Методические указания МУК 4.1.3552-19 "Определение микроцистина-LR в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования и питьевой воде методом иммуноферментного анализа" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4 октября 2019 г.)

Методические указания МУК 4.1.3552-19
"Определение микроцистина-LR в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования и питьевой воде методом иммуноферментного анализа"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4 октября 2019 г.)

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод определения (путем конкурентного иммуноферментного анализа с фотометрической детекцией) микроцистина-LR.

1.2. Микроцистин-LR, представляет собой циклический пептид, состоящий из 7 аминокислот и включающий L-лейцин и L-аргигин (L и R в названии токсина), , кислоту, 3-амино-9-метокси-2,6,8-триметил-10-фенилдека-4,6-диеноевую кислоту (Adda), D-глютаминовую кислоту, N-метилдегидроаланин. Стабилен в водной среде, устойчив к химическому гидролизу или окислению при нейтральных значениях рН. Не разрушается при кипячении и даже при автоклавировании (до 2 часов и температуре до 300°С), в затененных местах водоемов сохраняется годами. При водоподготовке может окисляться озоном, хлором и другими сильными окислителями, а также разрушаться под действием интенсивного УФИ (ультрафиолетового излучения). Относительно устойчив к действию двуокиси хлора.

Основной путь поступления микроцистина-LR в организм человека - употребление содержащей токсин или цианобактерии питьевой воды. Меньшее значение имеют другие возможные пути поступления - заглатывание небольших количеств воды во время рекреации на "цветущих" водных объектах, вдыхание водных аэрозолей, содержащих цианотоксин, во время приема душа, употребление пищевых продуктов - мяса рыбы, моллюсков, животных, птиц, полученных на основе пищевых цепей, включающих токсикогенные цианобактерии, или зерновых культур, выращенных в условиях орошения водой из "цветущего" водоема. Возможно отравление и при использовании пищевых добавок на основе водорослей, загрязненных цианотоксином.

1.3. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.4. Методические указания носят рекомендательный характер.

II. Метрологические характеристики

2.1. При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующего диапазона концентраций.

Таблица 1

Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мкг/л	Показатель точности (границы относительной погрешности, Р = 0,95) , , %	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, %, (P = 0,95)
Вода водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования	0,1-5,0	47	11,8	16,5	33	46
Питьевая вода	0,1-5,0	48	5,4	7,6	15	21

III. Метод измерений

3.1. Количественное определение микроцистина-LR в воде основано на технологии твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа, в основе которого лежит взаимодействие "антиген-антитело": свободный микроцистин-LR и конъюгат микроцистина-LR конкурируют за центры связывания антител к микроцистину-LR. Несвязавшийся конъюгат удаляется в процессе промывки. После добавления в лунки раствора субстрата/хромогена фермент в составе связавшегося с антителами к микроцистину-LR конъюгата взаимодействует с субстратом, превращая хромоген в вещество голубого цвета. Добавление стопреагента приводит к изменению цвета с голубого на желтый. Оптическую плотность прореагировавшей смеси измеряют фотометрически при 450 нм, по результатам измерения судят о количестве микроцистина-LR в исследуемой пробе (величина оптической плотности раствора обратно пропорциональна концентрации микроцистина-LR в воде). Расчет содержания микроцистина-LR проводят по стандартной кривой или с помощью специального программного обеспечения.

IV. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства

4.1. Средства измерений

Колбы мерные 2-го класса точности 2-100-2, вместимостью 50 и 100 с погрешностью измерения объема 0,12 и 0,2	ГОСТ 1770
Пипетки (с делениями) 2-го класса точности объемом 1, 2, 5 и 10 , погрешность которых равна соответственно +- 0.01; 0,02; 0,05 и 0,1	ГОСТ 29227 ИСО 835-1-81
Дозатор пипеточный одноканальный с переменным объемом 20-200 мкл, дискретность установки 1 мкл, погрешность измерения объема
Дозатор пипеточный одноканальный с переменным объемом 100-1000 мкл, дискретность установки 5 мкл, погрешность измерения объема
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 10, 25, 100, 250 и 500 , погрешность измерения объема ; 0,50; 1,00; 2,00 и 5,00	ГОСТ 1770
рН-метр лабораторный, погрешность измерений рН
Фотометр вертикального типа фотометрирования: анализатор иммуноферментный, диапазон длин волн 340-900 нм, разрешение 0,0001 ОП, погрешность
Таймер

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Вспомогательные устройства и материалы

Пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 1,5-2
Лабораторный встряхиватель вортекс (вихревого типа)
Шкаф (стол) лабораторный с вытяжным устройством
Холодильник, рабочая температура
Бумажные полотенца
Плёнка для заклеивания микропланшетов или парафильм
Микропланшетная мойка
Стеклянная палочка, диаметром 7 мм
Бутыли тёмного стекла с завинчивающимися крышками и вкладышами из политетрафторэтилена, объемом от 15 до 40
Стеклянные виалы с завинчивающимися крышками и вкладышами из политетрафторэтилена, объемом 4 ; 40
Шприц-насадка со стеклянным фильтром 25 мм, разъём Луэра, диаметр пор 1-2 мкм
Программное обеспечение для обработки результатов иммуноферментного анализа (далее - ИФА)

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.3. Реактивы

Сертифицированный стандартный раствор микроцистина-LR (CAS 101043-37-2) в метаноле, концентрации мкг/мл
Набор для количественного определения микроцистина-LR по технологии ИФА на 96 определений Microcystins-ADDA ELISA, включающий следующие компоненты:
- микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов с 8 отделяемыми лунками каждый), покрытых белковым конъюгатом микроцистина, в упаковке из фольги в комплекте с влагопоглотителем;
- комплект стандартных растворов микроцистина в воде (по 1 каждый) с концентрациями: 0 мкг/л (нулевой стандарт), 0,1; 0,40; 1,0; 2,0; 5,0 мкг/л;
- стандартный раствор микроцистина в воде для внутреннего контроля, концентрации мкг/л, 1 мл;
- антитела к микроцистину, 6 мл;
- конъюгат вторичных антител с пероксидазой, 12 мл;
- готовая смесь субстрата с хромогеном, 12 мл;
- стоп-реагент (1 н серная кислота), 12 мл;
- буфер для разбавления проб, готовый к употреблению, 25 мл;
- буфер для промывки, концентрат (х5), 100 мл

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

V. Требования к безопасности и квалификации операторов

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

5.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов*.

VI. Требования к квалификации операторов

6.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области иммуноферментного анализа. К проведению анализа допускается только персонал, ознакомленный с руководством по эксплуатации планшетного иммуноферментного анализатора и освоивший данную методику в процессе обучения.

VII. Условия измерений

7.1. При выполнении измерений соблюдают следующее условие:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха , относительной влажности не более 80%.

VIII. Подготовка к исследованию

8.1. Хранение наборов и реагентов.

Наборы хранят при температуре 2-8°С, не допуская подмораживания компонентов. После отделения необходимого количества стрипов/лунок неиспользуемые стрипы/лунки необходимо поместить обратно в оригинальную упаковку из фольги и плотно укупорить вместе с прилагаемым влагопоглотителем. Продолжать хранение набора в холодильнике при 2-8°С.

8.2. Готовый раствор субстрата, смешанный с хромогеном, светочувствителен, поэтому необходимо избегать попадания на него прямого света. При появлении окрашивания раствора субстрата/хромогена в голубоватый цвет реагент к работе непригоден.

Перед анализом доводят температуру всех реагентов до комнатной (20-25°С) в течение 1,5-2 ч. Если в концентратах буфера образовались кристаллы, нужно растворить их путем встряхивания при комнатной температуре перед его разведением.

8.3. Приготовление растворов.

8.3.1. Для приготовления 0,1 Н раствора соляной кислоты стандарт-титр разбивают с торца стеклянной палочкой в воронке, помещённой в стеклянный стакан на 100 , с помощью промывалки омывают палочку, воронку и разбитый стандарт-титр дистиллированной водой. Содержимое переносят количественно в мерную колбу на 1 000 и разбавляют дистиллированной водой до метки. Срок годности готового раствора - 6 месяцев.

8.3.2. Для приготовления 0,1 Н раствора гидроксида натрия стандарт-титр разбивают с торца стеклянной палочкой в воронке, помещённой в стеклянный стакан на 100 , с помощью промывалки омывают палочку, воронку и разбитый стандарт-титр дистиллированной водой. Содержимое переносят количественно в мерную колбу на 1 000 и разбавляют дистиллированной водой до метки. Срок годности готового раствора - 6 месяцев.

8.3.3. Для приготовления раствора тиосульфата натрия концентрации 0,004 взвешивают на лабораторных весах 4 г . Количественно переносят навеску в мерную колбу на 1000 и разбавляют дистиллированной водой до метки. Хранить в герметичной посуде темного стекла. Срок годности готового раствора - 2 недели.

8.3.4. С целью приготовления буфера для промывки исходный концентрированный раствор буфера разбавляют в 5 раз дистиллированной водой (например, к 100 концентрата прибавляют 400 дистиллированной воды).

Поскольку буфер для промывки хранению не подлежит, его готовят непосредственно перед использованием, рассчитывая необходимое его количество для проведения анализа.

IX. Подготовка проб

Отбор проб воды проводят с учетом требований нормативно-технической документации в стеклянную тару тёмного стекла объёмом от 15 до 40 мл с завинчивающимися крышками и вкладышами из политетрафторэтилена. Рекомендуется одноразовое использование ёмкостей.

При отборе проб проверяют рН воды. При необходимости подстраивают рН исследуемой воды до рН 5-7, добавляя при постоянном перемешивании с помощью стеклянной палочки 0,1 Н раствор соляной кислоты или 0,1 Н раствор гидрооксида натрия и контролируя рН с помощью рН метра.

До начала анализа пробы хранят в холодильнике. Допускается хранение проб до выполнения анализа в течение 5 дней при температуре 2-8°С. Допускается пересылка проб в охлаждённом состоянии при условии их анализа на следующий день.

9.1. Подготовка проб воды, отобранных в зонах водозабора, в зонах рекреации и в зонах промысла аквакультуры (водорослей, рыбы, моллюсков, ракообразных)

9.1.1. Для исследования проб воды на содержание свободного микроцистина-LR от 1 до 2 мл воды профильтровывают в виалу на 4 с использованием шприцевого фильтра с мембраной из стекловолокна.

9.1.2. Для исследования проб воды на содержание микроцистина-LR пробы лизируют.

От 5 до 10 каждой пробы тщательно перемешивают и быстро переносят в виалу на 40 для выполнения трёх циклов заморозки-оттаивания. Если образец был предварительно заморожен, потребуется только два цикла заморозки-оттаивания. Можно использовать виалы и меньшего объёма, но для этого следует уменьшить объём образцов до менее чем 25% от объёма виалы. Следует убедиться, что образцы полностью замораживаются и оттаивают в каждом цикле. Образцы размораживают при температуре приблизительно 35°С в водяной бане и перемешивают после каждого цикла. Лизированные пробы воды в объёме от 1 до 2 воды профильтровывают в виалу на 4 с использованием шприцевого фильтра с мембраной из стекловолокна.

9.2. Подготовка проб питьевой воды

9.2.1. С целью нейтрализации остаточного хлора при исследовании воды на содержание микроцистина-LR к пробам добавляют раствор тиосульфата натрия концентрации 0,004 в отношении 1 к 100 (например, к 20 мл пробы добавляют 200 мкл раствора тиосульфата натрия)

9.3. Подготовка проб бутилированной воды

Для исследования проб бутилированной воды пробоподготовка не требуется.

X. Проведение исследований

10.1. Постановка иммуноферментного анализа

10.1.1. Иммуноферментный анализ микроцистина-LR.

10.1.1.1. В рамку планшета вставляют необходимое количество микролунок, достаточное для всех стандартов, внутреннего контроля и исследуемой воды при анализе в двух повторностях. Записывают положения лунок со стандартами, контролем и исследуемой водой на схеме планшета.

10.1.1.2. С помощью пипеточного дозатора добавляют в выбранные пары лунок по 0,05 каждого стандарта, контроля или исследуемой воды, не забывая менять наконечник пипетки.

10.1.1.3. С помощью пипеточного дозатора в каждую лунку добавляют по 0,05 раствора антител. Планшет заклеивают плёнкой или парафильмом, в течение 30 секунд с осторожностью перемешивают круговыми движениями планшета по поверхности стола и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20-25°С) в течение 90 минут в темном месте.

10.1.1.4. По окончании инкубации удаляют плёнку, жидкость вытряхивают из лунок в раковину мойки и тщательно выбивают остатки жидкости путем троекратного постукивания рамки с лунками по бумажному полотенцу, разложенному на столе. Лунки заполняют буфером для промывки, приготовленным по п. 5.3.5, внося по 0,25 в каждую лунку, используя пипеточный дозатор. Выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды. После последней промывки отбивайте лунки особенно тщательно.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания лунок в процессе выполнения анализа.

10.1.1.5. С помощью пипеточного дозатора в каждую лунку добавляют по 0,10 раствора конъюгата. Планшет заклеивают плёнкой или парафильмом, в течение 30 секунд с осторожностью перемешивают круговыми движениями планшета по поверхности стола и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20-25°С) в течение 30 минут в темном месте

10.1.1.6. По окончании инкубации удаляют плёнку, жидкость вытряхивают из лунок в раковину мойки и тщательно выбивают остатки жидкости путем троекратного постукивания рамки с лунками по бумажному полотенцу, разложенному на столе. Лунки заполняют буфером для промывки, приготовленным по п. 5.3.5, внося по 0,25 в каждую лунку, используя пипеточный дозатор. Выливают буфер для промывки из лунок и тщательно выбивают капельки жидкости. Процедура отмывки повторяется трижды. После последней промывки отбивайте лунки особенно тщательно.

Примечание. Необходимо следовать рекомендованной процедуре промывки и не допускать высыхания лунок в процессе выполнения анализа.

10.1.1.7. После отмывки в каждую лунку с помощью пипеточного дозатора добавляют по 0,10 смеси субстрата с хромогеном. Планшет заклеивают плёнкой или парафильмом, в течение 30 секунд с осторожностью перемешивают круговыми движениями планшета по поверхности стола и оставляют для инкубации при комнатной температуре (20-25°С) в течение 20-30 минут в темном месте.

10.1.1.8. По окончании инкубации в каждую лунку с помощью пипеточного дозатора в той же последовательности, как в предыдущем шаге, в каждую лунку добавляют по 0,05 стоп-реагента. Смесь перемешивают, осторожно вращая планшет.

10.1.1.9. С помощью фотометра измеряют оптическую плотность в каждой лунке на длине волны 450 нм. Время от внесения стоп-реагента до измерения не должно превышать 15 мин.

10.2. Учет и обработка результатов

10.2.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности на микропланшетном иммуноферментном анализаторе (планшетном фотометре, ридере) при длине волны 450 нм против нулевого стандарта, значение которого принимается за 100%.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, ниже 0,8 , это является признаком порчи реагентов. Результаты анализа в таком случае не учитываются.

Измеренные показатели оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами образцов.

10.2.2. Вычисляют средние значения оптической плотности стандартных и исследуемых растворов, полученные по 2 параллельным микролункам в результате двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

Вычисленные средние значения оптической плотности стандартных (или исследуемых) растворов делят на вычисленное среднее значение оптической плотности нулевого стандарта и умножают на 100% по формуле:

, где (1)

% ОП - значение оптической плотности, выраженное в процентах от оптической плотности нулевого стандарта, % поглощения;

- среднее значение оптической плотности стандартных растворов (или исследуемых растворов продуктов);

- среднее значение оптической плотности нулевого стандарта.

10.2.3. По величинам значений относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим им значениям концентрации микроцистина-LR строят калибровочную кривую в полулогарифмической системе координат (рис. 1).

10.2.4. Концентрацию микроцистина-LR считывают по соответствующим калибровочным кривым по значениям оптической плотности, вычисленным по формуле (1).

10.2.5. Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение.

При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения и рекомендациями разработчика.

10.2.6. В случае обнаружения высоких концентраций микроцистина-LR в исследуемых пробах воды, находящихся за пределами рабочего диапазона методики, необходимо дополнительно разбавить пробы соответствующим разбавляющим буфером (см. п. 3.3).

При этом результат, полученный по калибровочной кривой, необходимо умножить на фактор разбавления.

10.2.7. Если результаты анализа стандартного раствора для внутреннего контроля находятся за пределами диапазона, указанного в разделе II, то анализ проводят повторно.

10.2.8. В случае получения результатов выше границы надёжного определения следует разбавить пробу соответствующим буфером и повторить анализ. При расчёте результата учесть фактор разведения.

XI. Метрологические характеристики

11.1. Метрологические характеристики метода определения микроцистина-LR в воде, проводимого в полном соответствии с приведенной процедурой твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа, представлены в табл. 2.

Таблица 2

Метрологические характеристики метода определения микроцистина-LR в воде, проводимого в полном соответствии с приведенной процедурой твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа

Статистический параметр	Цианотоксина микроцистина-LR
Предел обнаружения,	0,1 (M-LR)
Интервал надежного определения,	0,1-5,0
Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, полученными в одной лаборатории в одной серии измерений (сходимость), при Р = 0,95 не должно превышать, %	15,0
Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в двух разных лабораториях (воспроизводимость), при Р = 0,95 не должно превышать по отношению к среднему, %	35,0

11.2. Если результаты анализа стандартного раствора для внутреннего контроля находятся за пределами диапазона, указанного в разделе II, то анализ проводят повторно.

11.3. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования, указанные в таблице, то два параллельных определения проводят повторно.

11.4. В случае получения результатов ниже предела обнаружения следует указывать результат со знаком "<": например, "содержание микроцистина-LR в воде <0,1 ".

11.5. В случае получения результатов выше предела обнаружения, но ниже границы надёжного определения следует указывать результат в текстовой форме, например, "обнаружены следы микроцистина-LR в воде".

11.6. В случае получения результатов выше границы надёжного определения следует разбавить пробу соответствующим буфером и повторить анализ. При расчёте результата учесть фактор разведения.

______________________________

* ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова