Методические рекомендации МР 3.1.0207-20 "Цитометрический анализ антигенреактивности лейкоцитов in vitro для диагностики и оценки эффективности иммунопрофилактики бруцеллёза у людей" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 19 августа 2020 г.)

Методические рекомендации МР 3.1.0207-20
"Цитометрический анализ антигенреактивности лейкоцитов in vitro для диагностики и оценки эффективности иммунопрофилактики бруцеллёза у людей"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 19 августа 2020 г.)

Введены впервые

I. Область применения

1.1. В настоящих методических рекомендациях (далее - MP) изложены методы исследования антигенреактивности лейкоцитов in vitro с использованием проточной цитофлуориметрии:

- тест активации (дегрануляции) базофилов с бруцеллином;

- антигенспецифические тесты активации лимфоцитов в условиях in vitro.

1.2. MP разработаны с целью совершенствования комплекса лабораторной диагностики и оценки эффективности иммунопрофилактики бруцеллёза у людей.

1.3. MP предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами организаций, осуществляющих деятельность в области лабораторной диагностики и оценки эффективности мероприятий по специфической профилактике инфекций.

II. Общие положения

2.1. Бруцеллёз - одна из наиболее актуальных опасных инфекций в регионах мира с развитым животноводством. Исключительный полиморфизм симптомов, многообразие форм болезни, малая информативность результатов рутинного общеклинического лабораторного обследования нередко приводит к диагностическим ошибкам на догоспитальном этапе.

2.2. Для лабораторной диагностики бруцеллёза у людей применяются три группы методов*(1): первая - тесты, позволяющие выявить возбудителя заболевания и его растворимые антигены; вторая - методы определения специфических антител; третья - тесты, свидетельствующие о сенсибилизации организма.

2.3. Диагностические возможности традиционно используемых методов бактериологической, серологической диагностики и молекулярно-генетических исследований ограничены. Более чем в 70% случаев диагноз "бруцеллёз" бактериологически не подтверждается, при этом доля таких случаев может существенно увеличиваться за счет больных, до начала обследования получавших антибактериальную терапию. Диагностическая информативность (чувствительность, специфичность) серологических методов варьирует в диапазоне от 65 до 95%, при этом в эндемичных регионах она может быть ниже. Необходимо учитывать, что высокие титры антител почти всегда указывают на наличие бруцеллёзной инфекции, при этом антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключают возможности заболевания.

Недостаточная эффективность перечисленных методов диагностики бруцеллёза в последующем может привести к назначению неадекватной этиотропной и патогенетической терапии, что инициирует хронизацию бруцеллёзного процесса с высоким риском формирования необратимых органных поражений и инвалидности у больных.

2.4. Эффективность вакцинации против бруцеллёза во многом зависит от правильного определения показаний к ее проведению, полноты отбора подлежащих иммунизации профессиональных групп, в том числе временного персонала, соблюдения сроков вакцинации и ревакцинации. Оценка уровня специфического иммунитета до и после вакцинации (ревакцинации) проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами*(2).

2.5. Совершенствование комплекса лабораторной диагностики и разработка информативных подходов для оценки эффективности иммунопрофилактики бруцеллёзной инфекции требуют внедрения дополнительных методов, основанных на исследовании клеточных факторов иммунитета, как ведущих в иммуногенезе и патогенезе бруцеллёза. С учетом роли клеточного иммунитета в формировании иммунологической защиты от бруцеллёзной инфекции, изучение клеточной реакции в ответ на антигенную стимуляцию следует считать наиболее информативным (маркерным) и объективным при оценке иммунологической перестройки организма при болезни или вакцинации.

III. Материально-техническое обеспечение

3.1. Оборудование и средства измерения*(3)

Проточный цитофлуориметр*
Перемешивающее устройство
Термостат электрический суховоздушный (37°С с погрешностью измерения не более ) или аналог	ТУ 9452-002-00141798
инкубатор
Холодильник для хранения образцов крови, вакцин и медицинской продукции в условиях стабильных и низких температур	ГОСТ 25336
Дистиллятор лабораторный для получения дистиллированной воды	ГОСТ 6709
Центрифуга лабораторная медицинская настольная с ротором	ГОСТ Р 50444
Вибрационная мешалка
Персональная электронно-вычислительная машина (далее - ПЭВМ)
Дозаторы механические лабораторные с фиксированными и переменными объемами доз, одноканальные (объемы 0,5-10, 20-200, 50-300, 100-1000 мкл)	ГОСТ 28311

______________________________

* Проточный цитофлюориметр должен быть оснащен детекторами прямого и бокового светорассеяния и четырьмя каналами детекции, позволяющими выявлять флуоресцентные конъюгаты fluorescein isothyocyanate (далее - FITC), phycoerythrin (далее - РЕ), peridinin chlorophyll protein complex (далее - PerCP) и allophycocyanm (далее - АРС) (для лазерного излучения с длиной волны 488 нм пики эмиссии соответствуют 519 нм - для FITC, 578 нм - для РЕ, 678 нм - для РеrСР, для лазерного излучения с длиной волны 650 нм пик эмиссии для АРС соответствует 660 нм)

3.2. Расходные материалы*(4)

Изделия для забора крови в наборах и отдельных упаковках	ГОСТ Р 50444, ГОСТ Р ИСО 7864, ГОСТ Р ИСО 10993-4.
Наконечники к дозаторам механическим (до 10 мкл, до 100 мкл, до 200 мкл, до 1000 мкл)
Пластиковые пробирки для проточного цитометра 75х12 мм	ГОСТ ISO 9001
Пластиковые пробирки микроцентрифужные конические 1,5 мл, стерильные
Пробки целлюлозные газопроницаемые
Перчатки диагностические медицинские	ГОСТ 33074

3.3. Материалы и реактивы*(5):

Набор реагентов для оценки активации базофилов с помощью проточной цитофлуориметрии
Конъюгаты моноклональных антител к , , для диагностического применения in vitro
Раствор для лизиса эритроцитов подходящий для иммунофенотипирования и сортировки клеток методом проточной цитометрии
Проточная жидкость для проточной цитометрии
Отмывочная жидкость для проточной цитометрии
Стимулирующий буфер для in vitro активации базофилов
питательная среда с L-глутамином, для выращивания культур клеток человека и животных, жидкая, стерильная, буферная ёмкость среды не менее 4,5 мл, рН 7,1-7,5
Фосфатно-солевой буфер (рН 7,4)
Натрий хлорид (хч)	ГОСТ 4233
Дистиллированная вода ГОСТ 6709;
Аллерген Бруцеллезный жидкий (бруцеллин), 100 мкл аллергена содержит от 3,8 до 5,4 мкг белка
Бруцеллезный антиген для клеточных тестов in vitro.

Метод получения и контроль бруцеллёзного антигена для клеточных тестов in vitro представлен в приложении 1 к настоящим MP.

3.4. Программное обеспечение

Операционная система для ПЭВМ
Программное обеспечение для составления протоколов анализа многопараметровых цитометрических исследований

3.5. Материал для исследований

Исследуется кровь, стабилизированная гепарином или этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА)

IV. Условия взятия, транспортирования и хранения образцов

4.1. Манипуляции по забору, транспортировке, приготовлению образцов выполняются в соответствии ГОСТ Р 53079.4.

Доставка крови для исследования методом проточно-цитометрического анализа должна осуществляться с соблюдением "холодовой цепи" (при температуре 2-8°С) не дольше 24 часов.

Пробирки с кровью должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты. Сопроводительная документация, оформленная на каждую пробу, прикладывается отдельно от исследуемого материала.

Исследование антигенреактивности лейкоцитов in vitro методом проточной цитофлуориметрии не проводится в следующих случаях:

- кровь с признаками гемолиза или была заморожена;

- кровь имеет видимые сгустки;

- от момента взятия крови до поступления на исследования прошло более 24 часов.

4.2. Работы по сбору, транспортированию, исследованию проб клинического материала и их последующей утилизации осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами*(6) и методическими документами*(7).

V. Методы исследования антигенреактивности лейкоцитов in vitro с использованием проточной цитофлуориметрии

5.1. Тест активации (дегрануляции) базофилов с бруцеллином

5.1.1. Патогенез бруцеллёза ассоциирован с формированием специфической гиперчувствительности. В результате взаимодействия организма с аллергенами (антигенами) бруцелл возникает сенсибилизация - повышенная специфическая чувствительность, которая используется в лабораторной диагностике как маркер, указывающий на имевшийся контакт организма с чужеродными субстанциями. Аллергическая перестройка организма у больных бруцеллёзом сохраняется длительное время, что позволяет использовать иммуно-аллергологические тесты и для ретроспективной диагностики.

5.1.2. Принцип метода. При контакте аллергена (бруцеллина) с аллергенспецифическими молекулами IgE на поверхности базофилов происходит каскад ферментных реакций, приводящих к дегрануляции (активации) и высвобождению медиаторов из гранул (гепарин, гистамин). Маркером (индикатором) клеточной перестройки базофилов является CD63 (gp53). Для выявления маркера активации базофилов используется реагент для окраски (Staining Reagent) состоящий из смеси моноклональных антител к поверхностным маркерам CD63 человека, конъюгированных с флуоресцеин изотиоцианитом (анти-CD63-FITC) и к хемокиновому рецептору CCR, меченому фикоэритрином (анти-CCR3-PE). CCR3 конститутивно экспрессируется на базофилах. При проведении реакции используют два независимых позитивных контроля: антитела к высокоафинному рецептору IgE - (fragment crystallizable region epsilon receptor-1) или пептид хемотаксический - N-FormylmethionyI-leucyl-phenylalanine (далее - fMLP) - триплед, вызывающий спонтанную активацию базофилов неиммунологическим путем. Если хотя бы в одном из контролей наблюдается более 10% активированных базофилов, то образец считается подходящим для исследования.

5.1.3. Техника постановки реакции.

5.1.3.1. Подготовить и промаркировать три пробирки для проточного цитометра:

- фоновая проба - внести 50 мкл стимулирующего буфера;

- положительный контроль - внести по 50 мкл положительного контроля или fMLP;

- проба с аллергеном - внести 50 мкл коммерческого бруцеллина (100 мкл аллергена содержит от 3,8 до 5,4 мкг белка)

5.1.3.2. Непосредственно перед исследованием стабилизированную антикоагулянтом кровь перемешать легким покачиванием в течение 2 минут (приблизительно 30 покачиваний в минуту) или с помощью перемешивающего устройства на малых оборотах.

5.1.3.3. Во все три пробирки добавить по 100 мкл стимулирующего буфера.

5.1.3.4. Добавить 50 мкл исследуемой крови.

5.1.3.5. Перемешать с помощью перемешивающего устройства.

5.1.3.6. Во все пробирки добавить по 20 мкл окрашивающего реагента, содержащего конъюгаты моноклональных антител к поверхностным маркерам активации базофилов человека (CD63) и хемокиновому рецептору (CCR).

5.1.3.7. Перемешать пипетированием с помощью дозатора и инкубировать 15 мин на водяной бане при .

5.1.3.8. Для лизиса эритроцитов во все пробирки внести 2,0 мл предварительно прогретого до 18-25°С лизирующего раствора в рабочем разведении 1:10. Инкубировать 5-10 мин при температуре 18-25°С.

5.1.3.9. Центрифугировать в течение 5 мин при 1000 g и удалить супернатант (надосадочная жидкость).

5.1.3.10. Внести в каждую пробирку по 450 мкл отмывочного буфера.

5.1.3.11. Перемешать с помощью перемешивающего устройства в течение 10 с.

5.1.3.12. Анализировать пробу с помощью проточного цитометра (в течение 2-3 ч) с использованием программы для учета результатов цитометрического исследования.

5.1.3.13. Учет результатов. Результатом является разница процентного содержания базофилов, экспрессирующих рецепторы к CD63, в пробе с аллергеном и в фоновой (без аллергена) пробе. Пример учета результатов представлен в приложении 2 к настоящим MP.

5.1.3.14. Оценка результатов:

- значения от 0 до 5% - отрицательная реакция;

- значения более 5% - положительная реакция.

5.1.3.15. Интерпретация результатов. Увеличение количества активированных базофилов свидетельствует о наличии в организме специфической IgE-опосредованной сенсибилизации к антигенам бруцелл, которая возникает при инфекционном процессе или формировании поствакцинального иммунитета.

5.1.4. Возможные ошибки метода.

5.1.4.1. У обследуемых, получающих десенсибилизирующую или кортикостероидную терапию, могут быть получены ложноотрицательные результаты тестирования.

5.1.4.2. Недостоверные результаты могут быть получены при обследовании контингента, иммунизированного против бруцеллёза на ранних сроках после вакцинации (до 14 дней).

5.1.4.3. Полученные результаты могут быть искажены при неправильной калибровке и технической настройке цитометра, некорректной установке напряжения на каналах и цветовой компенсации, неправильного положения региона гейтирования (зоны интересов).

5.2. Тест активации лимфоцитов с бруцеллёзным антигеном

5.2.1. Т-лимфоциты играют ключевую роль в обеспечении приобретенного клеточного иммунитета. Для выполнения специфической функции лимфоциты несут на своей поверхности прямые антигенные рецепторы и являются иммунокомпетентными клетками, осуществляя специфическое распознавание антигена. На современном этапе развития клинической лабораторной диагностики для выявления инфекционных болезней и оценки специфического клеточного иммунитета после иммунизации продемонстрирована высокая эффективность применения методов антигенной активации лимфоцитов in vitro с использованием технологии проточной цитофлуориметрии. Наиболее важным условием при постановке реакции антигенспецифической стимуляции лимфоцитов является наличие антигена, обладающего выраженной, исключительно специфической активностью в условиях in vitro. При разработке методических подходов к количественной оценке интенсивности специфической клеточной реактивности организма ключевым моментом является правильный подбор определяемых маркеров активации лимфоцитов. Перспективным в этом направлении является изучение маркерных поверхностных антигенов, экспрессирующих клетками при формировании иммунного ответа. Диагностически информативными показателями специфической клеточной антигенреактивности могут выступать следующие маркеры (рецепторы) активации лимфоцитов: CD25, CD69, CD71, антиген DR системы HLA, CD95, CD95L, BSL-2 и др.). В ряде исследований показано, что при активации клетки экспрессия перечисленных антигенов, как правило, происходит в следующем порядке: CD69, CD25, CD71, HLA-DR. В связи с этим CD69, CD25 и CD71 рассматривают как ранние активационные маркеры, a HLA-DR - как поздние активационные маркеры.

5.2.2. Принцип метода. Взаимодействие антигена со специфическими рецепторами лимфоцитов вызывает их активацию, то есть их выход из фазы покоя GQ в фазу клеточного цикла G1, которая состоит в развитии каскада реакций: активация фосфолипазы С, расщепляющей фосфатидилинозитолдифосфат на два медиатора - диацилглицерол и инозитолтрифосфат, увеличение концентрации в клетке активирует различные ферментативные системы, что приводит к стимуляции синтеза РНК, белка и IL-2. Эти процессы завершаются экспрессией различных генов и их рецепторов на поверхности клетки. В ходе активационного (дифференцировочного) механизма на поверхности лимфоцитов последовательно экспрессируются молекулы активации (ранней и поздней), пролиферации и апоптоза.

5.2.3. Техника постановки реакции.

5.2.3.1. Подготовить и промаркировать 2 пробирки (1 - опытная, 2 - контрольная).

5.2.3.2. В каждую пробирку внести по 50 мкл исследуемой крови.

5.2.3.3. В опытную пробирку добавить 50 мкл бруцеллёзного антигена, в контрольную 50 мкл стерильного изотонического раствора натрия хлорида.

5.2.3.4. Во все пробирки внести по 100 мкл среды для выращивания культур клеток с L-глутамином и плотно закрыть пробками целлюлозными газопроницаемыми.

5.2.3.5. Перемешать с помощью перемешивающего устройства в течение 5 с.

5.2.3.6. Пробы инкубировать при в условиях повышенного содержания (5-10%) в течение 24 часов.

5.2.3.7. После инкубации, из проб с помощью дозатора удалить надосадочную жидкость, образовавшуюся в результате естественного оседания форменных элементов крови.

5.2.3.8. Перемешать с помощью перемешивающего устройства в течение 5 с.

5.2.3.9. Из опытной и контрольной пробирок отобрать по 50 мкл образца в отдельные, соответствующим образом маркированные пробирки, в которые внести по 5 мкл моноклональных антител к антигенам (или , и др.). На каждый исследуемый маркер активации необходимо брать 50 мкл анализируемой пробы (крови).

5.2.3.10. Инкубировать 15 мин при температуре 18-25°С.

5.2.3.11. После инкубации во все пробирки внести по 450 мкл лизирующего раствора в рабочем разведении 1:10. Инкубировать 5-10 мин при температуре 18-25°С.

5.2.3.12. Пробирки центрифугировать 5 мин при 700 g.

5.2.3.13. Удалить супернатант.

5.2.3.14. Во все пробирки внести по 450 мкл отмывочной жидкости.

5.2.3.15. Перемешать с помощью перемешивающего устройства в течение 5 сек.

5.2.3.16. Пробы центрифугировать 5 мин при 700 g.

5.2.3.17. Удалить супернатант.

5.2.3.18. Добавить 450 мкл отмывочного буфера.

5.2.3.19. Анализировать пробу с помощью проточного цитометра (в течение 2-3 ч) с использованием программы для учета результатов цитометрического исследования. Пример учета результатов представлен в приложении 2 к настоящим MP.

5.2.3.20. Учет результатов. Уровень интенсивности экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов ( и/или , ) рассчитают с использованием коэффициента стимуляции (далее - КС) по формуле:

в %, где

С - относительный уровень содержания в крови активированных Т-лимфоцитов в опытной пробе (после инкубации с бруцеллёзным антигеном);

D - относительный уровень в крови активированных Т-лимфоцитов в контрольной пробе (после инкубации со стерильным изотоническим раствором натрия хлорида).

5.2.3.21. Оценка результатов:

- значения КС от 0 до 50% - отрицательная реакция;

- значения КС более 51% - положительная реакция.

5.2.3.22. Интерпретация результатов. Увеличение количества активированных антигеном Т-лимфоцитов ( и/или , ) свидетельствует о наличии у обследуемого пула премированных лимфоцитов, несущих антигенспецифические рецепторы (рецепторы к антигенам бруцелл), которые образовались при взаимодействии антигенов бруцелл с иммунной системой хозяина в результате инфекционного процесса или формирования поствакцинального иммунитета.

5.2.4. Возможные ошибки метода.

5.2.4.1. У обследуемых со сниженной функциональной активностью лимфоцитов (выраженное иммунодефицитное состояние) и получающих кортикостероидную терапию могут быть получены ложноотрицательные результаты тестирования.

5.2.4.2. Недостоверные результаты могут быть получены при обследовании контингента, иммунизированного против бруцеллёза на ранних сроках после вакцинации (до 14 дней).

5.2.4.3. Полученные результаты могут быть искажены при неправильной калибровке и технической настройке цитометра, некорректной установке напряжения на каналах и цветовой компенсации, неправильного положения региона гейтирования (зоны интересов).

______________________________

*(1) МУК 3.1 7 3402-16 "Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза" (далее - МУК 3.1 7 3402-16)

*(2) Пункт 2.2 2.3 СП 1.3 3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" (далее - СП 1.3 3118-13).

*(3) Примечание: допускается использование оборудования и средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками

*(4) Примечание допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими характеристиками

*(5) Примечание допускается использование материалов и реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками

*(6) СП 1 3 3118-13; СП 2.1 7 2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами", СП 1 2 036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности"

*(7) МУК 3.1 7 3402-16, МУК 4 2 3010-12 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней"

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Указ Президента Российской Федерации от 11.03.2019 N 97 "Об Основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу".

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".

4. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 "Об утверждении Положения о Государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".

5. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.07.1999 N 825 "Об утверждении перечня работ, выполнение которых связано с высоким риском заболевания инфекционными болезнями и требует обязательного проведения профилактических прививок".

6. СП 3.1.7.2613-10 "Профилактика бруцеллеза".

7. СП 3.1/3.2.3146-13 "Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней".

8. СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

9. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

10. СП 3.1.2613-10 "Профилактика бруцеллёза".

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "СП 3.1.2613-10" имеется в виду "СП 3.1.7.2613-10"

11. СП 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами".

12. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".

13. Приказ Минздрава России от 21.03.2014 N 125н "Об утверждении Национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям".

14. МУК 3.1.7.3402-16 "Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллёза".

15. МУК 4.2.3010-12 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллёза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней".

16. Инструкция по применению аллергена бруцеллезного жидкого (бруцеллина), раствор для внутрикожного введения: N 01-11/198-06: утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.11.06. М., 2006.

17. Информационный бюллетень "Бруцеллёз в Российской Федерации в 2019 году" URL: http://www.snipchi.ru/updoc/2020/Bruzellez%20% 202019.pdf

18. Богачева Н.В. Оценка иммунореактивности лиц, вакцинированных чумной, сибиреязвенной, бруцеллезной, туляремийной живыми сухими вакцинами и противоботулиническим трианатоксином, в зависимости от уровня иммунологической нагрузки/Н.В. Богачева, И.В. Дармов, А.С. Кучеренко и др.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2013. N 6 (73). С. 79-84.

19. Брико Н.И. Оценка эффективности вакцинации: основные подходы и спорные вопросы/Н.И. Брико, Ю.В. Лобзин, А.А. Баранов и др.//ПФ. 2014. N 4. С. 8-14.

