Методические указания МУК 4.1.3553-19 "Определение окадаиковой кислоты и ее производных (диарейных фикотоксинов) в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС)" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4 октября 2019 г.)

Методические указания МУК 4.1.3553-19
"Определение окадаиковой кислоты и ее производных (диарейных фикотоксинов) в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС)"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4 октября 2019 г.)

Введены впервые

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают методику определения окадаиковой кислоты и ее производных - диарейных фикотоксинов (DSP фикотоксинов) в морепродуктах на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 804.

Окадаиковая кислота и ее производные (DTX1, DTX2 и DTX3) относятся к числу токсинов морепродуктов, вызывающих диарею. Их первичными продуцентами являются бурые водоросли динофлагеллаты, относящиеся к родам Dinophysis spp. и Prorocentrum spp. Моллюски, креветки, крабы и некоторые виды рыб, питаясь этими водорослями, накапливают окадаиковую кислоту в жировой ткани, становясь, таким образом, ядовитыми для людей, употребляющих эти гидробионты в пищу. Основными симптомами при отравлении DSP-фикотоксинами являются диарея, тошнота, рвота, боли в животе.

Безопасный уровень острого воздействия окадаиковой кислоты - 0,33 мкг/кг массы тела. Среднелетальная доза (ЛД50) окадаиковой кислоты при внутрибрюшинном введении, в соответствии с различными данными, составляет от 192 мкг/кг до 225 мкг/кг массы тела. Количество окадаиковой кислоты, вызывающее минимальный неблагоприятный эффект при пероральном введении, составляет 75 мкг/кг массы тела.

В связи с тем, что окадаиковая кислота и ее производные оказывают токсическое воздействие на все органы и системы человека и при попадании в организм небольшого количества токсина отмечаются только неспецифические гастроинтестинальные симптомы, возможна гипо- или гипердиагностика данного пищевого отравления. Это обстоятельство делает необходимым разработку доступных прецизионных методов определения окадаиковой кислоты, что позволит проводить надзор за содержанием этого токсина в морепродуктах и оценить риск его влияния на здоровье населения.

Количественный метод определения окадаиковой кислоты и ее производных при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС) отличается хорошей воспроизводимостью, селективностью, высокой чувствительностью и надежностью, а также отсутствием необходимости использования дериватизации образцов. Нижний предел количественного определения окадаиковой кислоты и ее производных (в пересчете на окадаиковую кислоту) при использовании предлагаемого способа составляет от 5 до 20 в зависимости от используемого иона при ошибке измерения не более 15%.

Максимально допустимый уровень содержания диарейного яда моллюсков (окадаиковой кислоты и ее производных) в моллюсках (МДУ) - 160 .

III. Принцип метода

3.1. Метод основан на экстракции окадаиковой кислоты и/или ее производных из гомогенизированных тканей морепродуктов 80% водным раствором метанола. Количество токсина определяется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

IV. Средства измерений, вспомогательные устройства материалы и реактивы

4.1. Средства измерений, вспомогательные устройства и материалы

Жидкостной хроматограф с тандемным масс-спектроскопическим детектором типа "орбитальная ловушка", снабженный автоматическим пробоотборником, термостатом колонки и двухканальным (бинарным) градиентным насосом с рабочим давлением до 200 атм.
Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми гидрофобными группами С18, зернением 5 мкм
Весы лабораторные аналитические назначения с пределом взвешивания до 200 г и пределом допустимой погрешности г
Одноканальные автоматические пипетки переменного объема вместимостью 0,0005-0,01 и пределом допустимой погрешности 0,00001 ; 0,01-0,1 и пределом допустимой погрешности 0,0001 ; 0,1-1 и пределом допустимой погрешности 0,001
Наконечники для одноканальных пипеточных дозаторов 0,1-20 мкл; 2-200 мкл; 50-1000 мкл
Пробирки полипропиленовые центрифужные с винтовой крышкой вместимостью 2 и 10
Прибор для грубого измельчения тканей (блендер)
Скальпель
Хроматографические виалы темные с винтовой крышкой объемом 1,5
Перемешивающее устройство типа "вортекс" с диапазоном вращающего момента 1000-3000 об./мин
Центрифуга лабораторная, роторная, термостатируемая, с максимальной скоростью до 14 000 об./мин и относительным центробежным ускорением до 20000 g
Колбы мерные на 100	ГОСТ 1770
цилиндры мерные на 100	ГОСТ 1770

4.2. Реактивы

Азот газообразный, осч (I и II сорт)	ГОСТ 9293
Гелий газообразный вч, в баллонах по нормативным документам
Ацетонитрил для хроматографии, хч по нормативным документам
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная)	ГОСТ Р 52501 (ИСО 3696)
Метиловый спирт (метанол) для хроматографии, хч по нормативным документам
Муравьиная кислота для хроматографии, хч по нормативным документам
Стандартный образец окадаиковой кислоты (далее - ОА) (массой 100 мкг с содержанием основного компонента не менее 98%), либо аналогичный.

V. Требования при проведении испытаний

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

5.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов*.

Помещение, в котором проводится определение окадаиковой кислоты и ее производных, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции по подготовке образцов к анализу необходимо проводить в вытяжном шкафу.

5.3. Анализ содержания окадаиковой кислоты и ее производных в подготовленных образцах проводится в специализированном проветриваемом помещении, оснащенном вытяжкой, при температуре не более 20°С с целью защиты дыхания.

5.4. Работа с морепродуктами осуществляется персоналом в рабочей/защитной одежде (халат, защитные очки, перчатки) с целью защиты кожи и глаз. Не допускается утилизация биологических материалов с бытовым мусором, слив жидких биологических образцов в канализацию.

VI. Отбор и подготовка проб

6.1. Отбор морепродуктов для проведения анализа осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 31339.

Отобранные образцы морепродуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки или стеклянные банки с притертыми крышками.

Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, замораживают и хранят при температуре от -18°С до -20°С, используя для этой цели морозильники или соответствующие приспособления.

После извлечения тела моллюска, устрицы, гребешка из раковины его необходимо обсушить для удаления воды. Образцы измельчаются при температуре от 15°С до 20°С в приборе для грубого измельчения или при помощи ножниц. Подготовка образцов из этого гомогената может быть произведена либо немедленно после измельчения, либо позднее после повторного перемешивания. Гомогенат может храниться не более недели при температуре от -18°С до -20°С в плотно закрытом контейнере.

VII. Подготовка к испытанию

7.1. Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент А: 0,1% (объем) раствор муравьиной кислоты в воде. В мерную колбу вместимостью 100 помещают 30-40 дистиллированной воды, вносят 0,1 муравьиной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

Компонент В: Ацетонитрил для хроматографии, хч.

7.2. Приготовление матричной градуировки

Для приготовления калибровочных стандартов мясо моллюска, не содержащего окадаиковую кислоту и/или ее производных в пределах обнаружения метода, гомогенизируют при помощи блендера. После чего к гомогенизату мяса моллюсков прибавляют исходные растворы ОА или ее производных в метаноле (из расчета 50 мкл на каждые 960 мг образца) с последующим перемешиванием в течение 1 мин на устройстве типа "вортекс". Полученный гомогенизат выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, повторно перемешивают 1 мин, разделяют на 5 равных частей по 0,2 г с последующим замораживанием. Исходный раствор окадаиковой кислоты и/или ее производных в метаноле с концентрацией 100 мкг/мл готовят добавлением 1 мл метанола к стандартному образцу ОА и/или ее производных. Исходные растворы ОА и/или ее производных в метаноле с концентрацией от 64 до 0,5 мкг/мл готовят последовательным разбавлением (табл. 1) и соответствуют содержанию ОА и/или ее производных в калибровочных стандартах от 640 до 5 мкг/кг. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 5 контрольных точек. Калибровочные стандарты размораживают по мере необходимости и проводят их пробоподготовку совместно с исследуемыми пробами.

Таблица 1

Пример приготовления исходных растворов ОА последовательным разбавлением

Исходные растворы ОА и/или ее производных в метаноле, мкл	Объем растворителя (метанол), мкл	Концентрация ОА и/или ее производных в мясе, мкг/кг	Градуировочный стандарт
100	100	5	1
25	175	10	2
100	100	80	3
50	150	160	4
128	72	640	5

7.3. Приготовление раствора метилового спирта (метанола) в воде с объемной долей 80% (80%-й раствор)

Раствор для экстракции: в мерную колбу вместимостью 100 помещают 30-40 метилового спирта, вносят 20 дистиллированной воды, перемешивают, доводят до метки метиловым спиртом, вновь перемешивают.

VIII. Проведение испытаний

8.1. Подготовка образца для определения окадаиковой кислоты

Образцы мяса семейства морских двухстворчатых моллюсков (устрицы, мидии) измельчают при помощи скальпеля (блендера), затем навеску гомогенизированного продукта массой 0,2 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 , вносят 0,8 раствора метилового спирта (п. 7.3) и перемешивают 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс". Выдерживают 20 мин при комнатной температуре 20°С для осаждения белков. Затем пробу центрифугируют в течение 15 минут с относительным центробежным ускорением 12 000 g. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 0,5 с помощью пипеточного дозатора помещают в хроматографическую виалу.

8.2. Условия хроматографирования

Для осуществления хроматографического анализа используют жидкостной хроматограф с тандемным масс-спектроскопическим детектором типа "орбитальная ловушка" с источником ионизации, оснащенным насосной подачей горячего азота для эффективной десольватации ионов. Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр высокого разрешения;

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- источник ионизации: электроспрей;

- режим работы: количественный анализ проводился по иону с соотношением масса/заряд а.е.м; проверочные ионы: с соотношением масса/заряд а.е.м; с соотношением масса/заряд а.е.м. Время выхода хроматографического пика 6,86 мин;

- диапазон сканирования: 700-900 а.е.м;

- разрешение: 240 000;

- напряжение на капилляре электроспрея: 5,5 кВ;

- скорость потока основного газа: 50 относительных единиц;

- скорость потока вспомогательного газа: 10 относительных единиц;

- температура капилляра интерфейса: 250°С;

- температура испарителя: 500°С;

- хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми гидрофобными группами С18, зернением 5 мкм;

- температура колонки: 40°С;

- скорость потока элюента: 0,8 ;

- объем вводимой пробы: 0,02 ;

- режим элюирования (градиентный), пробег 16 мин (табл. 2).

8.3. Режим элюирования

Таблица 2

Режим элюирования

Время, мин	Содержание растворителя в подвижной фазе, % (по объему)
	компонент А: раствор 0,1% муравьиной кислоты в воде	компонент В: Ацетонитрил для хроматографии, хч
0	35	65
5	0	100
8	0	100
9	35	65

Масс-спектр окадаиковой кислоты ОА в положительном режиме представлен на рис. 2.

8.4. Построение градуировочной кривой

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца окадаиковой кислоты и/или ее производных на хроматограмме (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд ионов или или (787,4624 или 769,4521 или 751,4414 а.е.м. соответственно) с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х (рис. 3, 4, 5).

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (S., 1*сек.) от концентрации окадаиковой кислоты (ОА) и/или ее производных в мясе (мкг/кг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 матричным растворам для градуировки по п. 7.2.

В инжектор хроматографа вводят 0,003 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 8.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

8.5. Анализ хроматограммы

Количественный анализ содержания в образце окадаиковой кислоты и/или ее производных проводится по площади пика на хроматограмме ЕIC (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд иона а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м. Градуировочная кривая строилась по площадям хроматографических пиков, зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х (рис. 6).

IX. Требования к показателям точности измерений

9.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 3

Метрологические характеристики метода

Анализируемый объект	Диапазон определяемого содержания окадаиковой кислоты и/или ее производных, мкг/кг		Характеристика погрешности, %, P = 0,95	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (P = 0,95)	Средняя полнота извлечения вещества, %
	нижний	верхний
Морепродукты	5	640	40	12,1	8,9	18	25	95,9

X. Условия проведения измерений

10.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия: температура воздуха от 15°С до 20°С, относительная влажность не более 80% (условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование и материалы).

XI. Обработка результатов измерений

11.1. Содержание окадаиковой кислоты (в виде индивидуального вещества) в пробе (X, мкг/кг) определяют согласно градуировочной кривой (п. 8.4). Расчет содержания окадаиковой кислоты и/или ее производных в мясе моллюсков производится из расчета прямой зависимости площади пика от их концентрации в образце. При определении соответствия полученных результатов установленным регламентам безопасности морепродуктов проводится расчет суммы концентраций окадаиковой кислоты и/или ее производных в исследуемом образце моллюсков.

XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

, где

, - результаты параллельных определений, мкг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

XIII. Оформление результатов

13.1. Результат анализа по сумме содержания индивидуальных веществ (окадаиковой кислоты и ее производных) представляют в виде:

, мкг/кг при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мкг/кг

- граница абсолютной погрешности, мкг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3), %.

XIV. Контроль качества результатов измерений

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности.

XV. Требования к квалификации оператора

15.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

______________________________

* ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова