Методические указания МУК 4.1.3557-19 "Определение фикотоксинов азаспирацидов в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС)" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 9 октября 2019 г.)

Методические указания МУК 4.1.3557-19
"Определение фикотоксинов азаспирацидов в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС)"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 9 октября 2019 г.)

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методику определения фикотоксинов азаспирацидов в морепродуктах на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Азасипирациды относятся к группе липофильных фикотоксинов. Продуцируются морскими водорослями рода Azadinium (A. spinosum, A. poporum, A. dexterороum). В настоящее время известно более 30 производных азаспирацидов. Наиболее значимыми в отношении токсического действия являются азаспирациды AZA-1, AZA-2 и AZA-3.

Азаспирациды обладают свойствами нейротоксичности, цитотоксичности, канцерогенности (являются причиной развития опухолей легких и злокачественной лимфомы) и кардиотоксичности. Азаспирациды вызывают повреждение цитоскелета, активируют апоптоз гепатоцитов (за исключением легких и почек), блокируют кальциевые каналы в клетках. Острая токсическая доза азаспирацидов для человека составляет 0,04 г/кг массы тела. В связи с тем, при попадании в организм небольшого количества токсина отмечаются только неспецифические гастроинтестинальные симптомы, возможна гипо- или гипердиагностика данного пищевого отравления, что, наряду с высокой токсичностью, обусловливает необходимость контроля этого загрязнителя в морепродуктах.

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 841.

Количественный метод определения азаспирацидов при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС) отличается хорошей воспроизводимостью, селективностью, высокой чувствительностью и надежностью, а также отсутствием необходимости использования дериватизации образцов. Нижний предел количественного определения азаспирацидов при использовании предлагаемого способа анализа азаспирацидов составляет 53 мкг/кг.

Максимально допустимый уровень содержания азаспирацидов в моллюсках установлен в Стандарте "Кодекс Алиментариус".

III. Принцип метода

3.1. Метод основан на экстракции азаспирацидов из гомогенизированных тканей морепродуктов раствором метанола с добавлением 0,1%-й муравьиной кислоты и 0,5 мМ ацетата аммония. Количество токсина определяется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

IV. Средства измерений, вспомогательные устройства материалы и реактивы

4.1. Средства измерений, вспомогательные устройства и материалы

Жидкостной хроматограф с тандемным масс-спектроскопическим детектором типа "орбитальная ловушка", снабженный автоматическим пробоотборником, термостатом колонки и двухканальным (бинарным) градиентным насосом с рабочим давлением до 200 атм.
Хроматографическая колонка стальная длиной 75 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми гидрофобными группами С18, зернением 3,5 мкм
Весы лабораторные аналитические с пределом взвешивания до 200 г и пределом допустимой погрешности г
Одноканальные автоматические пипетки переменного объема вместимостью 0,0005-0,01 и пределом допустимой погрешности 0,00001 ; 0,01-0,1 и пределом допустимой погрешности 0,0001 ; 0,1-1 и пределом допустимой погрешности 0,001
Наконечники для одноканальных пипеточных дозаторов 0,1-20 мкл; 2-200 мкл; 50-1000 мкл
Пробирки полипропиленовые центрифужные с герметичной крышкой вместимостью 2
Прибор для грубого измельчения тканей (блендер)
Скальпель
Хроматографические виалы темные с винтовой крышкой объемом 1,5
Перемешивающее устройство типа вортекс с диапазоном вращающего момента 1000-3000 об./мин
Центрифуга лабораторная роторная термостатируемая с максимальными скоростью до 14000 об./мин и относительным центробежным ускорением до 20000 g
Колбы мерные вместимостью 100	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные вместимостью 100	ГОСТ 1770

4.2. Реактивы

Азот газообразный, осч (I и II сорт)	ГОСТ 9293
Гелий газообразный вч, в баллонах по нормативным документам
Ацетонитрил для хроматографии, хч по нормативным документам
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная)	ГОСТ Р 52501 (ИСО 3696)
Метиловый спирт (метанол) для хроматографии, хч по нормативным документам
Муравьиная кислота для хроматографии, хч, по нормативным документам
Ацетат аммония для хроматографии, хч по нормативным документам
Стандартный раствор азаспирацидов в метаноле (AZA1-b - 1,54 мкМ/л; AZA2-b - 1,43 мкМ/л; AZA3-b - 1,43 мкМ/л) либо аналогичные

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, материалов и реактивов с метрологическими и техническими характеристиками не хуже приведенных выше.

V. Требования при проведении испытаний

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

5.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов*.

Помещение, в котором проводится определение азаспирацидов, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции по подготовке образцов к анализу необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Анализ содержания азаспирацидов в подготовленных образцах проводится в специализированном проветриваемом помещении, оснащенном вытяжкой, при температуре не более 20°С с целью защиты дыхания.

Работа с морепродуктами осуществляется персоналом в рабочей/защитной одежде (халат, защитные очки, перчатки) с целью защиты кожи и глаз. Не допускается утилизация биологических материалов с бытовым мусором, слив жидких биологических образцов в канализацию.

VI. Отбор и подготовка проб

6.1. Отбор морепродуктов для проведения анализа осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 31339.

Отобранные образцы морепродуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки или стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, замораживают и хранят при температуре от -18°С до -20°С, используя для этой цели морозильники или соответствующие приспособления.

После извлечения тела моллюска, устрицы, гребешка из раковины его необходимо обсушить для удаления воды. Образцы измельчаются при температуре от 15°С до 20°С в приборе для грубого измельчения или при помощи ножниц. Подготовка образцов из этого гомогената может быть произведена либо немедленно после измельчения, либо позднее после повторного перемешивания. Гомогенат может храниться не более недели при температуре от -18°С до -20°С в плотно закрытом контейнере.

VII. Подготовка к испытанию

7.1. Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент А: 0,1% (объем) раствор муравьиной кислоты и 0,5 мМ ацетата аммония в воде.

В мерную колбу вместимостью 100 помещают 30-40 дистиллированной воды, вносят 0,1 муравьиной кислоты и 0,004 г ацетата аммония, перемешивают, доводят водой до метки, перемешивают.

Компонент В: ацетонитрил для хроматографии, химически чистый (далее - хч).

7.2. Приготовление матричной градуировки

Для приготовления калибровочных стандартов мясо моллюска, не содержащее азаспирацидов и/или их производных в пределах обнаружения метода, гомогенизируют при помощи скальпеля (блендера). После чего к гомогенату добавляют исходные растворы AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b в метаноле (табл. 1) с перемешиванием 1 мин на устройстве типа вортекс. Полученный гомогенат выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, повторно перемешивают 1 мин, разделяют на 5 равных частей по 0,2 г с последующим замораживанием. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 5 контрольных точек. Калибровочные стандарты размораживают по мере необходимости и проводят их пробоподготовку совместно с исследуемыми пробами.

Таблица 1

Пример приготовления калибровочных стандартов

Исходные растворы азаспирацида, мкл			Образец мяса моллюска, мг	Концентрация азаспирацидов и/или их производных, мкг/кг	Градуировочный стандарт
AZA-1	AZA-2	AZA-3
40	45	45	900	52	1
60	65	65	850	79	2
90	95	100	770	118	3
135	145	150	660	177	4
205	215	225	480	265	5

7.3. Приготовление раствора метилового спирта (метанола) с добавлением 0,1%-й муравьиной кислоты и 0,5 мМ ацетата аммония

Раствор для экстракции: в мерную колбу вместимостью 100 помещают 30-40 метилового спирта, вносят 0,1 муравьиной кислоты и 0,004 г ацетата аммония, перемешивают, доводят до метки метиловым спиртом, вновь перемешивают.

VIII. Проведение испытаний

8.1. Подготовка образца для определения азаспирацидов

Образцы мяса семейства морских двухстворчатых моллюсков (устрицы, мидии) измельчают при помощи скальпеля (блендера), навеску гомогенизированного продукта массой 0,2 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 , вносят 0,8 раствора метилового спирта (п. 7.3) и перемешивают 1 мин на перемешивающем устройстве типа вортекс. Выдерживают 20 мин при комнатной температуре (20°С) для осаждения белков. Пробу центрифугируют в течение 15 минут с относительным центробежным ускорением 12000 g. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 0,5 с помощью пипеточного дозатора помещают в хроматографическую виалу.

8.2. Условия хроматографирования

Для хроматографического анализа используют жидкостной хроматограф с тандемным масс-спектроскопическим детектором типа "орбитальная ловушка" с источником ионизации, оснащенным насосной подачей горячего азота для эффективной десольватации ионов. Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр высокого разрешения;

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- источник ионизации: электроспрей;

- режим работы:

- количественный анализ AZA1-b проводится по иону с соотношением масса/заряд а.е.м; время выхода хроматографического пика 1,61 мин;

- количественный анализ AZA2-b проводится по иону с соотношением масса/заряд а.е.м; время выхода хроматографического пика 1,95 мин;

- количественный анализ AZA3-b проводится по иону с соотношением масса/заряд а.е.м; время выхода хроматографического пика 1,12 мин;

- диапазон сканирования: 800-900 а.е.м;

- разрешение: 60000;

- напряжение на капилляре электроспрея: 5,5 кВ;

- скорость потока основного газа: 50 относительных единиц;

- скорость потока вспомогательного газа: 10 относительных единиц;

- температура капилляра интерфейса: 250°С;

- температура испарителя: 500°С;

- хроматографическая колонка стальная длиной 75 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми гидрофобными группами С18, зернением 3,5 мкм;

- температура колонки: 35°С;

- скорость потока элюента: 0,8 ;

- объем вводимой пробы: 0,003 ;

- режим элюирования (градиентный), пробег 8 мин (табл. 2).

8.3. Режим элюирования

Таблица 2

Режим элюирования

Время, мин	Содержание растворителя в подвижной фазе, % (по объему)
	компонент А: 0,1%-й раствор муравьиной кислоты и 0,5 mМ ацетата аммония в воде	компонент В: ацетонитрил для хроматографии, хч
0	40	60
3	10	90
4	10	90
4,5	40	60

Масс-спектр азаспирацидов AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b в положительном режиме представлен на рис. 2.

8.4. Построение градуировочной кривой

Построение градуировочных кривых проводится по площадям хроматографических пиков стандартных образцов азаспирацидов на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенных по соотношению масса/заряд ионов AZA1-b (842,4608 а.е.м.) с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA2-b (856,4763 а.е.м.) с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA3-b (828,4466 а.е.м.) с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание равное (рис. 3, 4, 5).

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (S., I*сек) от концентрации азаспирацида (AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b) в мясе (мкг/кг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 матричным растворам для градуировки (по п. 7.2).

В инжектор хроматографа вводят 0,003 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 8.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

8.5. Анализ хроматограммы

Количественный анализ содержания в образце азаспирацидов AZA1-b, AZA2-b, AZA3-b проводится по площади пиков на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенных по соотношению масса/заряд иона AZA1-b а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA2-b а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м; AZA3-b а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м. Градуировочные кривые строились по площадям хроматографических пиков, зависимость квадратичная, взвешивание равное (рис. 6, 7, 8).

IX. Требования к показателям точности измерений

9.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 3

Метрологические характеристики метода

Анализируемый объект	Диапазон определяемого содержания, мкг/кг		Характеристика погрешности, , %, Р = 0,95	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (Р = 0,95)	Средняя полнота извлечения вещества, %
	нижний	верхний
Морепродукты (азаспироцид 1)	53	267	16	1,8	2,5	5	7	103,3
Морепродукты (азаспироцид 2)	53	267	21	2,5	3,5	7	10	104,1
Морепродукты (азаспироцид 3)	53	267	55	3,3	4,6	9	13	123,3

X. Условия проведения измерений

10.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия: температура воздуха от 15°С до 20°С, относительная влажность не более 80% (условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование и материалы).

XI. Обработка результатов измерений

11.1. Содержание азаспироцида 1, азаспироцида 2, азаспироцида 3 (в виде индивидуальных веществ) в пробе (X, мкг/кг) определяют согласно градуировочной кривой (п. 8.4). Расчет содержания азаспирацидов в мясе моллюсков производится из расчета прямой зависимости площади пика аналита от его концентрации в образце. При определении соответствия полученных результатов установленным регламентам безопасности морепродуктов проводится расчет суммы концентраций азаспирацидов (азаспироцида 1, азаспироцида 2, азаспироцида 3) в исследуемом образце моллюсков.

XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

, где

, - результаты параллельных определений, мкг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

XIII. Оформление результатов

13.1. Результат анализа по сумме содержания индивидуальных веществ представляют в виде:

, мкг/кг, при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мкг/кг

- граница абсолютной погрешности, мкг/кг;

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3), %.

XIV. Контроль качества результатов измерений

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности.

XV. Требования к квалификации оператора

15.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

______________________________

* ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова