Методические указания МУК 4.1.1616-03 "Измерение массовых концентраций (2S,5R,6R)-6-[[(R)-амино-(4-гидроксифенил)ацетил]амино]-3,3-диметил-7-окс о-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты тригидрата (амоксициллина тригидрата) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1616-03
"Измерение массовых концентраций (2S,5R,6R)-6-[[(R)-амино-(4-гидроксифенил)ацетил]амино]-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты тригидрата (амоксициллина тригидрата) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный хроматографический анализ воздуха рабочей зоны на содержание (2S,5R,6R)-6-[[(R)-амино-(4-гидроксифенил)ацетил]амино]-3,3-диметил-7-окс о-4-тиа-1-азабицикло-[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты тригидрата (амоксициллина тригидрата) в диапазоне концентраций от 0,05 до 1 .

2. Характеристика вещества

2.1. Структурная формула

2.2. Эмпирическая формула .

2.3. Молекулярная масса 419,4.

2.4. Регистрационный номер CAS 61336-70-7.

2.5. Физико-химические свойства.

Амоксициллина тригидрат - антибиотик широкого спектра действия из группы полусинтетических пенициллинов, кристаллический порошок белого цвета, 160-180°С, малорастворим в воде и этиловом спирте, практически нерастворим в эфире и жировых маслах, растворим в разбавленных кислотах и разбавленных гидроксидах щелочных металлов, растворим в смеси ацетонитрила и воды при рН 5 (элюенте).

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика.

Амоксициллина тригидрат обладает антимикробным и слабым аллергенным свойствами.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны 0,1 . Класс опасности - второй.

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций амоксициллина тригидрата с погрешностью не более при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерения массовых концентраций амоксициллина тригидрата основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением спектрофотометрического детектора.

Отбор проб проводится с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания амоксициллина тригидрата в хроматографируемом объеме раствора 0,010 мкг.

Нижний предел измерения концентрации амоксициллина тригидрата в воздухе 0,05  (при отборе 400 воздуха).

Определению не мешают сопутствующие вещества (целлюлоза микрокристаллическая, титана диоксид, поливинилпирролидон низкомолекулярный, магний стеариново-кислый, оксипропилцеллюлоза).

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" со спектрофотометрическим детектором при длине волны 254 нм
Хроматографическая колонка стальная КАХ-44-3, 50х2 мм, заполненная сорбентом Сепарон С18, фракция 5 мкм
Весы аналитические ВЛА-200	ГОСТ 24104-88Е
Пробоотборное устройство ПУ-3Э	ТУ 4215-000-11696625-95
Фильтродержатель	ТУ 95.72.05-77
Устройство для фильтрации жидкостей НПФ "Биохром"
Колбы мерные, вместимостью 50, 100 и 500	ГОСТ 1770-74Е
Цилиндры мерные, вместимостью 100	ГОСТ 1770-74Е
Пипетки, вместимостью от 1 до 10	ГОСТ 29227-91
Бюксы 50/30	ГОСТ 25336-82Е
Пробирки с пришлифованными пробками, вместимостью 10	ГОСТ 25336-82Е
Фильтры АФА-ВП-10	ТУ 95-743-80
Фильтры "Владипор" типа ММФК-1Г	ТУ 6-05-221-433-79

5.2. Реактивы

Амоксициллина тригидрат, N регистрации 005523 от 25.11.94, содержание основного вещества не менее 95 и не более 105% в пересчете на безводное вещество
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии	ТУ 6-09-14-2167-84
Калий дигидрофосфат, хч	ГОСТ 4198-75
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 6552-58
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72

Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данных методических указаний.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противипожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускаются лица с высшим и средним специальным образованием, имеющие навыки работы на жидкостном хроматографе.

8. Условия измерений

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха , атмосферном давлении 84-106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

8.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерения

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Стандартный раствор N 1 амоксициллина тригидрата в растворе элюента концентрацией 400 готовится растворением 20 мг вещества в мерной колбе вместимостью 50 .

9.1.2. Стандартный раствор N 2 амоксициллина тригидрата в растворе элюента концентрацией 40 готовится разбавлением стандартного раствора N 1. Растворы устойчивы в течение месяца при хранении в холодильнике.

9.1.3. Раствор дигидрофосфата калия концентрацией 0,05 М готовят растворением 1,36 г указанной соли в 200 дистиллированной воды в колбе данного объема.

9.1.4. Раствор элюента готовят смешением в мерной колбе на 100 95 0,05 М раствора дигидрофосфата калия и 5 ацетонитрила, который прибавляют пипеткой. Раствор доводят до pH 5 ортофосфорной кислотой. Непосредственно перед измерением раствор фильтруют с помощью устройства для фильтрации и фильтров "Владипор" и дегазируют под вакуумом.

9.2. Подготовка прибора

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме раствора, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием серии градуировочных растворов, которые готовят разбавлением стандартного раствора N 2 в пробирках с пришлифованными пробками согласно табл. 1. Растворы устойчивы в течение недели при хранении в холодильнике.

Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

состав элюента - ацетонитрил-0,05 М дигидрофосфата калия, 5:95, рН 5;

скорость потока элюента 100 ;

объем вводимой пробы 5 ;

длина волны спектрофотометрического детектора 254 нм;

время удерживания амоксициллина тригидрата 3 мин.

Растворы помещают в пробоотборное устройство хроматографа.

На полученной хроматограмме измеряют площади пиков с помощью интегратора хроматографа (в условных единицах) при анализе 6 растворов разных концентраций и растворителя, проводя не менее 5 параллельных определений для каждого раствора, и строят градуировочную кривую зависимости площади пика от количества компонента в хроматографируемом объеме пробы (мкг). Проверку градуировочного графика проводят при изменении условий анализа, но не реже 1 раза в месяц.

Таблица 1

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении амоксициллина тригидрата

N стандарта	Стандартный раствор амоксициллина N 2,	Раствор элюента,	Концентрация вещества,	Содержание вещества в хроматографируемом объеме пробы, мкг
1	0	10	0	0
2	0,5	9,5	2	0,01
3	1,0	9,0	4	0,02
4	1,75	8,25	7	0,035
5	2,5	7,5	10	0,05
6	5	5	20	0,1
7	10	0	40	0,2

9.4. Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным расходом 20 аспирируют через фильтр АФА ВП-10. Для измерения 1/2 ПДК амоксициллина тригидрата достаточно отобрать 400 воздуха. Пробы можно хранить в течение трех суток.

10. Выполнение измерения

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс с пришлифованной крышкой и приливают пипеткой 5 раствора элюента. Периодически потряхивая, выдерживают раствор в течение 5 мин и сливают его в пробирку. Аналогичным образом проводят повторную экстракцию с фильтра и объединяют растворы. Степень десорбции с фильтра 94%. Хроматографирование раствора пробы проводят в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов. Количественное определение содержания анализируемого вещества в растворе проводят по предварительно построенному градуировочному графику.

11. Расчет концентрации

Концентрацию амоксициллина тригидрата (С, ) в воздухе вычисляют по формуле:

, где

а - содержание вещества в анализируемом объеме пробы, найденное по градуировочному графику, мкг;

б - объем пробы, взятый для хроматографирования, ;

в - общий объем раствора пробы, ;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, (см. прилож. 1).

12. Оформление результатов анализа

Результат количественного анализа представляют в виде , Р = 0,95, где - характеристика погрешности, .

13. Контроль погрешности методики

Значения характеристики погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2 в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе С.

Таблица 2

Результаты метрологической аттестации методики количественного химического анализа

Диапазон определяемых концентраций амоксициллина,	Наименование метрологической характеристики
	Характеристика погрешности , (Р = 0,95)	Норматив оперативного контроля точности К, (Р = 0,90, m = 2)	Норматив оперативного контроля воспроизводимости D, (P = 0,95, m = 2)
От 0,05 до 1,0	0,003 + 0,17С	0,003 + 0,19С	0,007 + 0,10C

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

13.2. Оперативный контроль воспроизводимости

Оперативный контроль воспроизводимости выполняют в одной серии с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Анализируют в соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа: партии реактивов, наборы мерной посуды и т.д., и получают два результата и анализов. Результаты анализа не должны отличаться друг от друга на величину большую, чем норматив оперативного контроля воспроизводимости D:

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

13.3. Оперативный контроль точности

Оперативный контроль точности выполняют в одной серии с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Затем к одной пробе, отобранной на фильтр, делают добавку анализируемого компонента из раствора, нанося его на фильтр. Величина добавки должна соответствовать 50-150% от содержания компонента в пробе. Результаты анализа без добавки и с добавкой получают по возможности в одинаковых условиях: одним аналитиком, с одной партией реактивов, с одним набором посуды и т.д. Погрешность процедуры отбора проб контролируют путем поверки используемых пробоотборников. Расчет норматива оперативного контроля погрешности К проводят по характеристике погрешности методики за вычетом характеристики погрешности пробоотборника. Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из 6 проб при последовательном отборе проб воздуха требуется 4 ч.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко