Приложение N 2. Приготовление питательных сред

Приложение N 2
к Временной инструкции
по борьбе с вибриозом рыб
от 26 мая 1998 г.

1. Приготовление питательных сред

Основой селективных и элективных питательных сред для культивирования и дифференциации вибрионов является мясо-пептонный бульон (МПБ) в состав которого входят: 50% мясной воды; 1% пептона; 0,5% хлористого натрия; 50% дистиллированной воды.

1.1. Приготовление МПБ.

Мясо крупного рогатого скота, полученное от животных средней упитанности, отделяют от жира, костей и сухожилий, пропускают через мясорубку. Фарш заливают дистиллированной водой из расчета 1:1, доводят до кипения и кипятят в течение 60 мин. После кипячения смесь доводят дистиллированной водой до первоначального объема, фильтруют через ватно-марлевый фильтр в стеклянные бутыли и стерилизуют при 121°С (1 атм) в течение 60 мин. Мясную воду готовят впрок, содержание аминного азота в ней составляет 70-90 мг %.

К мясной воде, разведенной 1:1 водопроводной водой, прибавляют пептон и хлористый натрий. После их растворения к 20 бульона приливают из бюретки 10%-ный раствор соды или едкого натра до слабощелочной реакции. Соответствующим расчетом определяют количество щелочи, необходимое для подщелачивания оставшейся среды, и это количество щелочи вносят в МПБ. Проверив рН МПБ, его кипятят в течение 30 мин, разливают в емкости и стерилизуют при температуре 121°С (1 атм) в течение 20 мин.

1.2. Приготовление мясо-пептонного агара (МПА). К 1 литру МПБ прибавляют соответственно 20,0 грамм агара в волокнах или порошке и 7,5 грамм хлористого натрия, нагревают до растворения, устанавливают рН 7,2-7,4, осветляют, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр и разливают в пробирки или флаконы. Для определения галофильности вибрионов применяют МПА, к которому перед стерилизацией добавляют 1,5; 3,0; 7,0; 10,0% хлористого натрия. Стерилизуют среду при температуре 121°С (1 атм) в течение 30 мин. Готовая питательная среда содержит 60-70 мг % аминного азота, рН 7,4-7,8.

1.3. Приготовление дифференциально-диагностического агара с пенициллином (среда ДДА).

К расплавленному щелочному МПА (рН 8,0-8,6), приготовленному из обычного МПА путем добавления 30 10-процентного раствора углекислого натрия и кипячения в течение 45 мин, остуженному до 45-50°С, добавляют по 1,5% хлористого натрия и сахарозы. Устанавливают рН 8,0-8,2 и стерилизуют при температуре 110-112°С (0,5 атм) в течение 15 мин. После остывания среды до 45-50°С в нее добавляют 1% бромтимолблау (1,6-процентного спиртового раствора) и пенициллин из расчета 5 ЕД/, перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Среду, имеющую сине-зеленый цвет, сохраняют при температуре 4 - 8°С и используют в течение 2 недель.

1.4. Среда Меллера состоит из пептона 5,0 г, мясной воды (1 кг мяса на 1 литр дистиллированной воды) - 5 , бромкрезолпурпура (1,6%)) - 0,6 , крезолрота (0,2%) - 2,5 , D-глюкозы - 0,5 , пиридоксина - 5 мг (можно взять витамин B6), дистиллированной воды до 1000 . Учитывая галофильность вибрионов в среду добавляют 1%) хлористого натрия и устанавливают рН 6-6,2.

Для приготовления среды все компоненты растворяют в дистиллированной воде при нагревании, устанавливают рН среды 6,0 и разделяют на четыре части, в три из которых добавляют по одной аминокислоте - соответственно аргинин, орнитин, лизин. Если аминокислоты в L-форме, тогда достаточно 1%, если - в DL-форме - 2%. После добавления аминокислот, перед стерилизацией устанавливают рН 6,2. Среды разливают по 2-3 в пробирки и стерилизуют при температуре 121°С (1 атм) в течение 10 мин.

1.5. Среда с мочевиной (Кристенсена)

В состав среды входит: пептон - 1,0 г; фосфат калия однозамещенный - 2,0 г; хлористый натрий - 5,0 г; глюкоза - 1,0 г; агар - 20,0 г; мочевина - 20,0 г; фенолрот - 0,012 г; дистиллированная вода 1000 , рН среды 6,8.

Промытый агар расплавляют в воде при нагревании. Затем в среду вносят пептон, соли, глюкозу, доводят ее до кипения и добавляют фенолрот, предварительно растворенный в растворе едкого натрия. Среду в объеме по 5 разливают в пробирки и стерилизуют при температуре 110-112°С (0,5 атм) в течение 20 мин. После охлаждения среды до температуры 50°С в каждую пробирку добавляют по 0,5 20%-нoгo раствора мочевины (20 г мочевины растворяют в дистиллированной воде и кипятят 30 мин на водяной бане). Приготовленную среду скашивают. Цвет среды зеленовато-желтый. При защелачивании цвет среды меняется до красно-фиолетового.