20. Дармов И.В. Современные лабораторные методы оценки эффективности проведения иммунизации против опасных и особо опасных инфекций/И.В. Дармов, Г.Д. Елагин, Н.В. Богачева и др.//Клиническая лабораторная диагностика. 2011. N 6. С. 39-42.

21. Костюченко М.В. Изучение формирования клеточного поствакцинального иммунитета против бруцеллёза в лимфоцитарных тестах in vitro с использованием экспериментального антигенного комплекса/М.В. Костюченко, Е.Л. Ракитина, Д.Г. Пономаренко и др.//Медицинская иммунология. 2019. Т. 21. N 3. С. 547-554.

22. Кравцов А.Л. Характеристика показателей клеточного иммунитета у вакцинированных против чумы лиц, проживающих на территории Прикаспийского песчаного природного очага чумы/А.Л. Кравцов, В.А. Кожевников, С.Н. Клюева, и др.//Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2019. Т. 18. N 4. С. 67-74.

23. Куличенко А.Н. Использование антигенспецифических клеточных тестов in vitro для оценки формирования поствакцинального противочумного иммунитета/А.Н. Куличенко, Н.В. Абзаева, С.Е. Гостищева и др.//Инфекция и иммунитет. 2017. Т. 7. N 2. С. 203-208.

24. Литвинова Л.С. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов/Л.С. Литвинова, А.А. Гуцол, Н.А. Сохоневич и др.//Медицинская иммунология. 2014. Т. 16. N 1. С. 7-26.

25. Малов В.А. Терапевтические маски бруцеллеза/В.А. Малов//Фарматека. 2011. N 4. С. 22-28.

26. Пономаренко Д.Г. Новый подход к аллергодиагностике бруцеллёза/Д.Г. Пономаренко, О.В. Логвиненко, Н.С. Саркисян и др.//Инфекция и иммунитет. 2013. N 1. С. 89-92.

27. Пономаренко Д.Г. Новый подход к комплексной оценке иммунобиологической реактивности контингента, подлежащего вакцинации (ревакцинации) против бруцеллеза//Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2015. N 3. С. 28-31.

28. Фирстова В.В. Определение экспрессии CD69 на лимфоцитах мышей иммунизированных против чумы в ответ на стимуляцию антигенами чумного микроба/В.В. Фирстова, И.В. Бахтеева, Г.М. Титарева и др.//Медицинская иммунология. 2009. Т. 11. N 4-5. С. 336-337.

29. Хайдуков С.В. Возможности проточной цитофлюориметрии в диагностике инфекционных заболеваний. Часть 1/С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка//Инфекция и иммунитет. 2011. Т. 1. N 1. С. 59-66.

30. Чистякова Н.В. Трудности диагностики бруцеллеза в клинике внутренних болезней/Н.В. Чистякова, М.А. Коновалова, О.А. Бокерия и др.//Клиническая медицина. 2004. N 6. С. 67-68.

31. Щуковская Т.Н. Индуцированная продукция и IL-4 как показатель функциональной активности Тh1- и Тh2-клеток у вакцинированных против чумы людей/Т.Н. Щуковская, Е.А. Смолькова, Т.П. Шмелькова и др.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. Вып. 6. N 61. С. 78-83.

32. Queipo-Ortuno M.I. Comparison between LightCycler Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR) assay with serum and PCR-enzyme-linked immunosorbent assay with whole blood samples for the diagnosis of human brucellosis/M.I. Queipo-Ortuno, J.D. Colmenero, G. Baeza, P. Morata//Clin. Infect. Dis. 2005. Vol. 40. P. 260-264. doi: 10.1086/426818

33. Shipkova M. Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation/M. Shipkova, E. Wieland//Clinica Chimica Acta. 2012. Vol. 413. P. 1338-1349.

34. Solis Garcia Del Pozo J. Detection of IgM antibrucella antibody in the absence of IgGs: a challenge for the clinical interpretation of brucella serology/J. Solis Garcia Del Pozo, S. Lorente Ortuno, E. Navarro, J. Solera//PLoS Negl. Trop. Dis. 2014. Vol. 8 (12). e3390. doi:10.1371/journal.pntd.0003390

35. Starska K. Prognostic value of the immunological phenomena and relationship with clinicopathological characteristics of the tumor-the expression of the early , and the late , , activation markers on T and lymphocytes in squamous cell laryngeal carcinoma. Part II/K. Starska, E. Glowacka, A. Kulig et al.//J. Folia Histochem. Cytobiol. 2011. Vol. 49. N. 4. P. 593-603.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова