Наставление по лабораторной диагностике орнитоза (хламидиоза) птиц (утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 26 апреля 1999 г. N 13-7-2/1573)

1. Общие положения

1.1. Лабораторные исследования на хламидиоз птиц включают:

- выявление специфических антител в сыворотке крови больных птиц в РСК (РНСК) или ИФА;

- обнаружение хламидий или антигенов хламидий в патологическом материале методом световой или люминесцентной микроскопии;

- выделение хламидий на куриных эмбрионах или лабораторных животных с последующей их идентификацией;

- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2. Работа с возбудителем хламидиоза птиц допускается в лабораториях, имеющих условия для работы с особо опасными инфекциями и разрешение СЭС на работу с возбудителями 1-2 групп; исследования на хламидиоз проводят в отдельном боксе или отдельной комнате с настольным боксом.

Работа с возбудителем орнитоза также может проводиться в ПЦР-лаборатории с предварительно инактивированным материалом, прогретым при 70-80°С в течение 10 мин или залитым 0,5%-ным раствором фенола или гуанидин тиоционатом в концентрации 5,3 моль/л.

1.3. Диагноз на хламидиоз птиц устанавливают на основании анализа эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений с учетом результатов лабораторных исследований.

В лабораторию для исследования направляют сыворотку крови, патологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), павших или вынужденно убитых птиц или патологический материал от них (кусочки печени, селезенки, экссудат брюшной полости).

Патологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), для исследования необходимо брать в количестве не менее трех образцов от одной и той же особи в течение 5 суток в связи с непостоянным выделением возбудителя у инфицированной птицы.

Сыворотку крови для серологического исследования берут на 5-12 день заболевания и направляют в лабораторию в количестве 1-2 куб. см. Сыворотки хранят при температуре минус (18-20)°С и исследуют одномоментно. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой не пригодны.

Патологический материал берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками, упаковывают в отдельные пакеты с номерами или надписями и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал можно не более 7 суток при 4°С и 10-12 мес. при температуре минус (18-20)°С.

Патологический материал отбирают не позднее 2 ч после гибели или убоя птицы с соблюдением правил асептики, помещают его в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками и затем в термос со льдом.

Трупы птиц заворачивают в несколько слоев марли или ткани, смоченной 5%-ным раствором хлорамина, и помещают во влагонепроницаемую тару, опечатывают и в тот же день (не позднее 24 часов после взятия) доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих рассеивание возбудителя. В лаборатории вскрытие трупов птиц с подозрением на хламидиоз проводят в отдельном боксе с соблюдением правил работы с особо опасным материалом.

2. Выявление комплементсвязывающих антител

2.1 Специфические антитела к хламидиям можно выявить в крови птиц, начиная с 5-12 дней после их заболевания, в реакции связывания комплемента (РСК), или реакции непрямого связывания комплемента (РНСК) или иммуноферментным анализом (ИФА). В отличие от РСК и ИФА, РНСК выявляет "неполные" антитела, образующиеся в крови некоторых видов птиц.

2.2. Постановка РСК.

2.2.1 Компоненты реакций и их подготовка к работе:

- комплементсвязывающий группоспецифический и контрольный антигены, иммунную и отрицательные сыворотки, применяют в рабочих титрах, указанных на этикетках:

- стандартную гемолитическую сыворотку (гемолизин) используют в утроенном титре (например, титр гемолизина 1:1500, а в реакцию берут в разведении 1:500:

- эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об./мин в течение 10-15 мин до полного просветления надосадочной жидкости и готовят 3%-ную взвесь из осадка на физиологическом растворе;

- комплемент (свежая, консервированная и лиофильно высушенная сыворотка морской свинки) в рабочем титре, установленном в день постановки реакции;

- физиологический раствор (0,85%) химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде рН 7,2-7,4;

- испытуемые сыворотки (свежие или консервированные) разводят 1:8 физраствором и инактивируют в водяной бане при 58-60°С 30 мин.

Гемолитическую систему - смесь равных объемов 3% взвеси эритроцитов и рабочего разведения гемолизина - выдерживают 30 мин при 37°С для сенсибилизации.

2.2.2. Титрование комплемента.

За рабочее разведение принимают разведение комплемента через одну влево от последней пробирки с полным гемолизом. В данном примере полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:40, рабочее разведение его 1:20

Определение рабочего разведения комплемента проводят по следующей схеме:

NN пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Получаемые разведения комплемента	1:10	1:20	1:30	1:40	1:50	1:60	1:70	1:80	1:90	1:100
Комплемент в разведении 1:10	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Физиологический раствор	-	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
титрование комплемента
Комплемент в разведении	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Физиологический раствор	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Гемолитическая система	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
водяная баня 37-38 гр. С - 30 мин
Примерный результат	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЗГ	ЗГ	ЗГ	ЗГ

ПГ - полный гемолиз, ЧГ - частичный гемолиз, ЗГ - задержка гемолиза

Комплемент в рабочем разведении титруют на специфической, негативной и испытуемой сыворотках в присутствии специфического антигена по следующей схеме:

Компоненты	NN пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Комплемент в рабочем разведении	0,02	0,03	0,04	0,05	0,06	0,07	0,08	0,09	0,1
Физиологический раствор	0,08	0,07	0,06	0,05	0,04	0,03	0,02	0,01	-
Антиген специфический в рабочем разведении	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Сыворотка негативная (специфическая, испытуемая), разведение 1:8	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Холодильник 4-6 гр.С - 16-18 часов
Гемолитическая система	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Водяная баня 37-38 гр. С - 40 мин

Титром комплемента считают минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками в присутствии антигена при задержке гемолиза в аналогичной пробирке со специфической сывороткой.

Рабочей дозой является доза комплемента на один интервал вправо. В случае инкубации ингредиентов 16-18 ч при 4-6°С за рабочую дозу принимают удвоенный титр комплемента

Расчет количества чистого комплемента для главного опыта делают по формуле:

где К - комплемент в рабочей дозе; П - количество пробирок в опыте;

Р - рабочее разведение комплемента.

2.2.3. Постановка главного опыта РСК.

Реакцию ставят в объеме 0,5 куб. см в пробирках Флоринского. Разведенные и инактивированные сыворотки исследуют со специфическим, контрольным антигенами и без антигена (контроль на антикомплементарность).

Одновременно с главным опытом ставят контроли: позитивной сыворотки до ее предельного титра и негативной в том же разведении, как испытуемые, со специфическим антигеном; специфического и контрольного антигена - на антикомплементарность.

Главный опыт и контроли ставят по схеме:

Компоненты реакции	NN пробирок			Контроли
	1	2	3	сывороток						антигенов
Испытуемые сыворотки	0,1	0,1	0,1	-	-	-	-	-	-	-	-
Позитивная сыворотка до предельного титра	-	-	-	0,1	0,1	0,1	-	-	-	-	-
Негативная сыворотка 1:8	-	-	-	-	-	-	0,1	0,1	0,1	-	-
Антиген специфический в рабочем разведении	0,1	-	-	0,1	-	-	0,1	-	-	0,1	-
Антиген контрольный в рабочем разведении	-	0,1	-	-	0,1	-	-	0,1	-	-	0,1
Физиологический раствор	-	-	0,1	-	-	0,1	-	-	0,1	0,1	0,1
Комплемент в рабочем титре	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Водяная баня 37-38 гр. С - 1 час или холодильник 4-6 гр. С - 16-18 час.
Гемолитическая система	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Водяная баня 37-38 гр. С - 40 мин

2.2.4. Учет и оценка результатов реакции.

Реакцию учитывают через 30 мин. после извлечения штативов из водяной бани. Результаты реакции считают действительными при следующих показаниях контролей:

- задержка гемолиза в пробирках со специфическим антигеном и сывороткой до ее предельного титра;

- полный гемолиз во всех пробирках с негативной сывороткой, со специфической сывороткой без антигена и с контрольным антигеном; в контролях антигенов на антикомплементарность.

Оценку результатов реакции проводят по степени задержки гемолиза эритроцитов и выражают по четырехкрестовой системе:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

- (минус) - полный гемолиз, осадок отсутствует.

Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 2-4 креста в пробирке с испытуемыми сыворотками в разведении 1:8 и специфическим антигеном. Сомнительной при задержке гемолиза на 1 крест, отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов.

2.3 Постановка РНСК.

2.3.1. Постановку реакции до главного опыта проводят по той же схеме, что и РСК, но в объеме 0,6 куб. см (путем добавления 0,1 куб. см физиологического раствора).

2.3.2. Главный опыт РНСК проводят в три этапа:

1 этап - испытуемые сыворотки со специфическим и контрольным антигенами выдерживают 1 ч при 37-38°С.

2 этап - во все пробирки вносят иммунную сыворотку, разведенную до предельного титра и комплемент в рабочей дозе по 0,1 куб. см, смесь инкубируют 1 ч при 37-38°С или 16-18 ч при 4°С.

3 этап - добавляют гемолитическую систему по 0,2 куб. см и выдерживают 30 мин при 37-38°С.

2.3.3. Учет и оценка реакции.

Учет реакции проводят через 30 мин после изъятия штативов из водяной бани; степень гемолиза, как и в РСК, выражают по четырехкрестовой системе, но оценивают в обратном порядке:

++++ (4 креста) - реакция отрицательная;

+++ (3 креста) - реакция отрицательная;

++ (2 креста) - реакция отрицательная;

+ (1 крест) - реакция положительная;

- (минус) - реакция положительная.

3. Постановка ИФА

3.1. ИФА применяют для ретроспективной диагностики орнитоза (пситтакоза) птиц и эпизоотологического обследования особей путем выявления специфических антител в сыворотках крови.

3.2. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызвать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

3.3. Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:

3.3.1. В состав набора входят:

1 - специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный - 1 амп.;

2 - специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная - 1 амп.;

3 - отрицательная сыворотка, лиофилизированная - 1 амп.;

4 - пероксидазный антивидовой конъюгат, лиофилизированный - 1 амп.

Химический набор, в состав которого входят:

5 - КН2Р04 - 1 амп.;

6 - К2НР04 - 1 амп.;

7 -NaCI - 1 амп.;

8 - Твин-20 (-40.-80, Тритон Х-100) - 1 амп.;

9 - лимонная кислота - 1 амп.;

10 - К2HPO4 - 1 амп.;

11 - 0-фенилендиамин - 2 амп.;

12 - гидроперит - 1 табл.;

13 - две 96-луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;

14 - стоп-раствор - 1 флакон.

3.3.2. Оборудование:

1 - одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от 0,05 куб. см до 1 куб. см;

2 - стеклянные пипетки на 1-2 куб. см;

3 - промывающее устройство;

4 - спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.

3.4. Приготовление рабочих растворов:

- Буфер N 1 - (0,01М калий фосфатный, рН 7,2-7,4) предназначен для растворения антигена. Содержимое ампул 5, 6, 7 растворяют в 2500 куб. см дистиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН корректируют 0,1 N КОН или НСl.

- Буфер N 2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также для промывки микропанелей. К 2000 куб. см буфера N 1 добавляют содержимое ампулы N 8.

- Буфер N 3 - (фосфатно-цитратный) предназначен для приготовления субстрата (рН 5,0-5,2). Состоит из двух компонентов: растворов А и Б.

А - содержимое ампулы N 9 растворить в 50 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе.

Б - содержимое ампулы N 10 растворить в 50 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе, затем к 24,3 куб. см раствора А добавить 25,7 куб. см раствора Б и 50 куб. см дистиллированной воды, проверить рН. В случае необходимости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) компоненты буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на последней стадии. Содержимое ампулы N 11 растворить в 2 куб. см спирта-ректификата и добавить 48 куб. см буфера N 3, внести 0,8 куб. см перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки N 12 в 10 куб. см дистиллированной воды.

Буферные растворы хранят при температуре 4-6 гр. С не более 3 мес.

ГАРАНТ:

Нумерация подпунктов приводится в соответствии с источником

3.4.2. Подготовка биологических компонентов реакции:

Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 куб. см буфера N 1.

Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 куб. см буфера N 2.

Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 куб. см буфера N 2, получая разведение 1:200.

Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при 4-6°С в течение 3-4 дней.

3.5. Постановка иммуноферментной реакции.

Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.

3.5.1. Сорбция антигена на микропанели.

3.5.2. Промывание микропанели.

Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку заполняют буфером N 2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание повторяют 4-5 раз.

Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее устройство.

3.5.3. Разведение сывороток.

В три лунки микропанели вертикального ряда А1, В1, С1 вносят по 0,1 куб. см специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три следующие лунки D1, Е1, F1 вносят по 0,1 куб. см отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п. 3.4.2. В лунки G1, Н1, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 куб. см буфера N 2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с лунок А2 и Е2 по 0,2 см3 исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в п. 3.4.3 и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с разведения 1:200 до 1:6000.

Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37°С в термостате в течение часа.

3.5.4. Внесение конъюгата.

Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.

Во все лунки вносят по 0,1 куб. см рабочего раствора иммуноферментного конъюгата, подготовленного согласно п. 3.4.2, и инкубируют в термостате при 37°С в течение 1 часа.

3.5.5. Промывают 5 раз как указано в п. 3.5.2.

3.5.6. Проявление реакции.

Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4 1.

Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 куб. см субстратно-индикаторного раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30-40 мин.

В каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-раствора.

3.6 Учет результатов реакции.

Результаты учитывают в течение 30-40 мин после внесения стоп-раствора.

3.6.1 Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

3.6.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП 490)

Положительными считаются пробы, ОП 490 которых в два и более раза превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.

Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельствует об отрицательной реакции.

3.7. Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.

3.8. Птиц, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.

4. Обнаружение хламидий в патологическом материале

Из патологического материала готовят мазки или мазки-отпечатки (с висцеральной поверхности внутренних органов: сердца, печени, селезенки; при гидроперикардите - из перикардной жидкости) для световой и люминесцентной микроскопии.

4.1. Метод световой микроскопии. При исследовании материала методом световой микроскопии мазки или мазки-отпечатки окрашивают по Романовскому-Гимзе.

При окраске по Романовскому-Гимзе подсушенные на воздухе препараты фиксируют метиловым спиртом в течение 1 мин или спирт-эфиром в течение 15-20 мин и окрашивают краской Романовского-Гимзе, разведенной в соотношении 1:10 фосфатным буфером (рН 7,2-7,6) в течение 1,5 часов, после чего их промывают дистиллированной водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Окрашенные и высушенные препараты просматривают в световом микроскопе под иммерсионным объективом. Цитоплазматические включения представляют компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии клетки, имеют разнообразную правильную или неправильную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца со средним диаметром от 0,5 до 1,2 мкм имеют сине-фиолетовый цвет, крупные включения, содержащие преимущественно мелкие зернистые структуры возбудителя имеют розово-красный цвет. Обычно в одной клетке выявляются включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности расположения. Нередко, при рыхлом расположении морфологических структур микроорганизма, обнаруживается содержащая их вакуоль.

4.2. Метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции (ИФ).

Для исследования методом прямой и непрямой ИФ мазки готовят непосредственно после взятия материала с конъюнктивы и клоаки у птиц, используя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной адсорбцией. Материал отбирают вращательным движением тампона и переносят на лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют, указывая номер и дату взятия пробы. Приготовленный мазок высушивают на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин или наносят на мазок 2-3 капли ацетона до полного его испарения. Стекло с фиксированным препаратом может храниться при температуре (18-20)°С в течение 5 сут.

4.2.1. Для проведения прямой ИФ используют набор, в состав которого входят:

- компонент N 1 - лиофилизированные моноклональные антитела, меченные флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие краситель Эванса; сухая гомогенная аморфная масса синевато-сиреневого цвета - 1 флакон, 0,1 куб. см;

- компонент N 2 - растворитель для лиофилизированных иммуноглобулинов, прозрачная бесцветная жидкость - 1 флакон, 3,0 куб. см;

- компонент N 3 - жидкость для "заключения" препарата, вязкая прозрачная маслянистая жидкость - 1 флакон, 2,0 куб. см.

Оборудование:

- люминесцентный микроскоп;

- термостат на 37°С;

- чашки Петри;

- предметные стекла с лункой;

- фильтровальная бумага;

- микропипетки на 30 мкл;

- наконечники в штативе.

4.2.2. При исследовании прямым методом ИФ на специальную лунку предметного стекла с фиксированным материалом с помощью микропипетки вносят 30 мкл меченных ФИТЦ моноклинальных антител. С помощью наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно распределяют реагент по всей поверхности лунки с материалом.

4.2.3. Инкубация мазков-отпечатков. Мазки с нанесенным на них реагентом инкубируют во влажной камере (в чашке Петри) при температуре в течение 30 мин, периодически проверяя их состояние во избежание высыхания реагента на препарате, что может привести к ложноположительным результатам при диагностике, поэтому высохшие препараты бракуются.

4.2.4 Промывание предметных стекол. По истечении срока инкубации предметные стекла тщательно промывают дистиллированной водой в течение 10 с, остатки воды удаляют с краев стекла фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.

4.2.5. Микроскопирование мазков. На мазок наносят 20 мкл жидкости для "заключения" препарата (компонент N 3), покрывают обезжиренным покровным стеклом и просматривают препарат в люминесцентном микроскопе при комбинации светофильтров СЗ 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при использовании окуляра Х 10 и объектива с масляной иммерсией Х 90, с использованием нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Препарат рекомендуется просматривать сразу же после приготовления. Смонтированные препараты можно хранить при температуре 2-8°С не более 24 ч.

4.2.6. Учет результатов прямой ИФ. Диагноз на хламидиоз считается положительным, если в препарате диагностируют наличие элементарных телец хламидий, расположенных внеклеточно и представляющих собой ярко-зеленые образования округлой формы с ровными краями, размером около 300 мкм (приблизительно 1/100 от окружающих эпителиальных клеток). Иногда наблюдаются ретикулярные тельца хламидий, размеры которых в 2-3 раза больше элементарных. Внутриклеточные включения выявляются не более, чем в 10% случаев.

Диагноз на хламидиоз считается отрицательным, если в препарате отсутствует специфическое ярко-зеленое свечение при наличии красных эпителиальных клеток. Для того, чтобы отрицательный диагноз можно было считать достоверным, рекомендуется просматривать все поле мазка не менее 5 мин.

В качестве отрицательного контроля проводят микроскопию мазков, приготовленных из конъюнктивы заведомо здоровых животных, специфическое ярко-зеленое свечение при наличии красных эпителиальных клеток должно отсутствовать.

Любой флюоресцирующий материал неправильной формы или другого цвета, а также имеющий неяркую зеленую окраску, рассматривается как артефакт.

4.2.7. При исследовании препаратов непрямым методом ИФ на фиксированный мазок или мазок-отпечаток наносят иммунную хламидийную нефлуоресцирующую сыворотку и выдерживают его во влажной камере при тех же условиях. Затем промывают физиологическим раствором и высушивают.

Для контроля на другой препарат наносят контрольную отрицательную сыворотку, выдерживают во влажной камере, затем окрашивают флуоресцирующей антивидовой сывороткой.

При наличии в препаратах антигена хламидий обнаруживают специфическое свечение в виде желто-зеленых гранул округлой и овальной формы на тусклом зеленовато-сером фоне. В контрольном препарате специфическое свечение должно отсутствовать.

5. Выделение хламидий из патологического материала и их идентификация

5.1. Подготовка материала. Из патологического материала готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе рН 7,2-7,4 и центрифугируют ее при 2000 об./мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные пробирки (флаконы) и вносят в нее антибиотики: 500 мг/куб. см стрептомицина 150 мг/куб. см гентамицина или 500 ед./куб. см канамицина. Пробы экссудата (в нативном виде или разведенные 1:2 стерильным физраствором) обрабатывают теми же антибиотиками; выдерживают при 4°С в течение 2 часов и высевают на питательные среды (МПА, МПБ) для исключения бактериального загрязнения. Через сутки при отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал используют для заражения куриных эмбрионов или лабораторных животных.

5.2. Выделение хламидий на куриных эмбрионах (КЭ). Исследуемый материал, подготовленный как указано в пункте 5.1, вводят в объеме 0,2 куб. см в желточный мешок 6-7-дневным КЭ. Каждым материалом заражают не менее 6 эмбрионов. Для контроля оставляют такое же количество незараженных эмбрионов. Инкубируют КЭ в термостате при 37°С в течение 7 дней.

Гибель эмбрионов в первые двое суток после заражения считают неспецифической. Эмбрионы, погибшие на 4-7 день после заражения, вскрывают с соблюдением правил асептики, отбирают в стерильную посуду желточные мешки.

Из желточных мешков готовят мазки или мазки-отпечатки и окрашивают по Романовскому-Гимзе или моноклональными антителами, меченными ФИТЦ, и проводят идентификацию хламидий методом световой или люминесцентной микроскопии (п.п. 4.1; 4.2).

При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 7 день вскрывают и проводят второй пассаж по общепринятой методике. Для заражения используют центрифугат 10% суспензии желточных мешков, который предварительно обрабатывают антибиотиками и проверяют на отсутствие бактериальной контаминации. При пассажах специфическая гибель КЭ может наблюдаться на 3-7 сутки после заражения. Из желточных мешков погибших эмбрионов готовят мазки или мазки-отпечатки, окрашивают и исследуют методом световой или люминесцентной микроскопии.

При отсутствии специфической гибели эмбрионов во втором пассаже проводят третий пассаж

Обнаружение хламидий или антигенов хламидий или ДНК хламидий в мазках-отпечатках или патматериале из желточных мешков эмбрионов в любом из трех последовательных пассажей считают положительным результатом.

5.3. Выделение хламидий из лабораторных животных. Для выделения хламидий из патологического материала заражают не менее четырех белых мышей весом 5-10 г. Исследуемый материал, подготовленный как указано в п. 5.1., вводят внутрибрюшинно в дозе 0,5-1,0 куб. см или в мозг в дозе 0,03 куб. см.

При внутрибрюшинном заражении животные находятся под наблюдением в течение 10 дней. У больных и павших мышей при вскрытии обнаруживают скопление экссудата в брюшной полости, увеличение селезенки и печени, очаговую гиперемию легких.

При заражении животных в мозг наблюдение за ними проводят в течение 7 дней. Животные погибают с клиническими признаками энцефалита.

Из пораженных органов (паренхиматозных органов или оболочек мозга) и экссудата готовят мазки или мазки-отпечатки, и исследуют с помощью световой или люминесцентной микроскопии на наличие хламидий или их антигенов.

При отсутствии специфической гибели животных убивают эфиром или хлороформом и проводят второй пассаж на том же виде и количестве животных. Для внутрибрюшинного заражения используют центрифугат 10%-ной суспензии паренхиматозных органов мышей, зараженных в первом пассаже; при заражении в мозг - центрифугат 10%-ной суспензии из оболочек головного мозга.

Из пораженных органов больных или павших мышей готовят мазки-отпечатки и исследуют методом световой или люминесцентной микроскопии.

При отсутствии специфической гибели животных во втором пассаже проводят третий пассаж.

Результаты исследования считают положительными в случае обнаружения хламидий или их антигенов или ДНК хламидий в мазках-отпечатках или в патматериале из органов больных или павших животных в любом из трех последовательных пассажей.

6. Выявление и идентификация ДНК C.psittaci методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

6.1 Метод предназначен для выявления ДНК C.psittaci с помощью ПЦР в патологическом материале от птиц. В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 95°С, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре 62°С и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента при температуре 72°С.

В качестве неконкурентного внутреннего стандарта используется фрагмент неспецифической ДНК фага лямда, позволяющий контролировать эффективность протекания всего процесса для каждой исследуемой пробы.

Метод предназначен для идентификации хламидий методом ПЦР.

6.2. В ПЦР используют следующие наборы:

1) набор для выделения ДНК, "ДНК-сорб-ПЦР",

2) набор для ПЦР-амплификации участка ДНК хламидий,

3) набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР.

6.2.1. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:

- лизирующий раствор - 1 пробирка, 30 куб. см;

- отмывочный раствор N 1 - 1 пробирка, 20 куб. см;

- концентрат для отмывочного раствора N 2 - 1 пробирка, 20 куб. см;

- суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 куб. см;

- буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 куб. см.

Дополнительно необходим 96%-ный этанол (ректификат), 100 куб. см.

6.2.2. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:

- смесь праймеров "Chla" - 1 пробирка, 0,25 куб. см;

- смесь праймеров "ВС-Л" - 1 пробирка, 0,25 куб. см;

- смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,5 куб. см;

- 5-кратный реакционный буфер - 1 пробирка, 1,0 куб. см;

- деионизованная вода - 1 пробирка, 2 куб. см;

- фермент Taq-полимераза - 1 пробирка, 0,1 куб. см;

- положительная контрольная ДНК (ДНК C.psittaci) - 1 пробирка, 0,2 куб. см;

- ДНК внутреннего стандарта (ДНК ВС-Л) - 1 пробирка, 1,0 куб. см;

- воск для ПЦР - 2 пробирки по 1,0 куб. см;

- масло минеральное - 1 пробирка, 5,0 куб. см.

6.2.3. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:

- концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 куб. см;

- агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.

6.3. Отбор материала для исследования.

6.3.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

6.3.2. Для исследования используют: соскобы с конъюнктивы и клоаки, биоптаты (кусочки паренхиматозных органов), помет.

6.3.3. Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 куб. см, из тканей и органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см (при невозможности толщина кусочков может быть меньше).

6.3.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при 4°С. Допускается хранение материала при минус 20°С в течение 30 дней.

6.4. Подготовка исследуемого материала.

6.4.1. Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипеточными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с использованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 куб. см и 10,0 куб. см (ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.

6.4.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 куб. см центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10-15 мин. При необходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора. Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,5 куб. см жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 куб. см материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспендируют в оставшейся надосадочной жидкости, переносят в пробирку "эппендорф" и осаждают на микроцентрифуге при 11000 об./мин в течение 8-10 мин. Супернатант отбрасывают, осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК.

6.4.3. Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, размером 3х3х3 мм помещают в пробирки типа "эппендорф", тщательно растирают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 куб. см физиологического раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре 20-25°С в течение 30 мин, после чего верхнюю фазу переносят в другие пробирки "эппендорф" и центрифугируют при 11000-12000 об./мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК.

6.4.4 Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 куб. см физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11000-12000 об./мин в течение 3-5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то пробу обрабатывают 1-2 куб. см раствора 0,1М меркаптоэтанола, добавив его в "эппендорф". Размешивают на вортексе, выдерживают при комнатной температуре 3-5 мин и центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения.

6.4.5. Пробы помета птиц в количестве 0,1-0,2 г вносят в пробирку с 0,5 куб. см физиологического раствора, тщательно перемешивают и осаждают на микроцентрифуге при 2000 об./мин в течение 1 мин. Осадок отбрасывают, а Супернатант используют для выделения ДНК.

6.5 Проведение ПЦР-анализа.

6.5.1. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), для работы в которых дополнительно требуются следующие материалы и оборудование:

Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1:

- настольный бокс с бактерицидной лампой;

- термостат для пробирок типа "эппендорф" на 25-100°С;

- микроцентрифуга до 12000-16000 об./мин;

- центрифуга/вортекс "Микроспин";

- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001 куб. см до 1 куб. см;

- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;

- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 куб. см типа "эппендорф";

- штативы для пробирок, наконечников;

- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;

- холодильник на 2-8°С с морозильной камерой.

Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2:

- амплификатор;

- ПЦР-бокс или отдельный стол с УФ-лампой;

- отдельный халат и одноразовые перчатки;

- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001 куб. см до 1 куб. см;

- одноразовые наконечники в штативах:

- одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 куб. см;

- штативы для микропробирок на 0,5 куб. см;

- холодильник на 2-8°С, морозильник на минус 20°С для выделенных ДНК;

- термостат для микропробирок с воском на 95°С.

Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3:

- камера для горизонтального электрофореза;

- источник постоянного тока на 150-200 В;

- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;

- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка;

- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;

- аквадистиллятор;

- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки:

- отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;

- мерный цилиндр на 1 л;

- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;

- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.

6.5.2. Порядок работы.

Этап 1. Выделение ДНК из исследуемого материала

Выделение ДНК из 100 мкл предварительно подготовленного патологического материала проводят с помощью набора "ДНК-сорб-ПЦР".

Приготовить отмывочный раствор 2, для этого в отдельном флаконе смешать 20 куб. см концентрата из набора, 80 куб. см дистиллированной воды и 100 куб. см 96% этанола. Хранить раствор при комнатной температуре в плотно завинчивающемся флаконе.

Проверить состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии.

В плотно закрывающуюся полипропиленовую пробирку на 1,5 куб. см (желательно с завинчивающейся крышкой) внести по 100 мкл предварительно подготовленной исследуемой пробы, отрицательной или положительной пробы, добавить по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником) и тщательно перемешать пипетированием 3-10 раз.

Добавить 15-20 мкл ресуспендированного сорбента, хорошо перемешать на вортексе, поставить в штатив на 5-7 мин для полного осаждения сорбента.

Осадить сорбент на микроцентрифуге в течение 30 сек. при 3000-8000 об./мин. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос).

Добавить по 300 мкл отмывочного раствора 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента (если сорбент плохо разбивается разбить его при помощи пипетки), осадить на центрифуге при 4000-8000 об./мин в течение 30 сек. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником.

Добавить по 800 мкл отмывочного раствора 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осадить на микроцентрифуге при 6000-10000 об./мин в течение 30 сек., отобрать супернатант.

Повторить процедуру отмывки, тщательно отобрать супернатант, высушить осадок сорбента в термостате при 65°С, в течение 5 мин.

Ресуспендировать сорбент в 30-40 мкл элюирующего буфера, поместить в термостат на 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

Осадить на микроцентрифуге при максимальных оборотах 1 мин.

Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.

В качестве отрицательного контроля на этапе выделения ДНК необходимо использовать физраствор или деионизованную воду.

Эффективность выделения ДНК с помощью набора "ДНК-сорб-ПЦР" составляет 30-60%.

Клинический или патологический материал	Соскоб с конъюнктивы или клоаки	Биопат, фекалии
Число пипетирований	5-10 раз	10 раз
Объем сорбента	20 мкл	25 мкл
Скорость осаждения сорбента	6000 об./мин	3000-4000 об./мин
Объем элюента	30-40 мкл	40 мкл
Эффективность выделения ДНК	30-40%	50-60%

Этап 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК)

Пробирку с воском ставят в термостат при 95°С до полного расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя стерильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при 120°С):

- отдельно для амплификации ДНК C.psittaci: к 0,25 куб. см праймеров "Chla" добавляют 0,25 куб. см нуклеотидов, смешивают на вортексе;

- отдельно для амплификации ДНК ВС-Л: к 0,25 куб. см праймеров "ВС-Л" добавляют 0,25 куб. см нуклеотидов, смешивают на вортексе.

Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки "Chla" или "ВС-Л". Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в амплификаторе 5 мин при 95°С и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в морозильнике несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.

Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 куб. см 5-кратного реакционного буфера добавляют 0,45 куб. см деионизованной воды и 0,05 куб. см Taq-полимеразы, хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2-8°С в течение месяца (не замораживать!). Выставляют два ряда пробирок с "нижними" смесями ("Chla" и "ВС-Л") в штатив по числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли выделения"), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода, ДНК C.psittaci и ДНК ВС-Л, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их. Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с "нижней" смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под масло вносят по 10 мкл проб - испытуемых и контрольных двух этапов анализа (для каждой пробы две пробирки - из ряда "Chla" и ряда "ВС-Л"). Набирают на амплификаторе нужную программу:

- для C.psittaci:

Амплификаторы с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения - не менее 1°С/сек.)	Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке)
"Ампли-3" (Биоком)" "MiniCycler", "PTC-100" (MJ Research)	"GeneAmp PSR System 2400" (Perkin Elmer) "Omn-E" (Hibaid) "Терцик" (ДНК-технология)
95°С - 2 мин          1 цикл	95°С - 2 мин         1 цикл
95°С - 1 мин	95°С - 10 с,
62°С - 1 мин	62°С - 10 с,
72°С - 1 мин           40 циклов	72°С - 10 с              40 циклов
10° С - 12-14 час. (хранение)	10°С - 12-14 час. (хранение)

- для ВС-Л:

95°С - 2 мин         1 цикл	95°С - 2 мин         1 цикл
95°С - 1 мин	95°С - 10 с,
65°С - 1 мин	65°С - 10 с,
72°С - 1 мин           40 циклов	72°С - 10 с              40 циклов
10°С - 12-14 час. (хранение)	10°С - 12-14 час. (хранение)

Через 1-2 мин после запуска программы, когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95°С, ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1 час 40 мин на амплификаторе с активным регулированием). После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа продуктов ПЦР, который проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.

Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:

- C.psittaci - 1033 п.н.

- ВС-Л - 500 п.н.

Этап 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР

Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения.", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 27 января 1997 г. N 13-7-2/840).

В мерный цилиндр наливают 25 куб. см концентрированного буфера, доводят дистиллированной водой до 500 куб. см, закрывают цилиндр парафинированной пленкой ("PARAFILM") и перемешивают. Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого стекла объемом 250 куб. см, наливают 100 куб. см готового буфера и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу. Заливают агарозный гель в форму (толщина 5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.

После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре) осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к положительному электроду). Наливают приготовленного буфера столько, чтобы он покрыл гель на 4-5 мм. Выставляют пробирки с продуктами амплификации в штатив в два ряда (на основе праймеров "Chla" и "ВС-Л"). Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки (например, амплификат пробы N 6 из ряда "Chla" вносят в одну полосу геля, затем амплификат той же пробы из ряда "ВС-Л" - в другую полосу. Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1-2 раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.

Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной).

Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем ультрафиолете на чувствительную пленку типа "Микрат 300" или поляроидную пленку. Документирование результатов можно проводить с помощью других систем; Insta Doc I, Insta Doc II (фотографирующие), Gel Doc 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).

6.5.3 Учет и интерпретация результатов.

Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплификации ДНК внутреннего стандарта. Все амплификаты "ВС-Л" (за исключением "контролей ПЦР" - ДНК C.psittaci и деионизованная вода) должны содержать полосу 500 п.н. Если в дорожке какой-либо исследуемой пробы полоса внутреннего стандарта отсутствует, то отрицательный результат анализа данной пробы на ДНК C.psittaci учитывать нельзя.

Положительные пробы должны содержать специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности строго на том же уровне, что и полоса с положительным контрольным образцом ДНК C.psittaci. В ярко положительных пробах может отсутствовать полоса ВС-Л и результат учитывают как положительный при условии правильного учета результатов анализа "контролей".

Отрицательными считаются пробы, которые содержат только полосу ВС-Л.

Кроме полос 1033 п.н. и 500 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. (в нижней части дорожки).

Интерпретация результатов анализа:

Результат ПЦР-анализа	Результат амплификации исследуемой пробы
	с праймерами на ДНК ВС-Л	с праймерами на ДНК С.psittaci
Положительный	+	+
Положительный	-	+
Отрицательный	+	-
Недействительный	-	-

Учет результатов амплификации контрольных образцов:

	Название реагента	с праймерами "ВС-Л"	с праймерами на "С.psittaci"
"контроли" 1-го этапа	Физиологический раствор	+	-
	Элюирующий буфер	+	-
	ДНК С.psittaci 1:10	+	+
"контроли" 2-го этапа	ДНК С.psittaci 1:10	-	+
	ДНК ВС-Л 1:10	+	-
	Деонизированная вода	-	-

Если результаты анализа контрольных образцов не совпадают с приведенными в таблице, то анализ считают недействительным и исследование повторяют.

При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.

Результаты анализа не учитываются, если:

- в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повторить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от ингибиторов реакции.

- в дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.

- в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

7. Диагноз на орнитоз (пситтакоз) птиц считают предварительным:

- при выявлении специфических антител в сыворотке крови в РСК (РНСК) или ИФА;

Диагноз на орнитоз (пситтакоз) птиц считают окончательным при применении любого прямого метода диагностики, который выявляет:

- хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом материале.

8. Сроки исследований:

- выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;

- световая микроскопия - от 30 мин до 2 часов;

- люминесцентная микроскопия - около 40 мин;

- выделение и идентификация хламидий - от 7 до 30 дней;

- выявление ДНК хламидий - от 4 до 5 часов

Заместитель руководителя Департамента ветеринарии

В.В. Селиверстов