Межгосударственный стандарт ГОСТ 34461-2018 "Продукция соковая. Определение содержания гесперидина и нарингина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 октября 2018 г. N 755-ст)

Juice products. Determination of hesperidin and naringin content by HPLC method

МКС 67.080.01

Дата введения - 1 ноября 2019 г.
Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Разработан Некоммерческой организацией "Российский союз производителей соков" (РСПС) при участии Общества с ограниченной ответственностью "Люмэкс-маркетинг" (ООО "Люмэкс-маркетинг")

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 августа 2018 г. N 111-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 октября 2018 г. N 755-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34461-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 ноября 2019 г.

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соковую продукцию (соки, концентрированные соки, нектары, сокосодержащие напитки), произведенную на основе или с добавлением цитрусовых фруктов (апельсина, грейпфрута, мандарина, лимона и лайма), и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для определения содержания (массовой концентрации и массовой доли) гесперидина и нарингина.

Диапазон измерений массовой концентрации нарингина в готовой соковой продукции (соки, нектары и сокосодержащие напитки) составляет от 30 до 1000 мг/дм³, а гесперидина - от 100 до 1000 мг/дм³.

Диапазон измерений массовой доли нарингина в концентрированных соках составляет от 150 до 5000 млн^-1, а гесперидина - от 500 до 5000 млн^-1.

Примечание - 1 млн^-1 соответствует 1 мг/кг.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79* Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

------------------------------

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013** Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

------------------------------

** В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 5712-78 Реактивы. Аммоний щавелевокислый 1-водный. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-1-2003* Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ИСО 5725-6-2003** Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

------------------------------

* В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002.

** В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 20289-74 Реактивы. Диметилформамид. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Метод основан на экстракции гесперидина и нарингина из проб соковой продукции смесью N,N-диметилформамида и водного раствора щавелевокислого аммония с последующим измерением массовой концентрации указанных соединений в экстракте методом ВЭЖХ с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области спектра.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, посуда и материалы

4.1 Хроматограф жидкостный со спектрофотометрическим детектором, обеспечивающим проведение измерений при 287 нм или диодно-матричным детектором в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм, снабженный программным обеспечением для сбора и обработки данных, со следующими метрологическими характеристиками:

- относительное среднеквадратическое отклонение выходного сигнала по высоте и площади пика - не более 3 %;

- относительное среднеквадратическое отклонение выходного сигнала по времени удерживания - не более 1,0 %.

Предел детектирования гесперидина и нарингина (при соотношении сигнал/шум, равном трем) должен быть не более 0,2 мг/дм³.

Рекомендуется использование термостата колонок.

4.2 Колонка хроматографическая***, заполненная обращенно-фазовым сорбентом С18, обеспечивающая число теоретических тарелок по пикам гесперидина и нарингина не менее 3000.

------------------------------

*** Например, хроматографические колонки Nucleosil 100-5С18 и Agilent ZORBAX SB-C18. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанных продуктов. Допускается использование аналогичных хроматографических колонок, в том числе с иными типоразмерами при соблюдении указанных требований.

4.3 Колонка защитная (предколонка), заполненная обращенно-фазовым сорбентом.

4.4 Весы неавтоматического действия специального класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности измерений  0,0001 г.

4.5 Весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1, пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения  0,001 г.

4.6 Пипетки градуированные 2-1-2-1, 2-1-2-2, 2-1-2-5 и 2-1-2-10 по ГОСТ 29227.

Примечание - Допускается использование дозаторов с метрологическими характеристиками, соответствующими ГОСТ 28311.

4.7 Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

4.8 Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250, 1000 см³, 2-го класса точности, исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770.

4.9 Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 83 с^-1 (5000 об/мин), обеспечивающая фактор разделения (g-фактор) не менее 1000.

4.10 Шкаф сушильный с диапазоном рабочих температур от 50 °С до 200 °С.

4.11 Насос лабораторный вакуумный, мембранный или водоструйный по ГОСТ 25336, обеспечивающий разрежение от 2,5 до 10 кПа.

4.12 Баня водяная с регулятором температуры, обеспечивающая поддержание температуры в диапазоне от 40 °С до 100 °С.

