Временное наставление по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц в сыворотках крови кур иммуноферментным методом (в порядке широкого производственного испытания в 1998-2000 гг.) (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 2 ноября 1998 г. N 13-7-2/1431)

1. Общие положения

1.1. Набор предназначен для выявления антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц в сыворотках крови кур иммуноферментным методом (ИФА).

1.2. В состав набора входят иммуноспецифические и неспецифические компоненты. Иммуноспецифические компоненты: К1 - гипериммунная сыворотка крови кур к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц (положительный контроль) цельная лиофилизированная, сухая мелкопористая масса белого или светло-желтого цвета, 1.0 куб. см - 1 ампула (флакон), К2 - нормальная сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц, цельная, лиофилизированная, сухая мелкопористая масса белого или светло-желтого цвета, 1.0 куб. см - 1 ампула (флакон), К3 - антиген вируса инфекционного ларинготрахеита птиц адсорбированный по 0,1 куб. см в лунках планшета для ИФА - 2 планшета, К4 - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против igg кур, сухая мелкопористая масса белого цвета, 0,5 куб. см - 1 ампула, рабочее разведение 1:200 (указывается для каждой серии).

Неспецифические компоненты:

К5 - набор солей для приготовления буферного раствора для испытуемых и контрольных проб, антивидового конъюгата и межэтапной промывки (порошки белого цвета): трис (оксиметил) аминометан - 0,97 г (К5.1), трис (оксиметил) аминометан гидрохлорид (трис hcl) - 6,61 г (К5.2), натрий хлористый - 11,7 г (К5.3), - по 1 флакону;

К6 - набор солей для приготовления субстратного буфера, (порошки белого цвета); натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - 5,37 г (К6.1) - 1 флакон, лимонная кислота - 1,57 г (К6.2) - 1 флакон,

К7 - детергент - твин-20, вязкая тягучая маслянистая жидкость соломенно-желтого цвета - 1,0 куб. см - 1 флакон,

К8 - субстрат ортофенилендиамин, таблетка сероватого цвета, 8 мг - 1 шт. во флаконе,

К9 - перекись водорода, прозрачная бесцветная жидкость или гидроперит - таблетка белого цвета, 0.5 г - 1 шт. в упаковке.

1.3. Ампулы (флаконы) с компонентами набора этикетируют с указанием номера флакона, наименования компонента, номера серии и срока годности.

1.4. Ампулы, флаконы без этикеток, с трещинами, с измененной консистенцией подлежат выбраковке, обеззараживанию и утилизации.

1.5. Ампулы (флаконы) с компонентами набора упаковывают в картонные коробки. На коробки с наборами наклеивают этикетки, в которых указывают наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, полное название набора, номер серии, номер госконтроля, дату комплектования набора, условия хранения, срок годности, обозначение ТУ.

Внутрь каждой коробки набора вкладывают наставление по применению набора с перечнем комплектующих компонентов и описанием постановки анализа.

1.6. Срок годности набора 12 мес. со дня изготовления при хранении в защищенном от света месте и температуре от 2° до 8°С.

1.7. Набор рассчитан на проведение 176 анализов сывороток крови кур при исследовании в одном разведении 1:400, при раститровке сывороток двукратным шагом от 1:100 до 1:12800 - на 20 анализов, при раститровке сывороток четырехкратным шагом от 1:100 до 1:12800 - на 200 анализов.

Положительные результаты, полученные при анализе с применением набора, должны быть подтверждены вирусологическими исследованиями для решения вопроса о благополучии птицефермы по инфекционному ларинготрахеиту.

2. Подготовка компонентов набора и оборудования для проведения исследований

2.1. Для постановки ИФА используют:

одно- и восьмиканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками, термостат с температурой нагрева (37,0 +- 0,5)°С, бытовой холодильник, рН-метр (тип 121 или 340), спектрофотометр с вертикальным лучом или ридер любой модели для учета результатов ИФА.

2.2. Приготовление растворов.

Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20)°С.

2.2.1. Раствор N 1. Содержимое флаконов К5.1, К5.2 и К5.3 растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды и измеряют показание рН, которое должно быть в пределах 7,4-7,6.

