Приложение 1. Метод получения и контроль бруцеллёзного антигена для клеточных тестов in vitro (антигенный белково-полисахаридный комплекс из штамма Brucella abortus 19-BA с концентрацией белка 5 мг/мл)

Приложение 1
к MP 3.1.0207-20

Метод получения и контроль бруцеллёзного антигена для клеточных тестов in vitro (антигенный белково-полисахаридный комплекс из штамма Brucella abortus 19-BA с концентрацией белка 5 мг\мл)

1. Описание метода

1.1. Технология производства бруцеллёзного антигена предусматривает получение производственных посевных культур штамма Brucella abortus 19 ВА I, II, III и IV генераций с процессом накопления биомассы; обеззараживания микробной массы охлажденным до минус 40°С ацетоном, ее высушиванием и выделением действующего вещества - бруцеллёзного полисахаридно-белкового комплекса (далее - БПБК) с последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и маркировкой ампул с полученным продуктом.

На стадиях приготовления посевных культур проводят контроль на отсутствие посторонней микрофлоры, определяют концентрацию микробных клеток, проводят контроль специфической стерильности обеззараженной бактериальной массы бруцелл; на этапе приготовления БПБК определяют концентрацию белка, рН, специфическую активность, специфичность.

1.2. Работы с культурой штамма В. abortus 19 ВА проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами*.

2. Методика получения антигена

2.1. Посевную производственную культуру штамма В. abortus 19 ВА высевают на агар Альбими, разлитого в чашки Петри и культивируют ч при температуре , (2 генерация).

2.2. Производят пересев на скошенный агар Альбими, разлитый в пробирки и культивируют ч при температуре (3 генерация).

2.3. Культуру штамма В. abortus 19 ВА со скошенного агара в пробирках смывают стерильным 0,9% изотоническим раствором натрия хлорида и засевают на бактериологические матрацы с агаром Альбими, культивируют ч при температуре (4 генерация).

2.4. Производят визуальный контроль роста культуры. В каждый матрац с культурой В. abortus 19 ВА вносят по 10 мл стерильного 0,9% изотонического раствора натрия хлорида и стерильные стеклошарики. Слегка покачивая бактериологические матрацы, смывают микробную биомассу с пластин агара и пипеткой аккуратно переносят во флаконы.

2.5. Обеззараживание бруцеллёзного микроба проводят двойным объемом ацетона, охлажденного в низкотемпературном столе до минус (помещают в холодильник на ч).

2.6. После обеззараживания проводят контрольные высевы на специфическую стерильность. Для этого отбирают 2-3 мл бакмассы и вносят материал на чашки Петри с Бруцеллагаром равномерно распределяя микробную взвесь покачиванием чашек по всей поверхности. Инкубируют в течение 14 дней при . В дальнейшем, если при проверке чашек с Бруцеллагаром, специфического роста не обнаружено, то материал считается обеззараженным.

2.7. На период проверки специфической стерильности обеззараженная бактериальная масса хранится в растворе ацетона в условиях холодильника при 2-8°С.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

2.7. Обеззараженную и проверенную на специфическую стерильность биомассу бруцеллёзных микробов разливают по чашкам Петри на 18-20 ч для испарения ацетона.

2.8. В полученную сухую биомассу вносят 2,5% раствор натрия хлорида в соотношении 1:1 для экстракции. Инкубируют 24 ч при температуре 18-25°С.

2.9. Центрифугируют 40 мин при 17 200 g.

2.10. Осадок ресуспендируют в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида рН 7,2 в соотношении 1:1.

2.11. Помещают в камеру гидравлического пресс-дезинтегратора Х-25, предварительно охлажденного в течение 3 ч при температуре минус 40°С. Микробную массу в дезинтеграторе замораживают при той же температуре в течение 12 ч.

2.12. Разрушение клеток на гидравлическом прессе проводят четырехкратным продавливанием биомассы через калиброванное отверстие патрона дезинтегратора.

2.13. Биомассу размораживают.

2.14. Центрифугируют 40 мин при 17 200 g.

2.15. В супернатанте получают БПБК.

2.16. Полученный антиген разливают в ампулы, замораживают в низкотемпературном ларе при температуре минус в течение ч.

2.17. Замороженный в ампулах раствор антигена лиофильно высушивают в сушилке лиофильной в течение ч. Конечная температура продукта не должна превышать 25°С.

2.18. После окончания лиофилизации ампулы с препаратом запаивают на газокислородной горелке в среде очищенного воздуха при атмосферном давлении и этикетируют.

2.19. Ампулы с лиофилизированным бруцеллёзным антигеном хранят при температуре от 2 до 8°С в холодильнике.

3. Контроль полученного бруцеллёзного антигена

3.1. Контроль рН раствора антигена проводят потенциометрическим методом**.

Контролируемый показатель: рН раствора .

3.2. Степень разрушения микробных клеток оценивают путем световой микроскопии (х 1000). Окраска бактериальных мазков по Граму.

Контролируемый показатель: при просмотре не менее 10 полей зрения в мазке отсутствуют цельные клетки.

3.3. Определение концентрации белка в исследуемых образцах проводят спектрофотометрическим методом***.

Контролируемый показатель: общая концентрация белка в исследуемых образцах - мг/мл.

3.4. Контроль специфичности с применением иммуноферментного анализа:

Контролируемый показатель: отсутствие перекрестных реакций со штаммами гетерологичных микроорганизмов: Escherichia coli, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Yersinia enterocolitica, Salmonella typhimurium.

3.5. Специфическую активность БПБК контролируют в реакции иммунодиффузии (далее - РИД), используя метод двойной диффузии в 1% агаровом геле по Оухтерлони в чашках Петри с применением гипериммунной сыворотки против возбудителя бруцеллёза с предварительно проверенной активностью в РИД не менее 1:16.

Контролируемый показатель: титр антигена в РИД должен составлять не менее 1:64.

3.6. Специфичность и специфическую активность бруцеллёзного антигена контролируют в клеточных тестах in vitro по методике, указанной в п. 5.2. В качестве показателя активации Т-лимфоцитов исследуют антигениндуцированную экспрессию рецептора CD25 .

В качестве объекта исследования используют белых лабораторных мышей (n = не менее 15), иммунизированных вакциной против бруцеллёза на основе штамма В. abortus 19-ВА в дозе живых микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора (опытная группа). Контрольную группу (n = не менее 15) составляют лабораторные мыши, которым вводят стерильный физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Взятие крови у иммунизированных и контрольных биомоделей осуществляют на 14 сутки после иммунизации.

Контролируемый показатель:

- среднее значение КС лимфоцитов в контрольной группе биомоделей - не более 20%;

- среднее значение КС лимфоцитов в опытной группе биомоделей - 50% и более.

______________________________

* СП 1 3 2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней"

** По Государственной фармакопее Российской Федерации издание XIV, общих фармакопейных статей 1 2.1.0004 15

*** По Государственной фармакопее Российской Федерации издание XIV, общих фармакопейных статей 1 2 3 0012 15