4.13 Стаканы любого типа исполнения 1 вместимостью 50, 100 см³ по ГОСТ 25336.

4.14 Колбы плоскодонные П-1-1000-29/32 или конические Кн-1-250-29/32, Кн-1-1000-29/32 по ГОСТ 25336.

4.15 Сосуды стеклянные с завинчивающимися крышками (виалы) с инертным материалом септы вместимостью от 10 до 20 см³.

4.16 Пробирки одноразовые из полимерного материала типа Эппендороф или аналогичные вместимостью от 1 до 2 см³.

4.17 Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см³.

4.18 Фильтры мембранные с диаметром пор 0,20 и 0,45 мкм.

4.19 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696 1-й степени чистоты (далее - вода для анализа).

4.20 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии (оптическая плотность при 200 нм относительно дистиллированной воды должна быть не более 0,05 единиц оптической плотности), ос. ч.

4.21 N,N-Диметилформамид по ГОСТ 20289, х. ч.

4.22 Аммоний щавелевокислый 1-водный по ГОСТ 5712, х. ч.

4.23 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х. ч.

4.24 Кислота серная по ГОСТ 4204, х. ч. или ч. д. а.

4.25 Гесперидин* с массовой долей основного вещества не менее 95 %.

4.26 Нарингин** с массовой долей основного вещества не менее 95 %.

------------------------------

* CAS 520-26-3 (CAS - код соединения в американской реферативной системе по химии (Chemical Abstracts).

** CAS 10236-47-2.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования, посуды, материалов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных и химических реактивов аналогичной квалификации.

5 Отбор проб

Отбор проб соковой продукции - по ГОСТ 26313.

6 Условия проведения измерений

При подготовке к проведению измерений и проведении измерений в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура окружающего воздуха ... (20  5) °С;

- атмосферное давление ... от 84,0 до 106,7 кПа;

- влажность воздуха ... не более 80 %.

В лабораторных помещениях не должно быть загрязненности воздуха рабочей зоны пылью и агрессивными веществами, должны отсутствовать вибрация или другие факторы, влияющие на результаты измерений.

7 Подготовка к проведению измерений

7.1 Подготовка стеклянной посуды

Посуду для приготовления и хранения подвижной фазы моют только серной кислотой (см. 4.24) без применения других моющих средств, тщательно промывают водопроводной водой и ополаскивают водой для анализа.

Остальную стеклянную посуду моют горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают водой для анализа и сушат в сушильном шкафу при температуре 105 °С.

7.2 Приготовление вспомогательных растворов

7.2.1 Приготовление раствора уксусной кислоты молярной концентрации 0,2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают приблизительно 200 см³ дистиллированной воды, добавляют 12 см³ концентрированной уксусной кислоты, разбавляют дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянном сосуде при температуре (4  2) °С - 3 мес.

7.2.2 Приготовление подвижной фазы

Подвижную фазу готовят смешиванием 200 см³ ацетонитрила (см. 4.20) и 800 см³ раствора уксусной кислоты (см. 7.2.1) в плоскодонной колбе вместимостью 1000 см³ (см. 4.14).

Срок хранения подвижной фазы в стеклянном сосуде при температуре (4  2) °С - 14 сут.

Перед использованием подвижную фазу дегазируют и фильтруют в соответствии с указаниями изготовителя хроматографа и (или) колонки.

Примечания

1 В зависимости от типа сорбента и типоразмера применяемых колонок допускается варьирование состава подвижной фазы с целью разделения пиков гесперидина и нарингина и их отделения от пиков компонентов матрицы пробы.

2 Допускается приготовление иных объемов подвижной фазы в зависимости от потребности.

7.2.3 Приготовление раствора щавелевокислого аммония молярной концентрации 0,025 моль/дм³

В химическом стакане вместимостью 50 или 100 см³ взвешивают (3,55  0,05) г щавелевокислого аммония 1-водного (см. 4.22) и растворяют приблизительно в 30 см³ воды для анализа. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³. Доводят до метки водой для анализа и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянном сосуде при температуре (20  5) °С - 3 мес.

