, внешней среды и т.п.

3.4.1. Испражнения (фекалии) собирают сразу после дефекации (у животных - из последней порции) с помощью стерильной стеклянной палочки или деревянного шпателя. При наличии патологических примесей (слизь, кровь, гной и т.п.) их включают в отбираемую пробу. В случае невозможности получения испражнений после дефекации материал берут непосредственно из прямой кишки с помощью ректального тампона, вводя его в кишку на 8-10 см.

При профилактических обследованиях здоровых лиц на сальмонеллоносительство накануне взятия испражнений для исследования можно применить солевое слабительное (25-30 г магнезии сульфата - ), растворенное в теплой воде. Не принимается для исследования на сальмонеллоносительство материал, взятый на дому в отсутствие медицинского работника.

3.4.2. Кровь для исследования берут в начале заболевания, а также повторно в период лихорадки или в разгар рецидивов стерильным шприцем из локтевой вены в объеме 2-10 мл (в зависимости от возраста); в более поздние сроки или при слабовыраженной клинической картине - 15-20 мл. Взятую кровь высевают у постели больного.

У детей до одного года кровь берут в доступных количествах из пальца, пятки или мочки уха.

3.4.3. Рвотные массы и промывные воды желудка отбирают при заболевании, сопровождающемся соответствующей симптоматикой, в объеме до 100 мл. Для исследования используют первые порции промывных вод, полученные без применения дезинфицирующих средств.

В случае кислой реакции рвотных масс их перед посевом нейтрализуют 10%-ным раствором бикарбоната натрия, промывные воды центрифугируют 15 мин при 3000 об./мин и в дальнейшем используют осадок. В случае невозможности центрифугирования допускается высев нативного материала.

3.4.4. Желчь (дуоденальное содержимое) собирают в стерильные пробирки. При этом отдельно собирают дуоденальное содержимое, пузырную желчь и желчь из желчных протоков (порции A, B и C соответственно).

Кислая реакция, белесоватый оттенок, наличие хлопьев свидетельствуют о примеси желудочного сока и делают материал непригодным для бактериологического исследования.

3.4.5. Мочу для исследования собирают после тщательного туалета. Первую порцию мочи не берут для анализа, остальную в количестве 20-30 мл собирают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию. Мочу центрифугируют 15 мин при 3000 об./мин. Для исследования используют осадок. Допускается высев нативного материала.

3.4.6. Спинномозговая жидкость подлежит исследованию при наличии менингеального или менингоэнцефалитического синдромов.

Пробу (3-5 мл) помещают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию, предохраняя материал от замораживания (можно использовать термос).

3.4.7. Операционный и секционный материал для исследования отбирают в случае необходимости при оперативных вмешательствах или на месте вскрытия. Масса пробы должна быть не менее 20 г.

3.4.8. Остатки консервов направляют в лабораторию непосредственно в той банке, из которой их использовали в пищу. При отсутствии остатков консервов исследованию подлежит содержимое 2-5 невскрытых банок с аналогичной маркировкой.

3.4.9. Мелкую рыбу отбирают в количестве 2-3 шт., у крупной вырезают 3-4 куска из спинки, ближе к голове, и из участков около анального отверстия общей массой не менее 200 г.

3.4.10. Солонину и соленые продукты, находящиеся в бочечной таре, берут сверху, из середины и со дна бочки. Общая масса пробы должна быть не менее 200 г. В отдельную посуду набирают 100-200 мл рассола.

3.4.11. Пробы жидких и полужидких продуктов и кормов (супы, соусы, заменитель цельного молока - ЗЦМ) отбирают после тщательного перемешивания в количестве около 200 г.

Молочные продукты заводского приготовления доставляют в лабораторию в оригинальной упаковке, прочие - в объеме до 200 мл.

3.4.12. Суточные пробы направляют для исследования непосредственно в той посуде, в которой они хранились в холодильнике. Остатки фактически употребленной пищи отбирают в той посуде, в которой их обнаружили.

Допускается доставка этих проб в стерильных банках, куда их перекладывают с соблюдением асептики.

3.4.13. Пробы мяса животных для исследования отбирают по ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы бактериологического анализа", мяса птицы - по ГОСТ 7702.2-74 "Мясо птицы. Методы бактериологического анализа".

3.4.14. Яйца отбирают по 5 шт. из шести разных мест обследуемой партии; в первую очередь берут яйца, хранившиеся более 7 дней.

3.4.15. При отборе проб яичного порошка руководствуются ГОСТ 2858-82 "Яичный порошок", меланжа - ОСТ 49197-83 "Продукты яичные мороженые".

3.4.16. Отбор проб комбикормов и сырья, используемого при его производстве (кроме зерна), проводят по ГОСТ 13496.0-80 "Комбикорма, сырье. Методы отбора проб", зерна - по ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", мясокостной муки - по ГОСТ 25311-82 "Мука кормовая животного происхождения. Методы бактериологического анализа".

3.4.17. Для исследования сухого ЗЦМ отбирают из пяти мешков одной партии по 80-100 г продукта, который тщательно перемешивают и помещают в стерильную банку. Всего отбирают 4-5 сборных проб ЗЦМ.

3.4.18. Отбор проб смывов осуществляют стерильными ватными или ватно-марлевыми тампонами. Тампоны монтируют на деревянной палочке или проволоке, пропущенной через пробку, помещают в пробирку и стерилизуют 30 мин при температуре 120°С. Затем в каждую пробирку наливают 2 мл предварительной среды обогащения - забуференной пептонной воды pH 7,0 (приложение 3). Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют, наклоняя пробирку, излишек влаги отжимают о стенку пробирки.

Смывы берут с площади не менее 100 , если нет специальных указаний для данного объекта.

При взятии смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц.

3.4.19. При отборе стоков животноводческих объектов смывы делают со стенок и дна навозного желоба у приямка, как указано в п. 3.4.18.

При наличии гидросмыва тампон, не увлажняя предварительной средой обогащения, погружают в жидкую навозную массу на 2-3 мин, после чего помещают в пробирку с 2 мл предварительной среды обогащения.

3.4.20. Порядок отбора смывов, перечень объектов, с которых их отбирают, и материал, подлежащий исследованию, на предприятиях, производящих, перерабатывающих, хранящих и реализующих животноводческую продукцию, приведен в приложении 9.

3.5. Материал, подлежащий исследованию, помещают в стерильную посуду (банки, пробирки, флаконы), новые полиэтиленовые пакеты, стерильную пергаментную бумагу, тщательно укупоривают и упаковывают.

Пробы можно брать в стаканы или банки, прокипяченные 15 мин. Обработка посуды дезинфицирующими средствами не допускается.

Каждую пробу снабжают этикеткой с наименованием материала и источника его получения (фамилия обследуемого, хозяйство, ферма и т.д.).

В сопроводительном документе необходимо указать, какое учреждение направляет материал, фамилию, имя, отчество и возраст обследуемого, место работы (для детей - название детского учреждения или школы), дату заболевания, предполагаемый диагноз или показания к обследованию, дату и час взятия пробы материала, фамилию и должность лица, посылающего материал. При направлении проб продуктов и объектов внешней среды дополнительно указывают, какой из продуктов подозревается в качестве причины заболевания.

Сопроводительные документы к материалу о животных составляют в соответствии с действующими "Правилами взятия патологического материала, крови, кормов и пересылки их для лабораторного исследования".

4. Микробиологический метод исследования

4.1. Подготовка материалов к исследованию.

Доставленные в лабораторию пробы высевают в пробирки (колбы) со средой обогащения и на чашки Петри с дифференциально-диагностическими средами.

Исследуемый материал, высеваемый на чашки Петри, растирают шпателем по всей поверхности среды.

Засеянные пробирки и чашки помещают в термостат при 37°С на 16-20 ч.

4.1.1. Операционный и секционный материал массой не менее 20 г растирают в ступках и высевают в одну из сред обогащения (предпочтительнее селенитовую или магниевую) в отношении 1:5. Допускается одновременный высев суспензии материала в среду обогащения и на дифференциально-диагностические среды.

4.1.2. При диагностике сальмонеллезов животных исследуемый материал - паренхиматозные органы (кроме печени), кровь, желчь, костный мозг, содержимое фолликулов яичников кур, околоплодную жидкость абортированного плода, хориоаллантоисную жидкость и содержимое желточного мешка замерших эмбрионов - высевают пастеровской пипеткой непосредственно на чашки Петри с одной из дифференциально-диагностических сред (приложение 3).

Печень (целиком или не менее 20 г) растирают в ступке с небольшим количеством физиологического раствора; 0,1 г полученной суспензии высевают на дифференциально-диагностические среды и одновременно на МПА и в МПБ.

В связи с тем что S. abortusovis плохо растет на обычных питательных средах, высевы из абортированных плодов овец необходимо делать также и на сывороточно-глюкозные среды.

При исследовании на сальмонеллоносительство животных и реагирующей по кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации (ККРНГА) птицы, выявленной в порядке эпизоотологического надзора, суспензию материалов и органов высевают в одну из сред обогащения (п. 4.1.1).

Одновременно проводят микроскопическое исследование методом световой микроскопии. Мазки-отпечатки делают из тех же органов и окрашивают по Граму.

4.1.3. Клинический материал высевают на две-три дифференциально-диагностические среды (комбинируя высоко- и низкоселективные среды) и в пробирки со средой обогащения одновременно.

Испражнения, доставленные в фосфатно-буферном растворе, высевают в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1. Фекалии, доставленные в глицериновом консерванте, высевают на обычную среду обогащения в соотношении 1:5. Испражнения, доставленные без консерванта, суспендируют в среде обогащения в соотношении 1:5. Из суспензии делают высев на дифференциально-диагностические среды, оставшуюся часть инкубируют в термостате.

Кровь, взятую из вены, высевают в среду Рапопорт или 10-20%-ный желчный бульон в соотношении 1:10. После 16-20 ч инкубирования делают высев на одну из селективных сред. При отрицательном результате делают повторные посевы на 3-и, 4-, 6- и 10-е сутки.

Рвотные массы, осадки промывных вод желудка и мочи после центрифугирования высевают в среды обогащения. В случае исследования материала без центрифугирования посев проводят в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1 и после 16-20 ч инкубирования делают высев на дифференциально-диагностические среды.

Каждую фракцию желчи (дуоденального содержимого) высевают во флаконы со слабощелочным бульоном в соотношении 1:10 и на дифференциально-диагностические среды. Через 16-20 ч из флаконов осуществляют высев на дифференциально-диагностические среды. В случае получения отрицательных результатов высев повторяют на 3-и, 5-, 7-е сутки, используя среды слабой селективности. Спинномозговую жидкость высевают в желчный бульон для обогащения и на слабоселективные среды.

4.1.4. При исследовании проб продуктов и кормов делают навеску массой 25 г.

Пищевые продукты, бактериологическое исследование которых проводят в соответствии с требованиями "Микробиологических нормативов и методов анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов" (М., 1988), "Нормативов и методов микробиологического контроля продуктов детского питания, изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения" (М., 1988), "Медико-биологических требований к качеству продовольственного сырья и пищевых продуктов" (М., 1989), берут для исследования в количестве, предусмотренном в указанных документах.

Пробы пищевых продуктов высевают в предварительную среду обогащения в соотношении 1:5, кормов - 1:5 - 1:10 в зависимости от способности к набуханию.

Продукты плотной консистенции гомогенизируют с небольшим количеством предварительной среды обогащения, которую затем добавляют в количестве, обеспечивающем соотношение 1:5.

Крем, сливочное масло, мороженое и т.п. перед посевом расплавляют в водяной бане.

Жидкие объекты, имеющие кислую реакцию, перед посевом нейтрализуют 10%-ным стерильным раствором бикарбоната натрия до слабощелочной реакции.

При исследовании яиц скорлупу обрабатывают спиртом и обжигают, после чего яйца разбивают и отделяют желток в стерильную посуду, объединяя пять желтков одной пробы. Желтки гомогенизируют и используют для посева.

Пробы мяса животных и птиц, яичного порошка, меланжа и консервы в закрытых банках исследуют согласно действующим ГОСТам.

Пробы кормов в предварительной среде обогащения инкубируют 5 ч в термостате, после чего взбалтывают, отстаивают. Надосадочную жидкость пересевают в соотношении 1:5 во вторую среду обогащения (любая среда из приведенных в Приложении 3) и помещают в термостат. Разбухшие корма растительного происхождения заливают второй средой обогащения так, чтобы она покрыла поверхность пробы.

4.1.5. Смывы, помещенные в предварительную среду обогащения, инкубируют в термостате.

4.2. Операционный и секционный материал из среды обогащения после инкубирования в термостате пересевают на дифференциально-диагностические среды.

Посевы проб продуктов и смывов в предварительной среде обогащения после инкубирования в термостате пересевают во вторую среду обогащения: 10 мл среды, засеянной пробой продукта, вносят в колбу с 90 мл второй среды обогащения, а в пробирку с посевом смыва добавляют 10 мл этой среды.

Для исследования молока лучше использовать среду Мюллера.

При расследовании вспышек болезни целесообразно проводить параллельный высев исследуемого материала на две среды обогащения.

Через сутки инкубирования в термостате делают высев из второй среды обогащения на дифференциально-диагностические среды.

4.3. Посевы на дифференциально-диагностических средах инкубируют в термостате 18-20 ч при температуре 37°С, после чего просматривают невооруженным глазом или с помощью лупы в проходящем дневном или искусственном свете (посевы на чашках Петри с висмут-сульфитным агаром просматривают в падающем свете) и отмечают колонии, по морфологическим свойствам похожие на сальмонеллезные.

При этом имеют в виду, что сальмонеллы на средах Эндо и Плоскирева растут в виде прозрачных колоний, на среде Левина - голубоватых, на висмут-сульфитном агаре - черных колоний с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют S. paratyhi A, S. choleraesuis, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum и некоторые другие, которые при работе на висмут-сульфитном агаре образуют нежные светло-зеленые колонии.

Подозрительные колонии (не менее трех) пересеивают в пробирки со скошенным МПА или одной из комбинированных сред - Олькеницкого, Клиглера, Ресселя (приложение 3).

В случаях чрезвычайной эпидемической ситуации при наличии подозрительных колоний в посевах из продуктов и смывов параллельно с пересевом на комбинированную среду проводят высев на МПА для последующей постановки реакции агглютинации. Результаты этой реакции ориентировочны и требуют подтверждения на этапе завершения биохимической идентификации.

Одновременно изучают морфологию и тинкториальные свойства бактерий, готовя мазки и окрашивая их по Граму.

При отсутствии подозрительных колоний чашки Петри с висмут-сульфитным агаром оставляют в термостате еще на 24 ч, после чего просматривают и при обнаружении подозрительных колоний продолжают исследование.

В противном случае работу с посевами прекращают.

4.4. Посевы на комбинированной среде инкубируют 16-20 ч при температуре 37°С. Затем изучают изменение среды.

Для дальнейшей работы отбирают колонии уреазонегативных бактерий, ферментирующих глюкозу, не ферментирующих сахарозу и образующих сероводород. Такие культуры пересевают со среды Олькеницкого в среду Гисса с маннитом, 1%-ную пептонную воду для определения образования индола и в полужидкий агар для определения подвижности.

При высеве подозрительных колоний на МПА делают пересев в среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой и маннитом, с сернокислым железом, с мочевиной, в 1%-ную пептонную воду, полужидкий агар.

При высеве на среду Ресселя исключают пересев на среды Гисса с глюкозой и лактозой, при высеве на среду Клиглера, кроме того, - на среду с сернокислым железом.

Дополнительно делают высев на МПА для постановки реакции агглютинации.

При обнаружении изменений комбинированной среды, позволяющих заподозрить наличие сальмонелл, дальнейшее исследование материалов от человека проводят согласно таблице (приложение 4).

4.5. При выделении культур, имеющих ферментативные свойства, характерные для представителей рода сальмонелл (приложение 1), изучают их антигенную структуру в реакции агглютинации на стекле с O- и H-агглютинирующими диагностическими сальмонеллезными сыворотками (приложения 5, 6), а также биовары (приложение 10).

По результатам реакции агглютинации дают ответ, исследование прекращают.

4.6. Ход работы при исследовании различных материалов дан в схемах (рис. 1-6).

5. Серологический метод исследования

5.1. Исследование крови человека на сальмонеллез проводят с целью диагностики, а также выявления и дифференциации различных форм бактерионосительства в реакции пассивной гемагглютинации с цистеиновой пробой (приложение 8).

5.2. Для обнаружения у кур антител к возбудителю пуллороза-тифа и другим сальмонеллам группы D используют эритроцитарный антиген в соответствии с наставлением по его применению в кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации (приложение 7).

6. Лабораторный надзор за ситуацией по сальмонеллезам

В целях эпидемиологического и эпизоотологического надзора за сальмонеллезами человека и животных проводят плановые исследования объектов с учетом особенностей и специфики каждого объекта, эпидемиологической ситуации, результатов лабораторных исследований пищевых продуктов и объектов внешней среды.

Перечень объектов, исследуемых материалов и кратность исследования приведены в приложении 9.

7. Организация лабораторных исследований при выяснении возникновения групповых заболеваний сальмонеллезами

7.1. При возникновении подозрения на групповое заболевание сальмонеллезом (большое число заболевших, повышение заболеваемости в ограниченный период времени, установление в анамнезе общего источника инфекции, выделение от пострадавших определенного серовара сальмонелл и т.п.) осуществляют эпидемиологическое расследование, которое включает углубленный эпидемиологический анализ и обследование (включая лабораторные исследования) возможных источников инфекции.

Если в ходе эпидемиологического расследования возникло подозрение, что возможным источником инфекции могут являться сельскохозяйственные животные или птицы, работники санитарно-эпидемиологических станций информируют о создавшейся ситуации представителей государственной ветеринарной службы района, откуда поступили продукты животного происхождения. Дальнейшее расследование проводят совместно обе службы.

В спорных случаях отбор проб продуктов животноводства и на животноводческих объектах, подозреваемых в качестве источника или фактора передачи сальмонелл, ведут совместно специалисты санитарно-эпидемиологической и ветеринарной служб. Исследование таких материалов, идентификация возбудителя и выдача заключения по результатам исследования также ведутся совместно на базе бактериологической лаборатории санитарно-эпидемиологической станции или ветеринарной лаборатории в соответствии с требованиями настоящих методических указаний.

Результаты эпидемиологического, эпизоотологического расследования и лабораторных исследований обобщают и делают заключение о роли определенных источников и факторов передачи инфекции в возникновении вспышки сальмонеллеза.

Разрабатывают комплекс противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий, направленных на ликвидацию заболевания.