Методические указания по лабораторной диагностике эмфизематозного карбункула (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 10 октября 1982 г.)

1. Общие положения.

1.1. Эмфизематозный (шумящий) карбункул - острая неконтагиозная инфекционная болезнь, преимущественно крупного рогатого скота, а иногда и овец, характеризующаяся крепитирующими отеками мышечной ткани.

1.2. Возбудитель заболевания Cl. chauvoei - строгий анаэроб, представляет собой спорообразующую, полиморфную, подвижную палочку с закругленными концами. В мазках-отпечатках и молодых культурах окрашивается грамположительно, в старых культурах - грамотрицательно.

1.3. Диагноз на эмфизематозный карбункул ставят на основании клинических патологоанатомических, эпизоотологических данных и результатов лабораторных исследований.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют кусочки пораженных мышц, экссудат из крепитирующего отека. При этом прокипяченными инструментами вскрывают кожу, после чего инструменты меняют. Пораженный участок разрезают в глубину и из средней части мышцы отбирают кусочки пораженной ткани размером 3х3х3 см. В случае вскрытия трупа берут также кусочки печени и селезенки, кровь сердца. Материал для лабораторного исследования отбирают не позднее чем через 4 ч с момента гибели животного. В жаркое время года патологический материал консервируют 30%-ным стерильным водным раствором глицерина.

1.5. Исследование на эмфизематозный карбункул включает микроскопию мазков из патологического материала, посевы на питательные среды и заражение лабораторных животных.

2. Микроскопическое исследование.

2.1. Кусочками мышц и другого патологического материала на обезжиренных предметных стеклах делают мазки-отпечатки и окрашивают по Граму или Муромцеву.

При микроскопии видны отдельные или попарно лежащие полиморфные (веретенообразные, шаровидные, грушевидные) зернистоокрашенные грамположительные палочки со спорами, которые расположены центрально или субтерминально, но могут лежать и свободно. Споры окраску не воспринимают.

3. Бактериологическое исследование.

3.1. Высевы из патологического материала делают в среду Китта-Тароцци, МПБ и на МПА. Для этого кусочки мышц, печени, селезенки обжигают на пламени и помещают в пробирки или флаконы со средой Китта-Тароцци; высевы в МПБ и на МПА, а также посевы крови и экссудата делают пастеровской пипеткой.

Среду Китта-Тароцци предварительно регенерируют - прогревают в кипящей водяной бане в течение 15-30 мин, после чего быстро охлаждают до 45-50°С. Одновременно высев можно делать и на глюкозо-кровяной агар Цейсслера в чашках Петри.

При поступлении несвежего патологического материала из него готовят суспензию на физиологическом растворе (1:4), которую прогревают в течение 15-20 мин при 80°С, после чего делают высев.

Засеянные пробирки помещают в термостат на 24-48 ч при 37-З8°С. Чашки выдерживают в анаэробных условиях 24-48 ч.

Для создания анаэробных условий наиболее приемлем физический метод. Чашки, не переворачивая (дном вниз), помещают в микроанаэростат или эксикатор, из которого удаляют воздух при помощи вакуум-насоса.

Из других методов можно применять химический с использованием гидросульфита натрия и бикарбоната натрия . Чашки Петри с посевами ставят на обычное стекло дном вверх. Кислородпоглощающую смесь насыпают в 2-3 чашки Петри с разбитыми крышками и слегка увлажняют. Одну чашку ставят под чашки с посевами, другую - между ними, а третью - сверху. Все чашки закрывают стеклянным цилиндром, предварительно поместив под цилиндр индикаторную марлю. Герметичность создают, обмазывая пластилином края цилиндра в месте соприкосновения со стеклом.

Обесцвечивание индикаторной марли через сутки инкубации посева в термостате указывает на создание условий анаэробиоза. Если марля не обесцветилась, необходимо добавить к поглощающей смеси гидросульфит.

Приготовление индикатора. Марлю или фильтровальную бумагу пропитывают раствором следующего состава: 10%-ного раствора глюкозы 4,2 мл, нормального раствора едкого натра 0,1 мл, 1,5%-ного раствора метиленовой сини в дистиллированной воде 0,1 мл. После высыхания марлю или бумагу режут на кусочки и хранят в банках из темного стекла.

3.2. При росте Cl. chauvoei на среде Китта-Тароцци сначала наблюдается помутнение бульона, равномерно распределяющееся по всему столбику. Через 20-24 ч питательная среда начинает просветляться, и к 36-48 ч столбик ее становится прозрачным, а на дне пробирки или флакона образуется осадок микробных клеток. Газообразование незначительное. При микроскопии культур обнаруживают отдельные или попарно лежащие грамположительные палочки и палочки со спорами.

3.3. Для выделения чистой культуры возбудителя из жидких питательных сред делают дробный рассев на 3-4 чашки с глюкозо-кровяным агаром Цейсслера, предварительно подсушенным в термостате в течение 5-6 ч. Засеянные чашки выдерживают в анаэробных условиях 24-48 ч в термостате при 37-38°С.

3.4. На агаре Цейсслера наблюдается характерный рост колоний в виде перламутровой пуговицы или с изрезанными краями (виноградный лист), вокруг колоний - неширокая зона гемолиза. Если в первичных посевах была получена смешанная культура - характерные колонии отсевают в пробирки со средой Китта-Тароцци и выращивают 24-36 ч, отмечая характер роста, морфологию и тинкториальные свойства.

3.5. В случае, когда к моменту выделения чистой культуры возбудителя морские свинки, зараженные исходным материалом, живы, полученную культуру проверяют на патогенность путем заражения морских свинок в дозе 0,5 мл.

3.6. При наличии типичного роста на жидкой и плотной питательных средах, характерных морфологических и тинкториальных свойств выделенную культуру относят к Cl. chauvoei.

4. Биологическое исследование.

4.1. Одновременно с посевами заражают лабораторных животных. Для этого кусочки мышц, селезенки или печени измельчают и тщательно растирают в стерильной ступке с небольшим количеством МПБ в равномерную взвесь. Полученную взвесь (1:10) в дозе 0,5-1,0 мл вводят подкожно в области брюшных мышц двум морским свинкам массой 350-400 г. Кровь и мышечный экссудат вводят таким же способом в дозе 0,5-1,0 мл. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 8 сут.

4.2. При наличии Сl. chauvoei животные погибают в течение 24-96 ч. У павших морских свинок на коже отмечается серозно-некротический выпот, разлитые или точечные кровоизлияния. Кожа от пораженных мышц отделяется с трудом. Мышцы груди, брюшного пресса, иногда и задних конечностей темно-красного цвета. В паховых и реже в подмышечных областях обнаруживаются незначительные скопления пузырьков газа. Кишечник не вздут, а как бы уложен, органы брюшной полости без видимых изменений. Желчный пузырь переполнен желчью.

4.3. Из трупа или убитой в агональном состоянии морской свинки делают посевы из места введения материала, крови сердца и печени в среду Китта-Тароцци, МПБ и на МПА. Готовят мазки-отпечатки из тех же органов, а также с диафрагмальной поверхности печени.

4.4. В мазках-отпечатках с диафрагмальной поверхности печени, окрашенных по Граму или Муромцеву, обнаруживают отдельно лежащие палочки, редко встречаются цепочки из 2-3 члеников, что является одним из дифференцирующих признаков от Cl. septicum, при заражении которым в мазках с поверхности печени обнаруживают нити или длинные цепочки.

4.5. При необходимости дифференциации эмфизематозного карбункула от злокачественного отека суспензией из органов (1:10) или культурой заражают кролика массой 2,0-2,5 кг подкожно в область спины в дозе 1,0-1,5 мл. При наличии возбудителя эмфизематозного карбункула кролик не погибает.

5. Диагноз на эмфизематозный карбункул считают установленным в случае:

выделений из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя этого заболевания, и гибели хотя бы одной морской свинки с типичной патологоанатомической картиной и выделением из ее органов культуры возбудителя;

гибели хотя бы одной морской свинки из двух, зараженных исходным материалом, при наличии у нее типичной для данного заболевания патологоанатомической картины и выделении из ее органов культуры возбудителя, если даже в посевах из исходного материала культура возбудителя не выделена.

6. Срок исследования - до 8 дн.