Методические указания МУК 4.1.3554-19 "Определение йессотоксина и его производных в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС)" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4 октября 2019 г.)

Методические указания МУК 4.1.3554-19
"Определение йессотоксина и его производных в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС)"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 4 октября 2019 г.)

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают методику определения фикотоксина йессотоксина и его производных в морепродуктах на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Общие положения

2.1. Йессотоксин является липотропным фикотоксином.

Эмпирическая формула йессотоксина: .

Молекулярная масса: 1 140.

Известно более 90 производных йессотоксина. Йессотоксин, в отличие от окадаиковой кислоты, не вызывает послабления кишечника. Химическая структура йессотоксина аналогична химической структуре бреветоксинов и сигаутоксинов, которые оказывают действие на работу кальций-натриевого насоса и трансмембранных ионных каналов. Следовательно, йессотоксин способен оказывать влияние на работу всех органов и систем организма.

Йессотоксин влияет на процессы клеточной адгезии через Е-кадгерин и, таким образом, может явиться фактором развития болезни Альцгеймера. Йессотоксин может вызывать развитие апоптоза, параптоза и аутофагии.

Острая токсичность йессотоксина составляет, по различным данным, от 100 мкг/кг массы тела до 500-750 мкг/кг массы тела. Безопасный уровень при остром воздействии йессотоксина - 25 мкг/кг массы тела в сутки. В связи с тем, что йессотоксин и его производные при попадании в организм в небольшом количестве вызывают только неспецифические гастроинтестинальные симптомы, возможна гипо- или гипердиагностика данного пищевого отравления. Это обстоятельство делает необходимым разработку доступных прецизионных методов их определения, что позволит проводить надзор за содержанием этого токсина в морепродуктах.

Количественный метод определения йессотоксина и его производных при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС) отличается хорошей воспроизводимостью, селективностью, высокой чувствительностью и надежностью, а также отсутствием необходимости использования дериватизации образцов. Нижний предел количественного определения йессотоксина и его производных при использовании предлагаемого способа составляет 0,50 мг/кг при ошибке измерения не более 15%.

Максимально допустимый уровень содержания йессотоксина в моллюсках не более 3,75 мг/кг.

Химическая структура йессотоксина и его производных представлена в приложении к настоящим МУК.

III. Принцип метода

3.1. Метод основан на экстракции йессотоксина и его производных из гомогенизированных тканей морепродуктов раствором метанола с добавлением 0,1% муравьиной кислоты. Количество токсина(ов) определяется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ВЭЖХ-МС).

IV. Средства измерений, вспомогательные устройства материалы и реактивы

4.1. Средства измерений, вспомогательные устройства и материалы

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектроскопическим детектором типа "орбитальная ловушка", снабженный автоматическим пробоотборником, термостатом колонки и двухканальным (бинарным) градиентным насосом с рабочим давлением до 200 атм
Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми гидрофобными группами С18, зернением 5 мкм
Весы лабораторные аналитические с пределом взвешивания до 200 г и пределом допустимой погрешности г
Одноканальные автоматические пипетки переменного объема вместимостью 0,0005-0,01 и пределом допустимой погрешности 0,00001 ; 0,01-0,1 и пределом допустимой погрешности 0,0001 ; 0,1-1 и пределом допустимой погрешности 0,001
Наконечники для одноканальных пипеточных дозаторов 0,1-20 мкл; 2-200 мкл; 50-1000 мкл
Пробирки полипропиленовые центрифужные с винтовой крышкой вместимостью 2 и 10
Прибор для грубого измельчения тканей (блендер)
Скальпель
Хроматографические виалы темные с винтовой крышкой объемом 1,5
Перемешивающее устройство типа "вортекс" с диапазоном вращающего момента 1000-3000 об./мин
Центрифуга лабораторная роторная термостатируемая с максимальной скоростью до 14 000 об./мин и относительным центробежным ускорением до 20 00 g
Колбы мерные на 100	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные на 100	ГОСТ 1770

4.2. Реактивы

Азот газообразный о.с.ч. (I и II сорт)	ГОСТ 9293
Гелий газообразный в.ч., в баллонах по нормативным документам
1-Пропанол для хроматографии, х.ч., по нормативным документам
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная)	ГОСТ Р 52501 (ИСО 3696:1987)
Метиловый спирт (метанол) для хроматографии, х.ч. по нормативным документам
Муравьиная кислота для хроматографии, х.ч. по нормативным документам
Стандартный раствор йессотоксина в метаноле (YTX-c - 4,3 мкМ/л), либо аналогичный

Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, материалов и реактивов с метрологическими и техническими характеристиками не хуже приведенных выше.

