Приложение 1. Рекомендуемый порядок сбора, подготовки, транспортирования и хранения клинических образцов

Приложение 1

Рекомендуемый порядок сбора, подготовки, транспортирования и хранения клинических образцов

1. Общая информация

1.1. Краткое описание

Для генотипирования вирусов кори/краснухи в качестве клинических образцов используются носоглоточные соскобы/смывы и моча. Вирусы (вирусная РНК) могут быть выделены также из других клинических образцов (цельная кровь, сыворотка крови, слюна, биоптат), однако для целей генотипирования их использование не является оптимальным.

1.2. Информация по биологической безопасности

Клинические образцы потенциально могут содержать широкое разнообразие возбудителей инфекционных заболеваний. Все манипуляции необходимо проводить с соблюдением правил работы с инфицированными материалами. Всегда следует надевать перчатки, при работе вне бокса биологической защиты - использовать защитные очки.

1.3. Материалы и оборудование

Градуированные центрифужные пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 15 и 50 мл.

Пробирки типа "Эппендорф" объемом 1,5-2,0 мл.

Пластиковые криопробирки с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл.

Пластиковые контейнеры объемом 50 мл для сбора мочи.

Набор для взятия носоглоточных соскобов (стерильный зонд - тампон в пробирке),

Транспортная среда для выделения вирусов, состав:

- основной раствор Хенкса рН 7,4 с ХЕПЕС-буфером;

- бычий сывороточный альбумин;

- раствор антибиотиков;

- 0,4%-й раствор фенолового красного.

Приготовление транспортной среды: растворить 2,0 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл дистиллированной воды для получения 2%-го раствора. Добавить к 80 мл дистиллированной воды 10 мл раствора Хенкса, 10 мл 2%-го раствора бычьего сывороточного альбумина и 0,2 мл раствора фенолового красного. Стерилизовать фильтрованием. Добавить 1 мл раствора антибиотиков.

Приготовление раствора антибиотиков: растворить ЕД бензилпенициллина натриевой (калиевой) соли и 1,0 г стрептомицина сульфата в 100 мл стерильного фосфатного буферного раствора. Разлить во флаконы по 5 мл и хранить при -20°С. Добавить 1 мл этого раствора к 100 мл питательной среды позволяет получить рабочий раствор с концентрацией 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина в 1 мл раствора.

Примечание: альтернативно может быть использована коммерческая транспортная среда для хранения вирусов. При отсутствии транспортной среды допускается использование питательной среды для культур клеток (например, DMEM, RPMI, ИГЛА) с антибиотиками и 2%-го раствора бычьего сывороточного альбумина. В случае отсутствия указанных сред, если образец может быть доставлен в лабораторию в течение 48 часов с момента сбора, допускается использование в качестве транспортной среды буферированного физиологического раствора с антибиотиками.

Рефрижераторная центрифуга.

1.4. Информация, требующая внимания

Вероятность выделения вируса наиболее высока при исследовании образцов, собранных в первые 3 суток с момента появления сыпи, не следует задерживать сбор образцов. Исследование разных образцов (моча, соскоб) от одного пациента повышает вероятность выделения вируса.

В случае если клинические образцы могут быть доставлены в тестирующую лабораторию в течение 48 часов с момента забора при условии хранения и транспортирования при 0°С (на тающем льду), замораживать образцы нецелесообразно.

При более продолжительном времени транспортирования образцы должны быть заморожены при температуре не выше -70°С (сухой лед/хладоэлементы). Замораживание и хранение вируссодержащих образцов при температуре -20°С не является оптимальным с точки зрения сохранения жизнеспособности вируса и не рекомендуется, может быть использовано на время транспортирования образцов только при отсутствии возможности соблюдения оптимальных условий.

Для изоляции вируса кори и экстракции РНК вируса образцы должны быть собраны не позже 7 дня с даты появления сыпи. Допускается сбор образцов в более поздние сроки (до 2 недель) при отсутствии другой возможности генотипирования случая кори.

Для изоляции вируса краснухи и экстракции РНК вируса образцы должны быть собраны не позже 5 дня с даты появления сыпи при постнатальной краснухе и в течение 1 года жизни ребенка при подозрении на СВК.

Каждый образец должен быть промаркирован (фамилия, инициалы пациента и/или идентификационный номер). Оптимально использовать для хранения и транспортирования образцов криопробирки для замораживания с завинчивающейся крышкой (2,0-2,5 мл), допустимо - пробирки типа "Эппендорф" (1,5-2,0 мл). При использовании пробирок типа "Эппендорф" необходимо обеспечить их герметичность, для чего целесообразно применять пробирки со специальной защелкой либо герметизировать с помощью пленки.

Все манипуляции с клиническими образцами следует проводить в условиях максимально возможной стерильности. Работать необходимо с охлажденными до 2-8°С образцами, не допуская их нагревания и воздействия прямого солнечного света.

В сопроводительных документах необходимо предоставить следующие сведения:

- эпидемиологический номер случая (при наличии);

- фамилия, имя, отчество пациента;

- пол;

- дата рождения;

- адрес места жительства (фактический);

- дата заболевания;

- дата появления сыпи;

- предварительный клинический диагноз (генотипированию подлежат случаи инфекции, подозрительные на корь, краснуху, СВК);

- тип образца;

- дата сбора образца;

- дата отправки образца в лабораторию;

- учреждение, направляющее образцы на исследование;

- контактные данные сотрудника, направившего образцы на исследование (фамилия, имя, отчество, телефон, адрес электронной почты (при наличии).

2. Сбор, подготовка, хранение клинических образцов

2.1. Порядок взятия мочи для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори

Порядок взятия мочи для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори осуществляется по следующей схеме:

1. Соберите не менее 50 мл мочи в стерильную емкость. Предпочтительно собирать первую утреннюю порцию. У детей в возрасте до 1 г допустимо использование меньшего количества мочи, но не менее 10 мл.

2. Охладите образец до 4°С. Цельную мочу не замораживать!

3. Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при 4°С 1 500 об./мин в течение 5 мин.

4. Удалите надосадочную жидкость в емкость с дезраствором.

5. Растворите осадок в 1 мл транспортной среды.

6. Перенесите полученный образец в стерильную пробирку типа "Эппендорф" или пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой для замораживания образцов.

7. Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2-8°С (оптимально при 0°С, на тающем льду) в течение 48 часов.

8. В случае отсутствия возможности для доставки образца в указанные сроки заморозьте и храните образец при температуре не выше -20°С ("оптимально при -70°С). Замороженный образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при -70°С (сухой лед, замороженные хладоэлементы).

2.2. Порядок взятия носоглоточных соскобов и смывов для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса

Для выделения вируса кори и экстракции РНК вируса кори может быть использован носоглоточный смыв или соскоб (предпочтительнее). Концентрация вируса наиболее максимальна в области лимфоидньгх образований (язычная, небные, носоглоточная миндалины), соответственно целесообразно забирать соскоб из указанных участков слизистой полости рта и глотки.

Носоглоточный соскоб:

1. Стерильным ватным тампоном с усилием (чтобы собрать достаточное количество клеток) протереть слизистую оболочку полости рта и ротоглотки пациента в области лимфоидных образований (язычная, небные, носоглоточная миндалины).

2. Та