Методические рекомендации MP 4.2.0014-10 "Оценка генотоксических свойств методом ДНК-КОМЕТ IN VITRO" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 14 октября 2010 г.)

Методические рекомендации
MP 4.2.0014-10
"Оценка генотоксических свойств методом ДНК-КОМЕТ IN VITRO"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 14 октября 2010 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Введение

Предупреждение контакта человека с потенциальными генотоксикантами представляется наиболее конструктивным способом защиты организма человека от последствий индуцированного мутагенеза. Вместе с тем, тотальная проверка ксенобиотиков/комплекса ксенобиотиков на генотоксичность невозможна вследствие огромного объема исследований. Это обусловило внедрение в практику генотоксикологических исследований понятия "первоочередность" тестирования. Первоочередному тестированию подлежат лекарственные средства, пищевые добавки, пестициды, парфюмерно-косметические средства, бытовая химия, а также наиболее широко распространенные загрязнители воды, воздуха и производственные вредности. Для удешевления и ускорения работ по генетическому скринингу проводится изучение генотоксичности с помощью простых и быстровыполнимых методов и использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов или культур клеток млекопитающих.

Из имеющихся на сегодняшний день в арсенале генотоксикологии методов для решения указанных задач наиболее перспективным представляется метод гель-электрофореза отдельных клеток или метод ДНК-комет. Метод является высокочувствительным и обеспечивает высокую надежность получаемых результатов.

Данные методические рекомендации содержат порядок проведения оценки генотоксических свойств с применением метода ДНК-комет в клетках млекопитающих в системе in vitro. Преимуществом настоящей тест-системы являются простота, экономичность, быстрота получения результатов. Кроме того, система отвечает современным этическим требованиям, согласно которым следует ограничивать использование млекопитающих в эксперименте.

1. Область применения

Методические рекомендации предназначены для токсикологических (генотоксикологических) исследований и испытаний пищевых ингредиентов (пищевых добавок, красителей и др.), биологически активных добавок к пище и сырья для их производства, парфюмерно-косметической продукции и средств гигиены полости рта, товаров бытовой химии, полимерных материалов и различных изделий из них (изделия детского ассортимента, изделия, контактирующие с пищевыми продуктами), сырья и продуктов, в том числе полученных с применением нанотехнологий, а также объектов и факторов среды обитания (вода централизованных источников, сточная вода и т.д.).

2. Принцип метода

Метод основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле поврежденной ДНК и/или фрагментов ДНК индивидуальных лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, визуально напоминающий "хвост кометы", параметры которого зависят от степени поврежденности ДНК.

Общая процедура метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию, окрашивание и микроскопический анализ. Гель-слайды готовятся с использованием предметных стекол, которые покрывают агарозным гелем. Исследуемые образцы инкубируют с клетками, затем в агарозном геле на подготовленные гель-слайды. После затвердевания геля клетки подвергают лизису, приводящему к разрушению клеточных и ядерных мембран, диссоциации ДНК-белковых комплексов. Проводится щелочная денатурации (рН>13), которая переводит щелочно-лабильные сайты ДНК в однонитевые разрывы, затем проводят электрофореза. После завершения щелочного электрофореза слайды нейтрализуют, окрашивают и анализируют под флуоресцентным микроскопом. Далее проводят компьютерный анализ цифровых изображений комет с помощью специализированного программного обеспечения и определяют основной показатель процент ДНК в хвосте кометы и другие параметры.

3. Оборудование, материалы и реактивы

- ламинарный бокс с вертикальным потоком ГОСТ ИСО 14644-1-2002;

- микроскоп эпифлуоресцентный

- высокочувствительная цифровая фотокамера или видеокамера с адаптером к микроскопу;

- микроскоп инвертированный

- -Инкубатор

- встряхиватель лабораторный типа Вортекс ТУ 64-1-1081-73;

- рН-метр ТУ-4215-00-18294344-01 или аналоги;

- термометр лабораторный 0-55°С ГОСТ 8.279-78;

- холодильник бытовой ГОСТ 26678-85;

- микротермостат для пробирок 25-99°С

- камера для горизонтального электрофореза ГОСТ 4.372-85;

- источник питания для электрофореза (диапазон регулирования напряжения до 400В) ГОСТ 4.372-85;

- центрифуга лабораторная ГОСТ Р МЭК 61010-2-020-99;

- центрифуга лабораторная для микропробирок ГОСТ Р МЭК 61010-2-020-99;

- магнитная мешалка ТУ 25-11-834-73;

- весы аналитические (предел допустимой погрешности не более 0,01 мг) ГОСТ 24104-2001;

- плитка электрическая ГОСТ 14919-83;

- колбы, цилиндры стеклянные мерные ГОСТ 1770-74;

- колбы стеклянные лабораторные вместимостью 0,5 и ГОСТ 25336-82;

- микропробирки пропиленовые конические объемом 0,5 и с крышкой;

- штатив для микропробирок вместимостью 0,5 и ;

- наконечники одноразовые для дозаторов переменного объема в штативах;

- дозаторы автоматические переменного объема ТУ 9452-002-33189998-2002;

- часы сигнальные ТУ 25-07-57;

- пинцеты медицинские ГОСТ 21241-89;

- шпатели металлические ГОСТ 19126-2007;

- камера для счета форменных элементов крови по Горяеву ТУ 42-816;

- стекла покровные для микропрепаратов ГОСТ 6672-75;

- стекла предметные ГОСТ 9284-75;

- спиртовка лабораторная стеклянная ГОСТ 25336-82;

- фильтры АФА-ВП-10 ТУ 95-743-80;

- фильтровальная бумага ГОСТ 12026-76;

- агароза универсальная Тип I

- агароза легкоплавкая (низкоплавкая) Тип VII

- вода дистиллированная ГОСТ 6709-02;

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду ГОСТ 6709-72

- натрия гидроокись ГОСТ 4328-77;

- этилендиамин-N,N,N[],N[]-тетрауксусной кислоты динатриевая соль двухводная ГОСТ 10652-73;

- N-лауроилсаркозин натриевая соль

- натрий хлористый ГОСТ 4233-77;

- натрий фосфорнокислый двухзамещенный ГОСТ 4172-76;

- калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75;

- калий хлористый ГОСТ 4234-77;

- трис (гидроксиметил)-аминометан ТУ 6-09-4292-76;

- тритон Х-100

- этидий бромистый ТУ 6-09-13-452-75

- краситель SYBR Green I (возможно использование других красителей, применяемых для визуализации ДНК: DAPI; пропидиум иодид, акридиновый оранжевый и др.)

- эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота

- среда ДМЕМ;

- среда RPMI-1640

- смесь Ficoll-Paque или аналогичная

- L-глутамин

- пенициллин

- стрептомицин.

3.1. Характеристика объектов исследования.

Для оценки генотоксических свойств в качестве тест-объекта используют традиционно применяемые в генотоксикологических исследованиях клетки первичных и перевиваемых клеточных культур человека (лимфоциты периферической крови и фибробласты человека, карцинома шейки матки HeLa, карцинома легкого А-549, карцинома гортани Нер2 и др.). Среди данных тест-объектов целесообразно использовать лимфоциты периферической крови, клеточные культуры фибробластов человека или HeLa, что обусловлено рядом их преимуществ по сравнению с другими клетками: простота процедуры получения материала; высокая синхронизированность популяции клеток, широкая изученность биологических процессов.

4. Культивирование перевиваемых культур клеток

Фибробласты и клетки HeLa культивируют в среде DMEM с 0,3 мг/мл L-глутамина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Cibro BRL, США), 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в контролируемых условиях (37°С, 5% ) в пластиковых флаконах с площадью дна (посевная концентрация клеток/флакон).

5. Подготовка к исследованию

5.1. Подготовка растворов и буферов.

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) рН 7,4 (хранят при 4°С).

Фосфатно-солевой буфер с 1мМ ЭДТА-Na (ФСБ+ЭДТА) рН 7,4 (хранят при 4°С).

Универсальная 1% агароза.

Готовят 10 мл 1% раствора универсальной агарозы в ФСБ+ЭДТА в стеклянном флаконе с крышкой на водяной бане до получения полностью прозрачного геля.

Легкоплавкая 1% агароза.

Готовят 1% раствор легкоплавкой агарозы в ФСБ+ЭДТА и инкубируют в микротермостате при 70°С до получения полностью прозрачного агарозного геля. Приготовленный агарозный гель охлаждают до .

Легкоплавкая 0,5% агароза.

Основной лизирующий раствор.

Готовят основной лизирующий раствор - 10 мМ Трис-HCl (рН 10) 2,5М NaCl, 100 мМ ЭДТА-Na. Раствор хранится при комнатной температуре в течение месяца.

Рабочий лизирующий раствор готовится и используется непосредственно в день эксперимента

Готовят 1% раствор Тритон-Х100 в основном лизирующем растворе.

Щелочной раствор для электрофореза (рН[]13).

Готовят раствор 0,3M NaOH и 1мМ ЭДТА-Na. Раствор охлаждают до 4°С.

Раствор этидиум бромида.

Готовят раствор с концентрацией этидиум бромида в ФСБ. Полученный раствор хранят при 4°С.

SYBR Green I

Готовят раствор SYBR Green I 1:10 000 в ТЕ-буфере. Полученный раствор хранят при 4°С не более 2 недель.

6. Подготовка объектов исследования

6.1. Подготовка перевиваемых клеток.

Непосредственно перед тестированием клеточный монослой 2 раза промывают ФСБ без и и заливают на 5 минут 0,05% раствором трипсина ( на флакон). Затем инактивируют трипсин средой для культивирования клеток, осторожно пипетируют клетки в среде до образования однородной суспензии. После чего клетки осаждают центрифугированием (5 мин 400 g). После этого клетки еще 2 раза отмывают в охлажденном растворе ФСБ+ЭДТА (4°С).

Жизнеспособность клеток оценивают окраской 0,4% трипанового синего. Суспензию клеток разводят до концентрации (подсчет клеток осуществляют в камере Горяева). До получения микропрепаратов возможно хранение клеток при 4°С не более 3 часов.

6.2. Получение лимфоцитов периферической крови.

Для исследования кровь берут у здоровых доноров в возрасте от 20 до 40 лет, не работающих в сфере химического производства, не контактирующих с источниками ионизирующего излучения, не болевших за последние 3 - 6 месяцев вирусными заболеваниями и не проходивших за последние 6 месяцев рентгенодиагностическое обследование. Из локтевой вены асептически отбирают аликвоту крови и переносят в стерильные пробирки, содержащие содержащих антикоагулянт. Цельную кровь смешивают с равным объемом среды RPMI-1640 (без L-глютамина) и осторожно наслаивают на градиентную смесь фиколла Ficoll-Paque (или аналогичную) плотностью 1.077 и центрифугируют при 400 g в течение 40 мин. Образующее на разделе фаз "кольцо" из мононуклеаров аккуратно отбирают пипеткой и дважды отмывают средой RPMI-1640 центрифугированием при 400 g в течение 10 мин. После второй отмывки осадок разводят в среде RPMI-1640 до концентрации клеток и помещают до использования в холодильник при 4°С.

6.3. Подготовка исследуемых образцов.

6.3.1. Растворители.

При работе с гидрофильными веществами в качестве растворителя используют бидистиллированную воду. При работе с гидрофобными веществами в качестве растворителя используют диметилсульфоксид или этиловый спирт в конечной концентрации не более 1%. При необходимости допускается использование других растворителей в концентрациях, не вызывающих токсического эффекта, что должно быть установлено экспериментально.

6.3.2. Контроли.

В качестве негативного контроля используется растворитель, вносимый в эквивалентных объемах. В качестве позитивного контроля используют пероксид водорода. Непосредственно перед использованием готовят 1 мМ раствор пероксида водорода в охлажденном (4°С) ФСБ.

6.3.3. Исследуемые концентрации.

Во избежание ложноположительных или ложноотрицательных результатов образцы исследуются в концентрациях, не вызывающих изменение рН инкубационной среды и/или осмотического давления.

Исследование начинают с определения цитотоксичности in vitro. В качестве максимальной исследуемой концентрации принимается . Если превышает 10 мМ, то в качестве максимальной концентрации принимается последняя. Для низкотоксичных и нетоксичных образцов в качестве максимальной используется концентрация , либо 10 мМ. Две последующие концентрации для исследования составляют 1/10 и 1/100 от максимальной.

6.3.4. Подготовка парфюмерно-косметической продукции и средств гигиены полости рта.

Экстракты из испытуемых образцов готовят согласно MP N 29 ФЦ/394 от 29.01.03 путем настаивания в дистиллированной воде. Соотношения веса образца и объема модельной среды (дистиллированной воды) приведены в таблице 1. Навески образцов взвешивают в сухой чистой колбе, куда потом добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельную среду и обе колбы помещают в термостат на 24 часа при 37°С. После окончания экстракции растворы охлаждают до комнатной температуры.

Таблица 1

Условия приготовления экстрактов

Вид продукции	Масса образца, г	Объем модельной среды, мл	Степень разведения образца	Продолжительность экстракции, час
Шампуни для волос и тела	0,1	250	1:2500	24
Жидкое туалетное мыло	0,1	250	1:2500	24
Пена для ванн, гель для душа	0,1	250	1:2500	24
Дезодоранты и депилятории в аэрозольной упаковке	1,0	300	1:300	1
Туалетная и парфюмированная вода, духи, одеколон, спиртосодержащие лосьоны	1,0	700	1:700	1
Зубные пасты и отбеливающие системы	0,1	250	1:2500	1

После завершения экстракции раствор подвергают фильтрации через бумажный фильтр. Фильтрованию также подвергают модельную среду. Используют фильтр АФА-ВП-10 диаметром 9 см. Бумажные фильтры заранее промывают в дистиллированной воде. Для этого 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1,5 л дистиллированной воды. Стакан накрывают и ставят в термостат на 24 часа при 37°С. Затем воду сливают и высушивают фильтры, не вынимая из стакана, в термостате до постоянной массы. Достижение постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.

6.3.5. Подготовка товаров бытовой химии.

Растворы образцов готовят согласно MP N 29 ФЦ/4746 от 27.12.01. Испытуемый образец в количестве 0,1 г помещают в мерную колбу с притертой крышкой, объемом , и доводится до метки дистиллированной водой, что соответствует разведению образца 1:2500. Это разведение является стандартным для исследования моющих средств. Во вторую колбу в качестве контроля помещается дистиллированной воды. Обе колбы помещают в термостат на 24 часа при 37°С, затем охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения контрольный и опытный образцы подвергают фильтрованию через бумажный фильтр.

6.3.6. Подготовка изделий из полимерных материалов.

Образцы изделий из полимерных материалов готовятся согласно МУ N 1.1.037-95 от 20.12.95.

Изделия из полимерных материалов измельчаются на куски максимальным сечением 20x20 мм. Навеску 30 г помещают в термостойкую колбу, емкостью , заливают кипящей дистиллированной воды. По достижении температуры вытяжки 37°С колбу помещают в термостат и выдерживают до 24 часов при температуре 37°С.

6.3.7. Подготовка стекол для микропрепаратов.

Обезжиренные предметные стекла выкладывают на термостатируемую поверхность электрической плитки, нагретой до 65 - 70°С. Расправленную 1% агарозу из расчета на площадь стекла , дозатором наносят на край стекла и равномерно распределяют по всей поверхности. После полного высыхания геля стекла снимают и охлаждают до комнатной температуры. Приготовленные стекла для микропрепаратов могут храниться 1 месяц при комнатной температуре.

7. Процедура тестирования

7.1. Инкубация клеток с исследуемыми образцами.

В микропробирки, содержащие ФСБ, вносят 20 раствора исследуемого образца и клеточной суспензии (). Для контроля растворителя в микропробирки приливают ФСБ, растворителя и клеточной суспензии (). Клеточную суспензию с образцами инкубируют при 37°С в течение 30 минут и 3 часов. По окончании инкубации пробирки центрифугируют при 400 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливают и осажденные клетки дважды отмывают в ФСБ+ЭДТА центрифугированием при 400 g 5 минут. После второй отмывки осажденные клетки разводят ФСБ+ЭДТА и сразу приступают к процедуре получения микропрепаратов. Каждая экспериментальная точка проводится не менее чем в двух повторностях, по три микропрепарата на каждую повторность.

раствора пероксида водорода вносят в микропробирки и добавляют клеточной суспензии () и инкубируют 5 мин при 4°С. По окончании инкубации пробирки центрифугируют при 400 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливают и осажденные клетки дважды отмывают в ФСБ+ЭДТА центрифугированием при 400 g 5 минут. После второй отмывки осажденные клетки разводят ФСБ+ЭДТА и сразу приступают к процедуре получения микропрепаратов.

7.2. Приготовление микропрепаратов.

При использовании предметных стекол нестандартного размера для получения микропрепаратов исследуемые клетки иммобилизируют в трехслойные агарозные блоки по принципу "сэндвича". На стекла с высушенной универсальной 1% агарозой наносят слой универсальной 1% агарозы. Охлаждают 5 минут 4°С для застывания геля. В микропробирке быстро смешивают в равных частях (1:1) 1% легкоплавкую агарозу с суспензией клеток после воздействия исследуемых образцов и наносят следующим слоем. Охлаждают 5 минут при 4°С для застывания геля. После этого наносят третий слой - 0,5% легкоплавкую агарозу и охлаждают 5 мин при 4°С.

При использовании стандартных стекол в микроцентрифужные пробирки с агарозного геля вносят клеточной суспензии 2 - 3 раза прокачивают дозатором. В центральную часть предметного стекла наносят полученного агарозного геля с клетками и накрывают покровным стеклом под углом, так, чтобы не было пузырей. Предметные стекла кладут на поверхность емкости со льдом и оставляют на 10 мин для затвердевания геля. Аккуратно снимают покровные ст