V. Требования при проведении испытаний

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

5.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов*.

Организация обучения работников безопасности труда осуществляется по ГОСТ 12.0.004.

Помещение, в котором проводится определение йессотоксинов, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции по подготовке образцов к анализу необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Анализ содержания йессотоксинов в подготовленных образцах проводится в специализированном проветриваемом помещении, оснащенном вытяжкой, при температуре не более 20°С с целью защиты дыхания.

Работы с морепродуктами выполняются персоналом в рабочей/защитной одежде (халат, защитные очки, перчатки) с целью защиты кожи и глаз. Не допускается утилизация биологических материалов с бытовым мусором, слив жидких биологических образцов в канализацию.

VI. Отбор и подготовка проб

6.1. Отбор морепродуктов для проведения анализа осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 31339.

Отобранные образцы морепродуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки или стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, замораживают и хранят при температуре от -18°С до -20°С, используя для этой цели морозильники или соответствующие приспособления.

После извлечения тела моллюска, устрицы, гребешка из раковины его необходимо обсушить для удаления воды. Образцы измельчаются при температуре от 15°С до 20°С в приборе для грубого измельчения или при помощи ножниц. Подготовка образцов из этого гомогената может быть произведена либо немедленно после измельчения, либо позднее после повторного перемешивания. Гомогенат может храниться не более недели при температуре от -18°С до -20°С в плотно закрытом контейнере.

VII. Подготовка к испытанию

7.1. Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент А: 0,1% (объем) раствор муравьиной кислоты в воде.

В мерную колбу вместимостью 100 помещают 30-40 дистиллированной воды, вносят 0,1 муравьиной кислоты, перемешивают, доводят водой до метки, вновь перемешивают.

Компонент В: 1-пропанол для хроматографии, х.ч.

7.2. Приготовление матричной градуировки

Для приготовления калибровочных стандартов мясо моллюска, не содержащего йессотоксин и/или его производные в пределах обнаружения метода, гомогенизируют при помощи блендера. После чего к нему добавляют исходные растворы YTX и/или его производных в метаноле (табл. 1) с перемешиванием 1 мин на устройстве типа "вортекс". Полученный гомогенизат выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, затем повторно перемешивают 1 мин, разделяют на 5 равных частей по 0,2 г с последующим замораживанием. Для построения градуировочной кривой необходимо не менее 5 контрольных точек. Калибровочные стандарты размораживают по мере необходимости и проводят их пробоподготовку совместно с исследуемыми пробами.

Таблица 1

Пример приготовления калибровочных стандартов

Исходные растворы йессотоксина и/или его производных, мкл	Образец мяса моллюска, мг	Концентрация йессотоксина и/или его производных, мг/кг	Градуировочный стандарт
50	960	0,05	1
75	940	0,08	2
275	780	0,27	3
400	680	0,4	4
600	520	0,6	5

7.3. Приготовление раствора метилового спирта (метанола) с добавлением 0,1% муравьиной кислоты

Раствор для экстракции: в мерную колбу вместимостью 100 помещают 30-40 метилового спирта, вносят 0,1 муравьиной кислоты, перемешивают, доводят до метки метиловым спиртом, вновь перемешивают.

7.4. Приготовление раствора метилового спирта (метанола) в воде с объемной долей 82% (82%-й раствор) с добавлением 0,1% муравьиной кислоты

Раствор для разбавления: в мерную колбу вместимостью 100 помещают 30-40 метилового спирта, вносят 18 дистиллированной воды, вносят 0,1 муравьиной кислоты, перемешивают, доводят до метки метиловым спиртом, вновь перемешивают.

VIII. Проведение испытаний

8.1. Подготовка образца для определения йессотоксина

Образцы мяса семейства морских двухстворчатых моллюсков (устрицы, мидии) измельчают и помещают в ручной плунжерный гомогенизатор, затем навеску гомогенизированного продукта массой 0,2 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 2 , вносят 0,8 раствора метилового спирта (п. 7.3) и перемешивают 1 мин на перемешивающем устройстве типа "вортекс". Выдерживают 20 мин при комнатной температуре 20°С для осаждения белков. Пробу центрифугируют в течение 15 минут с относительным центробежным ускорением 12 000 g. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 0,15 с помощью пипеточного дозатора помещают в эпиндорф емкостью 2 и вносят 1,35 раствора метилового спирта (п. 7.4). Затем пробу центрифугируют в течение 15 минут с относительным центробежным ускорением 12 000 g. Аликвоту экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) объемом 0,5 с помощью пипеточного дозатора помещают в хроматографическую виалу.

8.2. Условия хроматографирования

Для осуществления хроматографического анализа используют жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектроскопическим детектором типа "орбитальная ловушка" с источником ионизации, оснащенным насосной подачей горячего азота для эффективной десольватации ионов. Для осуществления масс-спектрометрической детекции используют подключенный к выходу из хроматографической колонки масс-спектрометр высокого разрешения.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

- источник ионизации: электроспрей (ESI);

- режим работы: количественный анализ проводился по иону с соотношением масса/заряд а.е.м.; проверочный ион с соотношением масса/заряд а.е.м. Время выхода хроматографического пика 6,88 мин;

- диапазон сканирования: 450-1400 а.е.м.;

- разрешение: 60000;

- напряжение на капилляре электроспрея: 2,5 кВ;

- скорость потока основного газа: 50 относительных единиц;

- скорость потока вспомогательного газа: 10 относительных единиц;

- температура капилляра интерфейса: 275°С;

- температура испарителя: 300°С;

- хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми гидрофобными группами С18, зернением 5 мкм;

- температура колонки: 40°С;

- скорость потока элюента: 0,6 ;

- объем вводимой пробы: 0,003 ;

- режим элюирования (градиентный), пробег 20 мин (табл. 2).

8.3. Режим элюирования

Таблица 2

Режим элюирования

Время, мин	Содержание растворителя в подвижной фазе, % (по объему)
	Компонент А: раствор 0,1% муравьиной кислоты в воде	Компонент В: 1-пропанол для хроматографии, х.ч.
0	90	10
8	0	100
12	0	100
13	90	10

Масс-спектр йессотоксина YTX-c в отрицательном режиме представлен на рис. 1.

8.4. Построение градуировочной кривой

Построение градуировочной кривой проводится по площади хроматографических пиков стандартного образца йессотоксина и/или его производных на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд ионов или (1141,4465 или 1163,4279 а.е.м. соответственно) с шириной окна 0,050 а.е.м. Зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х (рис. 2, 3).

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (S., I*сек.) от концентрации йессотоксина YTX-c в мясе (мг/кг), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 матричным растворам для градуировки по п. 7.2.

В инжектор хроматографа вводят 0,003 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 8.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

8.5. Анализ хроматограммы

Количественный анализ содержания в образце йессотоксина и его производных проводится по площади пика на хроматограмме EIC (хроматограмма выбранного иона), построенной по соотношению масса/заряд иона а.е.м. с шириной окна 0,050 а.е.м. Градуировочная кривая строилась по площадям хроматографических пиков, зависимость квадратичная, взвешивание 1/Х (рис. 4).

IX. Требования к показателям точности измерений

9.1. При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 3

Метрологические характеристики метода

Анализируемый объект	Диапазон определяемого содержания йессотоксина, мг/кг		Характеристика погрешности, , %, Р = 0,95	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), , %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), , %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (Р = 0,95)	Средняя полнота извлечения вещества, %
	нижний	верхний
Морепродукты (йессотоксин)	0,50	6	58	9,1	12,7	25	36	115,2

X. Условия проведения измерений

10.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия: температура воздуха от 15°С до 20°С, относительная влажность не более 80% (условия измерений должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование и материалы).

XI. Обработка результатов измерений

11.1. Содержание йессотоксина (в виде индивидуального вещества) в пробе (X, мг/кг) определяют согласно градуировочной кривой (п. 8.4). Расчет содержания йессотоксина и его производных в мясе моллюсков производится из расчета прямой зависимости площади пика аналита. При определении соответствия полученных результатов установленным регламентам безопасности морепродуктов проводится расчет суммы концентраций йессотоксина и его производных в исследуемом образце моллюсков.

XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

, где

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 3), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

XIII. Оформление результатов

13.1. Результат анализа по сумме содержания индивидуальных веществ (йессотоксина и его производных) представляют в виде:

, мкг/кг при вероятности Р = 0,95, где

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3), %.

XIV. Контроль качества результатов измерений

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности.

XV. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

______________________________

* ГН 2.2.5.3532-18 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны"; ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

А.Ю. Попова