Примечание - Допускается изменять объем приготавливаемого раствора в зависимости от потребности.

7.3 Приготовление градуировочных и контрольных растворов

7.3.1 Общие положения

Растворы гесперидина и нарингина следует хранить в темном месте при температуре от 2 °С до 6 °С в герметичной посуде, исключающей возможность испарения растворителя и контакт раствора с материалами иными, чем стекло. Растворы каждой концентрации готовят по потребности.

7.3.2 Приготовление основного раствора гесперидина номинального значения массовой концентрации 500 мг/дм³

В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают (25,0  0,5) мг гесперидина (см. 4.25), добавляют 10 см³ N,N-диметилформамида (см. 4.21), тщательно перемешивают до полного растворения (при необходимости нагревают на водяной бане при температуре от 40 °С до 45 °С). Содержимое колбы доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по 7.2.2, и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в условиях по 7.3.1 - 4 сут.

7.3.3 Приготовление основного раствора нарингина номинального значения массовой концентрации 1000 мг/дм³

В мерную колбу вместимостью 25 см³ помещают (25,0  0,5) мг нарингина (см. 4.26), добавляют 5 см³ N,N-диметилформамида (см. 4.21) и перемешивают до полного растворения нарингина. Содержимое колбы доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по 7.2.2, и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в условиях по 7.3.1 - 4 сут.

7.3.4 Фактическое значение массовой концентрации гесперидина (нарингина) в основном растворе С_осн, мг/дм³, вычисляют по формуле

,

(1)

где М - масса гесперидина (нарингина), мг;

1000 - коэффициент согласования размерности единиц объема;

- массовая доля основного вещества в исходном реактиве, использованном для приготовления основного раствора (указано в паспорте изготовителя), %;

V₁ - объем основного раствора, см³;

100 - коэффициент для перевода массовой доли основного вещества из процентов в безразмерную величину.

7.3.5 Приготовление градуировочных растворов

7.3.5.1 Приготовление градуировочного раствора N 1

В стеклянный сосуд с завинчивающейся крышкой (виалу) вместимостью от 10 до 20 см³ помещают пипеткой или дозатором 2 см³ основного раствора гесперидина (см. 7.3.2) и 1 см³ основного раствора нарингина (см. 7.3.3), добавляют пипеткой или дозатором 7 см³ подвижной фазы, приготовленной по 7.2.2, и тщательно перемешивают.

Номинальное значение массовой концентрации компонентов в градуировочном растворе N 1 составляет 100 мг/дм³. Фактическое значение массовой концентрации компонентов С₁, мг/дм³, вычисляют по формуле

,

(2)

где С_осн - фактическое значение массовой концентрации компонента в основном растворе (см. 7.3.4), мг/дм³;

V_осн - объем основного раствора компонента, использованный для приготовления градуировочного раствора N 1, см³;

V_гр - объем приготовленного градуировочного раствора N 1, см³ (10 см³).

Раствор используют в день приготовления.

7.3.5.2 Приготовление градуировочных растворов N 2-5

В стеклянные сосуды с завинчивающейся крышкой (виалы) вместимостью от 10 до 20 см³ помещают пипеткой или дозатором градуировочный раствор N 1 (см. 7.5.3.1), добавляют пипеткой или дозатором подвижную фазу, приготовленную по 7.2.2 (см. таблицу 1), и тщательно перемешивают.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "п.7.3.5.1"

Таблица 1

Номер раствора	Объем аликвоты градуировочного раствора N 1, см3	Объем подвижной фазы, приготовленной по 7.2.2, см3	Массовая концентрация (номинальное значение) гесперидина (нарингина), мг/дм3
2	4	6	40
3	2	8	20
4	1	9	10
5*	0,5	9,5	5
* Раствор N 5 используют только при установлении градуировочной характеристики для нарингина.

Фактическое значение массовой концентрации компонента в приготовленном градуировочном растворе С_j, мг/дм³, вычисляют по формуле

,

(3)

где С₁ - фактическое значение массовой концентрации компонента в градуировочном растворе N 1 (см. 7.3.5.1), мг/дм³;

V_ал - объем аликвоты градуировочного раствора N 1, использованный для приготовления данного градуировочного раствора (см. таблицу 1), см³;

V_j - объем приготовленного градуировочного раствора, см³ (10 см³).

Растворы используют в день приготовления.

7.4 Подготовка хроматографа к работе

Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на рабочий режим, включая кондиционирование колонки, а также промывку гидравлической линии хроматографа и выключение хроматографа по окончании работы осуществляют в соответствии с руководством по эксплуатации.

7.5 Условия хроматографического анализа

При проведении хроматографического анализа создают и поддерживают следующие условия:

- температура колонки - 25 °С (при наличии термостата колонок);

- длина волны детектирования при использовании спектрофотометрического детектора - 287 нм;

- объем дозирования пробы - полное заполнение дозирующей петли (от 10 до 20 мм³);

- режим элюирования - изократический, подвижная фаза - по 7.2.2;

- объемную скорость потока подвижной фазы определяют типоразмерами хроматографической колонки. Рекомендуемое значение составляет 1,0 см³/мин для колонок длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм и 0,2 см³/мин - для колонок длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм.

7.6 Градуировка хроматографа

Для градуировки хроматографа регистрируют по две хроматограммы градуировочных растворов N 1 - 5 (см. 7.3.5) и, используя программное обеспечение к хроматографу, находят площади пиков компонентов, а затем устанавливают градуировочную характеристику для каждого компонента в виде функциональной зависимости площади пика от массовой концентрации компонента.

Градуировку проводят при освоении метода и далее - при смене оборудования, колонок, условий хроматографического анализа, при значительном изменении параметров хроматографического процесса (времени удерживания, эффективности, разрешения и асимметрии пиков), после ремонта хроматографа или при неудовлетворительных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики (см. 7.7).

Примечание - После длительного перерыва в работе рекомендуется проверить стабильность градуировочной характеристики в нескольких точках (не менее двух) диапазона.

7.7 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом работы, используя заново приготовленный градуировочный раствор N 2.

Регистрируют не менее двух хроматограмм этого раствора, идентифицируют пики компонентов, внося при необходимости коррекцию времен удерживания и принимая во внимание параметры хроматографического процесса (эффективность колонки, время удерживания пиков, разрешение пиков, асимметрию пиков), и вычисляют массовую концентрацию гесперидина и нарингина с использованием действующей градуировочной характеристики.

Проверяют сходимость времен удерживания

,

(4)

где t₁ и t₂ - время удерживания пика компонента на первой и второй хроматограммах соответственно, мин;

- среднеарифметическое значение времен удерживания t₁ и t₂, мин.

Проверяют сходимость значений массовой концентрации компонентов

,

(5)

где С_к1 и С_к2 - измеренное значение массовой концентрации компонентов в пробе для контроля по первой и второй хроматограммам соответственно, мг/дм³;

- среднеарифметическое значение массовой концентрации С_к1 и С_к2, мг/дм³.

Градуировочная характеристика признается стабильной, если выполняется условие

,

(6)

где С_к - фактическое значение массовой концентрации компонента в растворе, используемом для контроля стабильности градуировочной характеристики (см. 7.3.4), мг/дм³;

С_к0 - фактическое значение массовой концентрации компонента в растворе, используемом для контроля стабильности градуировочной характеристики (см. 7.3.4), мг/дм³.

Если условие (6) не выполняется, то процедуру контроля повторяют и при получении неудовлетворительного результата градуировку хроматографа проводят заново.

8 Проведение измерений

8.1 Подготовка проб к измерениям

8.1.1 Измерения проводят два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-1.

8.1.2 Пробу соков, нектаров или сокосодержащих напитков интенсивно перемешивают и в две мерные колбы вместимостью 25 см³ (V₂) отбирают аликвоты объемом 5 см₃ (V₃) для проведения параллельных определений (см. 8.1.1).

Примечание - Аликвоты для параллельных определений должны быть отобраны одна за другой без задержки.