Затем в этот раствор вносят содержимое флакона К7, получая конечную концентрацию детергента 0,1%. Данный раствор используют для разведения контрольных сывороток, испытуемых проб, антивидового конъюгата и межэтапной промывки. Раствор N 1 хранят не более 20 сут при температуре 4°С.

2.2.2. Раствор N 2. Фосфатно-цитратный буфер рН 4,9-5,0. Для приготовления субстратного буфера содержимое флакона К6.1 растворяют в 50 куб. см дистиллированной воды, содержимое флакона К6.2 растворяют в другой мерной колбе в 50 куб. см дистиллированной воды. Затем смешивают 24,3 куб. см раствора К6.1 с 25,7 куб. см раствора К6.2 и добавляют 50 куб. см дистиллированной воды. Полученный раствор должен иметь рН 4,9-5,0, при необходимости добавляют кислый (К6.2) или щелочной (К6.1) компоненты. Раствор N 2 хранят не более 20 суток при температуре 4°С.

2.2.3. Раствор N 3. Содержимое флакона К1 растворяют в 0,5 куб. см раствора N 1. Готовят перед использованием. Допускается хранение в течение 3 сут. при 4°С.

2.2.4. Раствор N 4. Содержимое флакона К2 с нормальной сывороткой крови кур растворяют в 0,5 куб. см раствора N 1. Раствор N 4 готовят перед использованием, допускается хранение в течение 3 сут при 4°С.

2.2.5. Раствор N 5. Содержимое флакона К4 с антивидовым конъюгатом растворяют в 0,5 куб. см раствора N 1. Для получения рабочего разведения 1:200 из этого флакона отбирают 50 мкл на 10.0 куб. см раствора N 1 (на планшет), рабочее разведение готовят перед использованием.

2.2.6. Раствор N 6. 1 таблетку гидроперита (К9) растворяют в 20,0 куб. см дистиллированной воды.

2.2.7. Раствор N 7. Субстратно-индикаторная смесь. Содержимое флакона К8 (таблетку) растворяют в 20 куб. см раствора N 2, встряхивают до полного растворения и добавляют на каждые 10 куб. см этого раствора по 0.4 куб. см раствора N 6. Готовят раствор N 7 непосредственно перед использованием.

3. Постановка реакции

3.1. Из комплекта набора берут один планшет (К3), в лунках которого адсорбирован антиген вируса инфекционного ларинготрахеита птиц и используют для постановки иммуноферментного анализа.

3.2. Разведение сывороток. Образцы контрольных сывороток и исследуемых проб сывороток крови разводят 1:400 раствором N 1. С этой целью к 0,0025 куб. см сыворотки крови кур добавляют 1,0 куб. см раствора N 1 и перемешивают.

3.3. В лунки планшета от А2-12 ... до Н2-Н12 включительно вносят по 0.1 куб. см исследуемых проб сывороток крови. В лунки В1 и С1 вносят контрольную гипериммунную сыворотку (положительный контроль), а в d1 и Е1 контрольную неиммунную сыворотку (отрицательный контроль). Лунки f1 и g1 служат контролем конъюгата и заполняются по 0,1 куб. см раствора N 1.

3.4. Планшет осторожно встряхивают, закрывают крышкой и переносят в термостат (37 +- 0,5)°C на 2 ч. Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем встряхивания и трехкратно промывают раствором N 1.

3.5. Готовят раствор N 5 по п. 2.2.5 и вносят во все лунки планшета по 0,1 куб. см, затем опять помещают в термостат на (37 +- 0,5)°C на 1 ч и промывают как в п. 3.4.

3.6. Готовят раствор N 7 по п. 2.2.7 и вносят во все лунки по 0,1 куб. см. Оставляют при температуре (20+-0,5)°С в темном месте на 5-10 мин. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку 0,05 куб. см серной кислоты, приготовленной путем растворения 2 куб. см концентрированной серной кислоты (в наборе отсутствует) в 10 куб. см дистиллированной воды.

3.7. В случае отсутствия инструментального учёта результатов реакции оценку специфической активности сывороток крови можно проводить путем раститровки испытуемых сывороток. В этом случае во все лунки рядов планшета В1-12 ... Н1-12 вносят по 0,1 куб. см раствора N 1, а в лунки А2-11 вносят по 0,2 куб. см исследуемых проб сывороток крови в разведении 1:100, приготовленных следующим образом: к 0,01 куб. см сыворотки крови кур добавляют 1 куб. см раствора N 1 и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с 1:100 до 1:12800. В лунки А2 и А12 вносят разведения 1:100 контрольных (нормальной п. 2.2.4 и положительной п. 2.2.3) сывороток и также проводят раститровку по вертикальным рядам. Из последних лунок Н1-Н12 удаляют по 0,1 куб. см.

3.8. При обнаружении высоких титров антител в испытуемых пробах проводят раститровку по горизонтальным рядам планшета.

4. Учет результатов реакции

4.1. Учет результатов анализа проводят после остановки реакции одним из способов: визуально - по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально - с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

5.0. Оценка и интерпретация результатов

Использование предлагаемого набора позволяет:

- Дифференцировать испытуемые сыворотки на категории положительно или отрицательно реагирующие.

- Определить титр испытуемой положительно реагирующей сыворотки.

5.1. Дифференциация сывороток (качественная оценка).

а) Визуальная оценка.

Учет результатов проводят путем сравнения интенсивности окраски испытуемой пробы относительно положительного и отрицательного контроля. Лунки с положительным контролем окрашиваются в желтый цвет различной интенсивности. В лунках с отрицательным контролем раствор незначительно желтеет или остается неокрашенным. Если интенсивность окраски испытуемой пробы соответствует положительному контролю - проба положительная, если отрицательному - проба отрицательная. За титр испытуемой сыворотки принимают последнее разведение ее, при котором наблюдают видимое цветовое окрашивание, более интенсивное по сравнению с отрицательным контролем.

б) Инструментальная оценка.

Реакцию контролируют по отношению значений оптической плотности положительного контроля (лунки А1 и В1) к значениям оптической плотности отрицательного контроля (лунки С1 и d1) по каждому планшету;

Пример:

;

Если отношение положительного к отрицательному контролю меньше 6.0, то результаты по данному планшету не учитывают.

Если это отношение больше 6.0, то результаты учитывают. В данном примере отношение равно 9.68, то есть больше 6.0, следовательно результат учитывают.

Высчитывают среднее значение отрицательного контроля (ОК):

Пример:

Высчитывают среднее значение положительного контроля (ПК):

Пример:

Определяют отношение значения исследуемой пробы сыворотки (ИС) к положительному контролю:

Пример:

Если отношение ИС/ПК меньше 0.2, это означает, что проба отрицательная;

Если отношение ИС/ПК равно или больше 0.2, это означает, что проба положительная.

5.2. Количественная оценка (определение титра антител).

а) при визуальном учете

При визуальном учете сравнивают окраску содержимого лунок планшета испытуемых проб с окраской лунок контрольных образцов. За титр испытуемой сыворотки принимают последнее разведение ее, при котором наблюдают видимое глазом цветовое окрашивание, более интенсивное по сравнению с отрицательным контролем. Положительными считают пробы, начиная с разведения 1:200 и выше.

б) при инструментальном учете

При инструментальном фотометрическом учете результатов анализа конечным разведением испытуемой сыворотки считается последнее ее разведение, в котором оптическая плотность превышает таковую отрицательного контроля в 2,0-2,1 раза.

в) Расчёт титра сыворотки по одному разведению (1:400) проводят по формуле.

Пример:

Отношение ИС/ПК = 0.238

6. Гарантии изготовителя

6.1. Предприятие-изготовитель гарантирует активность специфических компонентов набора в течение 12 месяцев со дня изготовления при соблюдении потребителем указанных выше условий хранения и использования данных препаратов.

6.2. Все претензии и замечания по качеству препарата предъявляют в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России от 8 мая 1992 г. N 22-7/28 "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту" во ВНИИЗЖ, ЦНМВЛ и сообщают во Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и одновременно направляют нарочным набор этой серии.