Государственный стандарт Союза ССР ГОСТ 28566-90 (СТ СЭВ 6646-89) "Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества энтерококков" (утв. постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 29 мая 1990 г. N 1332)

Food products. Method for detection and determination of count Enterococci

Срок действия - с 1 июля 1991 г.
до 1 июля 1996 г.

Введен впервые

ГАРАНТ:

Ограничение срока действия настоящего ГОСТа снято протоколом N 5-94 МГС от 17 мая 1994 г. (ИУС N 11-94)

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления и количественного определения энтерококков (Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus avium, Streptococcus gallinarum).

Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведении в жидкую селективную среду или на поверхность плотной селективной среды, аэробном культивировании посевов при (371)°С в течение 24 - 48 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов к энтерококкам, пересчете их количества на 1,0 г () продукта.

1. Отбор и подготовка проб

Отбор проб - по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию - по ГОСТ 26669.

2. Аппаратура, материалы и реактивы

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104, с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности 10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический с увеличением в 900 - 1000 раз;

стерилизатор горячим воздухом;

термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55°С, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью 1°С;

холодильник бытовой;

водорода перекись по ГОСТ 10929;

желчь крупного рогатого скота или сухая желчь;

железо (III) - аммония гидроцитрат;

ферментативный гидролизат казеина;

канамицин сульфат во флаконах по 0,5 г - 500 000 ЕД и 1 г - 1 000 000 ЕД, в ампулах по 5 и 10  5% раствора, содержащих 0,25 и 0,5 г препарата;

полимиксин М сульфат во флаконах по 500 000 ЕД;

эскулин;

натрия гидрокарбонат () по ГОСТ 4201.

3. Подготовка к испытанию

3.1. Приготовление растворов

3.1.1. Раствор с объемной долей перекиси водорода 10%:

33,3  перекиси водорода с содержанием основного вещества 30% (в случае если перекись водорода имеет другое содержание основного вещества, то делается пересчет) переносят в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем дистиллированной водой до метки.

3.1.2. Раствор с массовой долей HCl 5%: 11,5 см концентрированной соляной кислоты переносят в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем дистиллированной водой до метки.

3.1.3. Раствор массовой концентрацией натрия гидроокиси 50 : 5 г натрия гидроокиси переносят в мерную колбу вместимостью 100 , растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.4. Раствор 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) массовой концентрацией 10 : 1 г ТТХ переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670. В темной плотно закрытой посуде раствор хранят при (42)°С не более 3 мес.

3.1.5. Раствор массовой концентрацией теллурита калия 20 : 2 г теллурита калия переносят, смывая дистиллированной водой в мерную колбу вместимостью 100 , доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.6. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 : 1,6 г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100  и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.7. Раствор массовой концентрацией кристаллического фиолетового 0,1 : 0,01 г кристаллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100  и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.8. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 16 : 1,6 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100  и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.9. Раствор массовой концентрацией натрия азида 100 : 10 г натрия азида переносят в мерную колбу вместимостью 100 , растворяют при легком подогревании в дистиллированной воде и раствор доливают до метки. Раствор готовят под вытяжкой, так как пары натрия азида ядовиты.

3.1.10. Раствор массовой концентрацией канамицина сульфата 50 (50 000 000 ЕД) и 100 (100 000000 ЕД): во флаконы с 0,5 г или 1 г препарата вносят 10  стерильной дистиллированной воды, содержимое флаконов растворяют.

3.1.11. Молоко обезжиренное готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.12. Растворы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1. Азидно-глюкозный бульон

Основа среды: к 1 мясопептонного бульона, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 5,0 г пептона, 7,5 г глюкозы, 2,5 г натрия хлорида, составные части растворяют нагреванием. После этого охлаждают и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации при 25°С он составлял (7,20,1). Затем основу среды стерилизуют текучим паром (при 100°С) в течение 30 мин. К основе среды, охлажденной до 50°С, добавляют 2,0  натрия азида, приготовленного по п. 3.1.9, и 2,0  раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного по п. 3.1.8. Готовую среду не стерилизуют. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (42)°С не более 3 мес. Непосредственно перед использованием ее разливают по 5  в стерильные пробирки.

3.2.2. Глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН 7,2 и 9,6: 5,0 г триптона или ферментативного казеинового гидролизата, 12,5  дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы добавляют к 1 дистиллированной воды. Смесь, периодически помешивая, подогревают до полного растворения всех составных частей, охлаждают и устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С (7,20,1) или (9,60,1).

Среду разливают по 5  в пробирки и стерилизуют при температуре (1211)°С в течение 15 мин. Среду хранят при (42)°С не более 14 сут.

3.2.3. Солевой бульон

Основа среды - глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН (7,20,1) по п. 3.2.2.

При приготовлении питательной среды в 1 основы среды растворяют на водяной бане 65,0 г натрия хлорида, разливают по 5  в пробирки, стерилизуют при (1211)°С в течение 15 мин.

Питательную среду можно готовить за одну операцию, тогда в процессе приготовления основы среды добавляют 65,0 г натрия хлорида. Среду хранят при (42)°С не более месяца.

3.2.4. 40%-ный желчный бульон

Основа среды - глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН (7,20,1). К 600  охлажденной до 45 - 55°С основы среды добавляют асептически 400  стерильной профильтрованной желчи крупного рогатого скота или эквивалентное количество сухой желчи.

Среду хранят при (42)°С не более 3 мес.

3.2.5. Селективный агар по Сланецу и Бертли:

20,0 г пептона, 25,0  дрожжевого экстракта, 2,0 г глюкозы, 4,0 г калия фосфорнокислого двузамещенного, (15,03,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 , доливают дистиллированной водой до метки, нагревают до растворения компонентов. Охлаждают, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25°С (7,20,1). Стерилизуют текучим паром (при 100°С) в течение 30 мин, охлаждают до 50°С. Добавляют 4,0  раствора азида натрия, приготовленного по п. 3.1.9, и 10,0  раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида, приготовленного по п. 3.1.4, хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (42)°С не более 7 сут.

3.2.6. Канамицин азидно-эскулиновый агар (КАЭ-агар):

20,0 г пептона из казеина, 25,0  дрожжевого экстракта, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,5 г железа (III) - аммония гидроцитрата, 1,0 г эскулина, (15,03,0) г агара помещают в мерную колбу вместимостью 1000 , доливают дистиллированной водой до метки. Растворяют составные части при нагревании, охлаждают, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации при 25°С он составлял (7,10,1). Стерилизуют при (1211)°С в течение 15 мин, охлаждают до 50°С, добавляют 1,5  раствора азида натрия, приготовленного по п. 3.1.9, и 0,4  раствора канамицина сульфата массовой концентрацией 50 или 0,2  раствора канамицин сульфата массовой концентрацией 100 и разливают по чашкам Петри. Среду хранят при (42)°С не более 7 сут.

3.2.7. Глюкозо-триптонный агар с дрожжевым экстрактом с рН (7,20,1) готовят по п. 3.2.2, но при приготовлении добавляют на 1 среды (15,03,0) г агара.

3.2.8. Щелочная полимиксиновая среда:

Основа среды - к 400  мясо-пептонного бульона по ГОСТ 10444.1 добавляют 5 г натрия хлорида, 10 г глюкозы, 10  дрожжевого экстракта. Основу среды стерилизуют при (1101)°С в течение 12 мин, охлаждают и добавляют 250  раствора натрия карбоната массовой концентрацией 21,2 и 250  раствора бикарбоната натрия массовой концентрацией 10 . Устанавливают рН таким образом, чтобы при 25°С он составлял (10,10,1). После этого к среде добавляют 200 000 ЕД полимиксина М сульфата, 5,0  спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п. 3.1.6. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (42)°С не более 7 сут. Непосредственно перед использованием среду разливают по 5  в стерильные пробирки.

3.2.9. Молочно-ингибиторная среда (МИС):

К 850  расплавленного и охлажденного до 50°С мясо-пептонного агара, приготовленного по ГОСТ 10444.1, добавляют 150  обезжиренного молока, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 12,5  раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.7, 10,0  раствора калия теллурита, массовой концентрацией 20 , 200 000 ЕД полимиксина М сульфата. Среду не стерилизуют, разливают в стерильные чашки Петри и хранят при (42)°С не более 10 сут. Допускается взамен раствора калия теллурита добавлять в среду 5,0  раствора 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлорида, приготовленного по п. 3.1.4.

4. Проведение испытания

4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить ожидаемое количество энтерококков в 1,0 г () продукта или определить допустимое количество энтерококков, указанное в нормативно-технической документации на конкретный вид пищевого продукта.

При выявлении энтерококков из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить минимальное количество продукта, содержащее энтерококки, или высевают навеску продукта, которая указана в нормативно-технической документации на этот продукт.

4.2. Для определения количества энтерококков 0,1 или 0,2 продукта или его разведения высевают по ГОСТ 26670 на поверхность предварительно подсушенной агаризованной питательной среды, приготовленной по п. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9.

4.3. Если необходимо выявить энтерококки в навеске продукта определенной массы или объема, то навеску продукта или его разведение высевают непосредственно в жидкую питательную среду по п. 3.2.1 или 3.2.8.

4.4. Посевы инкубируют при (371)°С в течение 24 - 48 ч, через 24 ч проводят предварительный учет результатов, через 48 ч - окончательный.

4.5. После инкубирования посевов, проведенных по п. 4.3, учитывают пробирки с признаками роста микроорганизмов: помутнением среды и изменением ее окраски в желтый цвет. Из пробирок с признаками роста, предположительно энтерококков, делают пересевы на поверхность агаризованной среды п. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.9 таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний, посевы на этих средах инкубируют при (371)°С в течение 24 - 48 ч.

4.6. После инкубирования посевов, проведенных по п. 4.2, учитывают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных для энтерококков колоний:

на питательной среде по п. 3.2.5 колонии энтерококков красно-розовые или карминовые с коричневым оттенком диаметром до 2 мм;

на питательной среде по п. 3.2.6 колонии энтерококков оливково-зеленые до темно-коричнево-черных с равномерной окраской поля;

на питательной среде по п. 3.2.9:

1) с 2- 3-, 5-ТТХ-колонии вишнево-красные с зоной протеолиза или бесцветные с розовым центром;

2) с теллуритом калия - колонии окрашены в черный цвет.

4.7. Посевы по п. 4.5 через 24 - 48 ч инкубирования просматривают и отмечают рост колоний, характерных для энтерококков по п. 4.6.

4.8. Для дальнейшего подтверждения принадлежности характерных колоний к энтерококкам отбирают не менее пяти колоний из посевов по пп. 4.6 и 4.7 и пересевают их на чашки Петри с агаризованной средой по п. 3.2.7 таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют при (371)°С в течение 24 - 48 ч.

4.9. Подтверждение принадлежности характерных колоний к энтерококкам

4.9.1. Из колоний, выросших по п. 4.8, готовят препараты, окрашивают по Граму по ГОСТ 10444.3.

Энтерококкии - грамположительные кокки, расположенные парами, короткими или длинными цепочками.

4.9.2. У колоний определяют наличие каталазы по ГОСТ 10444.3. Энтерококки каталазу не образуют.

4.10. При более углубленном анализе и в целях эпидемиологического обследования проводят дальнейшее подтверждение характерных колоний.

4.10.1. Для определения возможности роста при температуре (451)°С культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН (7,20,1) по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (451)°С 48 - 72 ч. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.2. Для определения возможности роста в среде с массовой концентрацией NaCl 65 культуры высевают в солевой бульон по п. 3.2.3 и инкубируют при (371)°С в течение 24 - 48 ч. Энтерококки вызывают помутнение среды и выпадение осадка. S. avium в среде с массовой концентрацией NaCl 65 не растет или растет очень медленно.

4.10.3. Для определения возможности роста в питательной среде с рН 9,6 культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом и рН 9,6 по п. 3.2.2 и инкубируют в течение 24 - 48 ч при (371)°С. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.4. Для постановки теста на терморезистентность культуры высевают в глюкозо-триптонный бульон с дрожжевым экстрактом с рН (7,20,1), пробирки выдерживают при (601)°С в течение 30 мин и инкубируют в течение 24-48 ч при (371)°С. Энтерококки вызывают помутнение среды.

4.10.5. Для определения возможности роста в среде с 40 -тами желчи культуры высевают в 40%-ный желчный бульон по п. 3.2.4 и инкубируют в течение 24 - 48 ч при (371)°С. Энтерококки вызывают помутнение среды.

5. Обработка результатов

5.1. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2. Если при изучении культуральных и морфологических свойств микроорганизмов обнаружены грамположительные, не образующие каталазу кокки, то дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относят к энтерококкам.

5.3. Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост энтерококков, то считают, что все колонии, выросшие на чашке по п. 4.6, принадлежат к энтерококкам.

В остальных случаях количество энтерококков определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний, к общему количеству колоний, взятых для подтверждения.

При посеве навески продукта или разведения продукта на жидкие среды, пробирки считают положительными, если при последующем пересеве на агаризованные среды и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной характерной колонии обнаружены энтерококки.

5.4. Результаты записывают следующим образом

5.4.1. Результаты определения количества энтерококков пересчитывают на 1 продукта и записывают в соответствии с требованиями ГОСТ 26670.

5.4.2. Результаты выявления энтерококков в определенной навеске записывают: энтерококки обнаружены или не обнаружены (при этом указывается навеска продукта).