В каждую мерную колбу вместимостью 25 см³ добавляют по 5 см³ раствора щавелевокислого аммония, приготовленного по 7.2.3, 5 см³ N,N-диметилформамида (см. 4.21). Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки водой для анализа и тщательно перемешивают.

Нагревают в течение 10 мин на водяной бане при температуре от 90 °С до 100 °С и охлаждают до комнатной температуры.

Приблизительно 1,5 см³ полученного раствора помещают в одноразовую пробирку (см. 4.16), центрифугируют при скорости вращения 5000 об/мин (фактор разделения не менее 1000) в течение 5 мин и подвергают хроматографическому анализу по 8.2.

Примечание - Допускается замена центрифугирования фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,20 или 0,45 мкм. Не допускается использование мембранных фильтров из полисульфона, так как они не устойчивы к ацетонитрилу, а также на основе политетрафторэтилена (PTFE) и его аналогов, поскольку эти материалы адсорбируют нарингин и гесперидин.

8.1.3 Концентрированные соки предварительно разбавляют. В стакане вместимостью 50 см³ взвешивают от 4,5 до 5,5 г пробы концентрированного сока, добавляют от 5 до 10 см³ воды для анализа и перемешивают. Полученный раствор количественно (многократно ополаскивая стенки стакана водой для анализа) переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³ (V₄), доводят водой для анализа до метки и тщательно перемешивают. Затем проводят все процедуры, предусмотренные 8.1.2.

8.2 Проведение хроматографического анализа

8.2.1 Подготовленную по 8.1 пробу дозируют в хроматограф и регистрируют две хроматограммы в тех же условиях, в которых были зарегистрированы хроматограммы градуировочных растворов (см. 7.5). На полученных хроматограммах идентифицируют пики определяемых компонентов, установив ширину окна идентификации 5 %, используя значения площадей пиков. Вычисляют значения массовой концентрации идентифицированных компонентов при помощи градуировочных характеристик, установленных по 7.6.

8.2.2 Проверяют выполнение условия (5). Если это условие выполняется, то в качестве значения массовой концентрации компонента в подготовленной по 8.1 пробе принимают среднеарифметическое полученных значений. Если условие не выполняется, находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод подготовленной пробы повторяют.

8.2.3 Если массовая концентрация гесперидина (нарингина) в подготовленной по 8.1.2 или 8.1.3 пробе превышает верхнюю границу диапазона градуировочной характеристики (100 мг/дм³), то подготовленную пробу разбавляют водой для анализа. Коэффициент разбавления Q вычисляют по формуле

,

(7)

где V_р - объем разбавленной пробы, см³;

V_a - объем аликвоты подготовленной по 8.1 пробы, взятый для разбавления, см³.

8.2.4 Примеры хроматограмм приведены в приложении А.

9 Обработка и оформление результатов измерений

9.1 Если подготовка пробы была проведена по 8.1.2, то массовую концентрацию гесперидина (нарингина) в пробе С, мг/дм³, вычисляют по формуле

,

(8)

где С_х - массовая концентрация гесперидина (нарингина) (см. 8.2.2), мг/дм³;

V₂ - вместимость мерной колбы, используемой при подготовке пробы по 8.1.2, см³ (25 см³);

Q - коэффициент дополнительного разбавления подготовленной пробы по 8.2.3. Если подготовленная проба дополнительно не была разбавлена, то Q = 1;

V₃ - объем аликвоты исходной пробы, см³ (5 см³).

За результат измерений массовой концентрации гесперидина (нарингина) в пробе принимают среднеарифметическое значение , мг/дм³, результатов двух параллельных измерений С₁ и С₂, мг/дм³, при выполнении условия

,

(9)

где r_отн - предел повторяемости (см. таблицу 2), %.

Результат измерений округляют до целого числа.

9.2 Если подготовка пробы была проведена по 8.1.3, то массовую долю гесперидина (нарингина) в пробе X, млн^-1, вычисляют по формуле

,

(10)

где V₄ - объем подготовленной по 8.1.3 пробы, равный 50 см³;

m - масса пробы, г.

За результат измерений массовой доли гесперидина (нарингина) в пробе принимают среднеарифметическое значение , млн^-1, результатов двух параллельных измерений Х₁ и Х₂, млн^-1, при выполнении условия

,

(11)

где r_отн - предел повторяемости (см. таблицу 2), %.

Таблица 2 - Метрологические характеристики метода при Р = 0,95

Наименование показателя	Диапазон измерений	Границы относительной погрешности , %	Предел повторяемости (допускаемое относительное расхождение результатов двух параллельных измерений) rотн, %	Предел воспроизводимости (допускаемое относительное расхождение результатов двух единичных измерений) Rотн, %
Гесперидин
Массовая концентрация, мг/дм3	От 100 до 1000 включ.	13	8	18
Массовая доля, млн-1	От 500 до 5000 включ.
Нарингин
Массовая концентрация, мг/дм3	От 30 до 1000 включ.	10	7	13
Массовая доля, млн-1	От 150 до 5000 включ.

Результат измерения округляют до целого числа.

При невыполнении условий (9) или (11) получают еще два результата измерений в соответствии с разделом 8 и затем устанавливают результат измерений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (подраздел 5.2).

9.3 Результаты измерений регистрируют в протоколе испытаний согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием настоящего стандарта. В протоколе испытаний результат измерений представляют в следующем виде (с указанием компонента)

(12)

,

(13)

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений (см. 9.1 и 9.2), мг/дм³ (млн^-1);

- значение границ абсолютной погрешности измерений массовой концентрации для доверительной вероятности Р = 0,95, мг/дм³, вычисляемое по формуле

,

(14)

где - значение границ относительной погрешности измерений массовой концентрации (массовой доли) для доверительной вероятности Р = 0,95 (см. таблицу 2), %;

- значение границ абсолютной погрешности измерений массовой доли для доверительной вероятности Р = 0,95, млн^-1, вычисляемое по формуле

.

(15)

9.4 Результат измерений при содержании гесперидина (нарингина) менее нижней границы диапазона измерений представляют в протоколе в виде: "Менее С_н, мг/дм³" или "менее Х_н, млн^-1". Результат измерений при содержании гесперидина (нарингина) выше верхней границы диапазона измерений представляют в протоколе в виде: "Более С_в, мг/дм³" или "более Х_в, млн^-1", где С_н(Х_н) и С_в(Х_в) - нижняя и верхняя границы диапазона измерений массовой концентрации (массовой доли) гесперидина (нарингина) (см. раздел 1).

9.5 Результаты измерений, полученные в двух лабораториях, признают совместимыми при выполнении условий

,

(16)

где и - результаты измерений массовой концентрации компонента в первой и второй лабораториях соответственно, полученные по 9.1, мг/дм³;

CD_0,95 - критическая разность, %,

или

,

(17)

где и - результаты измерений массовой доли компонента в первой и второй лабораториях соответственно, полученные по 9.2, млн^-1. Значение критической разности вычисляют по формуле

,

(18)

где R_отн - предел воспроизводимости (см. таблицу 2), %;

r_отн - предел повторяемости (см. таблицу 2), %;

n₁ и n₂ - число параллельных измерений в первой и второй лабораториях соответственно.

Если условия (16) и (17) не выполняются, то лабораториям рекомендуется провести процедуры, предусмотренные ГОСТ 5725-6 (пункты 5.3.3 и 5.3.4).

10 Контроль качества результатов измерений

Контроль качества результатов измерений осуществляют, используя методы контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости и контроля стабильности среднеквадратического отклонения промежуточной прецизионности с применением контрольных карт Шухарта по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 6.2.2, 6.2.3).

Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (пункт 4.2).

11 Требования безопасности

При выполнении измерений следует соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности - по ГОСТ 12.1.004.

Требования электробезопасности при работе с приборами - по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с руководством по эксплуатации используемого оборудования.

12 Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное образование, опыт работы в химической лаборатории, изучившие руководство по эксплуатации жидкостного хроматографа и освоившие метод. Первое применение метода в лаборатории должно проводиться под руководством специалиста, владеющего теорией ВЭЖХ и имеющего практические навыки в этой области.