Методические указания по лабораторной диагностике столбняка (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 2 февраля 1983 г.)

1. Общие положения.

1.1. Столбняк - острая инфекционная болезнь животных, вызываемая токсином возбудителя Cl. letani и характеризующаяся судорожными сокращениями мускулатуры.

Возбудитель - строгий спорообразующий анаэроб, представляет собой тонкую грамположительную палочку с закругленными концами и концевым расположением спор.

1.2. Диагноз на столбняк ставят на основании клинических признаков, а также результатов лабораторных исследований.

1.3. Для исследования в лабораторию направляют раневой секрет, кусочки ткани, которые берут из глубоких слоев мест поражения. Для этого подозрительные места освобождают от грязи, обрабатывают спиртом, затем стерильными инструментами делают глубокий разрез и извлекают кусочки пораженной ткани.

От павших животных, кроме материала из мест поражения, берут кровь (5-10 мл), кусочки печени и селезенки.

1.4. Лабораторные исследования проводят в двух направлениях - обнаружение токсина и выделение культуры возбудителя с последующей проверкой ее токсичности.

2. Обнаружение токсина.

2.1. Исследуемый материал растирают со стерильным песком в стерильной ступке, заливают физиологическим раствором в двойном объеме и делят на две части. Одну часть используют для выделения возбудителя; вторую оставляют при комнатной температуре на 1 ч для экстрагирования токсина, после чего ее фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр.

2.2. Фильтратом заражают подкожно в заднюю лапку 2-3 белых мышей массой 16-18 г в дозе 0,5-1 мл или двух морских свинок массой 300-350 г в дозе 3-5 мл.

2.3. При наличии в исследуемом материале столбнячного токсина через 48-96 ч у зараженных животных развиваются признаки заболевания, характеризующиеся техническими сокращениями мышц, вначале отдельных групп, затем всей мускулатуры. Животные погибают в характерной позе с вытянутыми лапками и искривлением позвоночника в сторону лапки, в которую вводили материал.

2.4. Срок наблюдения за зараженными животными - до 10 дн.

2.5. При обнаружении в исследуемом материале столбнячного токсина дальнейшую работу по выделению культуры не проводят.

3. Выделение культуры возбудителя.

3.1. Патологический материал, подготовленный, как указано в п. 2.1, высевают на среду Китта - Тароцци (рН 7,2-7,4) с добавлением 0,5% глюкозы. Среду перед посевом и добавлением глюкозы подвергают регенерации, для этого ее прогревают в кипящей водяной бане в течение 15-30 мин, после чего быстро охлаждают до 45-50°С.

Посевы лучше делать во флаконы емкостью 100-250 мл, которые на две трети заполняют питательной средой. Толщина слоя масла должна быть не менее 0,5 см.

Каждый материал высевают не менее чем в две пробирки или два флакона, один из которых после засева прогревают при температуре ...°С в течение 1 ч. Одновременно делают посев в МПБ и на МПА для контроля на контаминацию материала аэробной микрофлорой.

3.2. Посевы инкубируют в термостате при 37-38°С.

На среде Китта - Тароцци возбудитель столбняка образует интенсивную муть с незначительным газообразованием. Через 48-72 ч наступает просветление бульона, на дне пробирки образуется осадок. Культура издает своеобразный запах жженого рога.

В мазках из культур обнаруживают тонкие грамположительные палочки с круглыми концевыми спорами, так называемые барабанные палочки.

3.3. При получении в первичных посевах характерного роста и обнаружении палочек, морфологически сходных с CI. tetani, культуры выдерживают в термостате и на 4-5-е сутки определяют наличие в них токсина. Исследуемую культуру вводят белым мышам или морским свинкам, как указано в п. 2.2.

3.4. При необходимости выделения чистой культуры возбудителя столбняка первичный посев прогревают в течение 20 мин при 80°С или 2-3 мин при 100°С и делают дробный посев на чашки Петри с кровяным агаром Цейсслера. Чашки помещают в микроанаэростат. Учитывая, что возбудитель столбняка - строгий анаэроб, разрежение воздуха должно быть не выше 4-5 мм рт. ст. Через 2-4 дня культивирования посевы просматривают и отбирают характерные колонии.

На кровяном агаре CI. tetani образует нежные колонии с отростками и приподнятым центром, иногда мелкие круглые колонии. Встречаются отдельные колонии, окруженные зоной гемолиза.

4. Диагноз считается установленным:

при обнаружении столбнячного токсина в исследуемом материале (без выделения культуры);

при выделении из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя столбняка, продуцирующей токсин.

5. Срок исследования - до 15 дн.