Межгосударственный стандарт ГОСТ 32031-2022 "Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.)" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 октября 2022 г. N 1133-ст) (с изменениями и дополнениями)

Межгосударственный стандарт ГОСТ 32031-2022
"Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.)"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 октября 2022 г. N 1133-ст)

Food products. Methods for detection of Listeria monocytogenes and other Listeria (Listeria spp.)

УДК 663/664:543.9:006.354
МКС 07.100.30

Дата введения - 1 января 2023 г.
Взамен ГОСТ 32031-2012

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Разработан Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН (ФГБНУ "ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова" РАН)

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 31 августа 2022 г. N 153-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 октября 2022 г. N 1133-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32031-2022 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2023 г.

5 Взамен ГОСТ 32031-2012

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, объекты производственной среды (смывы с технологического оборудования, тары, инвентаря, стен, полов, одежды и рук работников) и устанавливает методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 7702.2.0 Продукты убоя птицы, полуфабрикаты из мяса птицы и объекты окружающей производственной среды. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 26669 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425 Консервы. Метод определения промышленной стерильности

ГОСТ ISO 707 ^* Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб

------------------------------

^*_{В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 707-2010 "Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб".}

------------------------------

ГОСТ ISO 6887-1 ^** Микробиология пищевой цепи. Подготовка образцов для испытаний, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологического исследования. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятикратных разведений

------------------------------

^**_{В Российской Федерации не действует.}

------------------------------

ГОСТ ISO 6887-2 ^*** Микробиология пищевой цепи. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологического исследования. Часть 2. Специальные правила подготовки мяса и мясной продукции

------------------------------

^***_{В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 6887-2-2013 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка проб, исходной суспензии и десятикратных разведений. Для микробиологических исследований. Часть 2. Специальные правила подготовки мяса и мясных продуктов".}

------------------------------

ГОСТ ISO 6887-3 ^** Микробиология пищевой цепи. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологического исследования. Часть 3. Специальные правила подготовки рыбы и рыбной продукции

------------------------------

^**_{В Российской Федерации не действует.}

------------------------------

ГОСТ ISO 6887-4 ^** Микробиология пищевой цепи. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологического исследования. Часть 4. Специальные правила подготовки различной пищевой продукции и кормов

------------------------------

^**_{В Российской Федерации не действует.}

------------------------------

ГОСТ ISO 6887-5 Микробиология пищевой продукции и кормов. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологического исследования. Часть 5. Специальные правила подготовки молока и молочной продукции

ГОСТ ISO 6887-6 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка проб для анализа, исходной суспензии и десятичных разведений для микробиологического исследования. Часть 6. Специальные правила приготовления проб, отобранных на начальной стадии производства

ГОСТ ISO 7218 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ ISO 11133 Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред

ГОСТ ISO 13307 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Начальная стадия производства. Методы отбора проб

ГОСТ ISO 16140 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов

ГОСТ ISO 17604 ^* Микробиология пищевой цепи. Отбор проб с туши для микробиологического анализа

------------------------------

^*_{В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 17604-2011 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Отбор проб с туши для микробиологического анализа".}

------------------------------

ГОСТ ISO/TS 17728 Микробиология пищевой цепи. Методы отбора проб пищевой продукции и кормов для микробиологического анализа

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ ISO 11133, а также следующие термины с соответствующими определениями.

3.1 Listeria monocytogenes: Микроорганизмы, образующие типичные колонии на плотных селективных средах и идентифицируемые по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам в соответствии с настоящим стандартом.

3.2 обнаружение Listeria monocytogenes: Определение наличия или отсутствия бактерий Listeria monocytogenes в определенной массе или объеме продукта или на определенной поверхности в соответствии с настоящим стандартом.

3.3 бактерии рода Listeria (Listeria spp.): Микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотных селективных средах и идентифицируемые по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам в соответствии с настоящим стандартом.

3.4 обнаружение бактерий рода Listeria (Listeria spp.): Определение наличия или отсутствия Listeria spp. в определенной массе или объеме продукта или на определенной поверхности в соответствии с настоящим стандартом.

4 Сокращения

В настоящем стандарте использованы следующие сокращения:

ALOA - агар Listeria по Оттавиани и Агости;

МПА - мясопептонный агар;

МПБ - мясопептонный бульон;

ПАЛ - питательный агар для выделения листерий;

ПБЛ - питательный бульон для выделения листерий;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

PBS - фосфатно-солевой буфер;

TSB - трипказо-соевый бульон;

TSYEA - триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом;

TSYEB - триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом;

UVM - селективный накопительный бульон;

VP - реакция Фогеса-Проскауэра.

5 Сущность метода

Метод выявления бактерий L. monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.) в определенной массе или объеме продукта, а также на определенной площади поверхности производственной окружающей среды состоит из четырех последовательных этапов (см. 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 и приложение А).

5.1 Первичное обогащение анализируемой пробы в жидкой среде со сниженной концентрацией селективных компонентов при температуре 30 °C в течение 24-26 ч.

Примечание - Бактерии рода Listeria в продукте могут находиться в небольшом количестве, очень часто на фоне значительного количества микроорганизмов других родов. Поэтому для выявления небольшого количества бактерий рода Listeria, а так же "поврежденных" клеток в пробе необходим этап селективного обогащения на среде с пониженной концентрацией селективных компонентов.

Присутствие L. monocytogenes может быть замаскировано присутствием других видов Listeria, в частности L. innocua или L. ivanovii.

5.2 Вторичное обогащение посевного материала, полученного по 5.1 в жидкой среде с полной концентрацией селективных компонентов при температуре (37  1) °C в течение (24  2) ч при выявлении L. monocytogenes и 48 ч - при выявлении Listeria spp. В случае использования другой жидкой питательной среды следует руководствоваться рекомендациями производителя.

5.3 Пересев посевного материала, полученного по 5.1 и 5.2, параллельно на две плотные селективные среды:

а) первая среда: ALOA.

Примечание - Допускается использование других сред с тем же составом;

б) вторая среда (обязательная): одна из плотных селективных сред, на выбор лаборатории: Оксфорд агар, или Палкам агар, или ПАЛ, или хромогенные среды, отличные от первой среды [см. 5.3 а)].

Посевы на средах ALOA культивируют при температуре (37  1) °C и просматривают через (24  3) ч, при необходимости культивируют еще через (24  3) ч, контролируя наличие роста колоний, характерных для L. monocytogenes или других видов Listeria.

Примечание - Некоторые L. monocytogenes характеризуются медленной активностью PIPLC (фосфатидилинозитолфосфолипазы C) и могут проявлять на нее например, через 4 дня культивирования.

Некоторые штаммы L. monocytogenes образуют очень слабую зону помутнения среды вокруг колоний в случаях испытанного стресса, в частности кислотного.

Температура и продолжительность инкубации на второй селективной среде определяется согласно рекомендациям производителя питательных сред.

5.4 Подтверждение

Колонии с характерным для Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.) ростом, полученные по 5.3, пересевают на поверхность плотных неселективных питательных сред и культивируют при температуре (37  1) °C в течение (24  3) ч для дальнейшего подтверждения по тестам идентификации.

6 Питательные среды, тест-системы и реактивы

6.1 Общие требования

Состав и приготовление питательных сред и реактивов - в соответствии с приложением Б.

6.2 Селективные среды первичного обогащения

В качестве селективных сред первичного обогащения могут быть использованы следующие среды.

6.2.1 Бульон Фразера полуконцентрированный (Half Fraser broth) - по Б.1.1.

6.2.2 Селективный накопительный бульон (UVM) - по Б.1.2.

6.2.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I) - по Б.1.3.

6.3 Селективные среды вторичного обогащения

В качестве селективных сред вторичного обогащения могут быть использованы следующие среды.

6.3.1 Бульон Фразера (Fraser broth) - по Б.2.1.

6.3.2 Селективный накопительный бульон (UVM II) - по Б.2.2.

6.3.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II) - по Б.2.3.

6.4 Селективные плотные среды

В качестве первой среды необходимо использовать следующую среду.

6.4.1 Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA) - по Б.3.1.1.

Примечание - Допускается использование других хромогенных сред с тем же составом [см. 5.3 а)].

В качестве второй среды необходимо использовать одну из следующих сред.

6.4.2 Оксфорд агар (Oxford agar) - по Б.3.2.1.

6.4.3 Палкам агар (PALCAM agar) - по Б.3.2.2.

6.4.4 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ) - по Б.3.2.3.

6.4.5 Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar) - по Б.3.2.4.

Выбор второй среды - на усмотрение испытательной лаборатории.

6.5 Питательные среды для изучения культурально-морфологических свойств бактерий рода Listeria

6.5.1 Плотные неселективные питательные среды

6.5.1.1 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) - по Б.4.1.1.

6.5.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA) - по Б.4.1.2.

6.5.1.3 Мясопептонный агар (МПА) - по Б.4.1.3.

6.5.2 Жидкие неселективные питательные среды

6.5.2.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) - по Б.4.2.1.

6.5.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB) - по Б.4.2.2.

6.5.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ) - по Б.4.2.3.

6.6 Среды и реактивы для подтверждения рода Listeria (Listeria spp.)

6.6.1 Раствор с объемной долей перекиси водорода 3 % - по ГОСТ 10444.1.

6.6.2 Растворы и реактивы для окраски по Граму - по ГОСТ 10444.1 или ГОСТ ISO 7218.

6.6.3 Коммерческие наборы для окраски по Граму - согласно инструкции производителя.

6.6.4 Среда для определения подвижности бактерий - по Б.8.

6.6.5 Среда для определения лецитиназной активности - по Б.10.1 и Б.10.2.

6.6.6 Среда и реактивы для реакции Фогеса-Проскауэра (VP) - по Б.10.3.

6.7 Среды и реактивы для дальнейшего подтверждения Listeria monocytogenes и других видов Listeria

6.7.1 Среда и реактив для определения -гемолитической активности

6.7.1.1 Кровяной агар - по Б.5.1.

6.7.1.2 Суспензия из эритроцитов барана - по Б.6.

6.7.2 Буфер фосфатно-солевой (PBS) - по Б.11.

6.7.3 Среда для проведения КАМП-теста (CAMP) - по Б.9 (при необходимости).

6.7.4 Среды для определения ферментативных свойств культуры - по Б.7.1 и Б.7.2.

6.7.5 Углеводы - по Б.7.1.2.

6.7.5.1 Рамноза.

6.7.5.2 Ксилоза.

6.8 Среды и реактивы для взятия смывов

6.8.1 Универсальный нейтрализатор - по Б.12.

6.8.2 Пептонная вода - по Б.13.

7 Средства измерений, аппаратура, посуда, материалы и тест-штаммы

Аппаратура и материалы по ГОСТ 10444.1 и ГОСТ ISO 7218 со следующими дополнениями.

pH-метр с точностью измерения  0,01 ед. pH при 25 °C.

Шкаф сушильный стерилизационный для сухой стерилизации или автоклав для влажной стерилизации.

Термостат, поддерживающий температуру между (25  1) °C и (50  1) °C.

Термостаты, поддерживающие температуры: (25  1) °C, (30  1) °C, (37  1) °C.

Баня водяная, поддерживающая температуру 44 °C - 47 °C.

Петля микробиологическая из платиново-иридиевого или никель-хромового сплава или пластиковая диаметром 3 мм или объемом 10 мкл.

Игла из платиново-иридиевого или никель-хромового сплава или пластиковая.

Шпатели стеклянные, пластиковые или алюминиевые, предназначенные для посева культур микроорганизмов на чашках Петри.

Пробирки стерильные.

Колбы и флаконы необходимой вместимости.

Дозаторы автоматические переменного объема.

Наконечники одноразовые, стерильные для дозаторов.

Чашки Петри стеклянные или пластиковые диаметром от 90 до 100 мм.

Микроскоп для фазово-контрастной микроскопии.

Рамки-трафареты.

Одноразовое оборудование и материалы - по ГОСТ ISO 7218.

Контрольные тест-штаммы:

- S. aureus (при необходимости);

- R. equi (при необходимости);

- L. innocua;

- L. ivanovii (при необходимости);

- L. monocytogenes;

- Е. faecalis;

- Е. coli.

Материалы для отбора смывов:

- стерильный тампон с хлопком или синтетическим материалом в пробирке или без;

- стерильная ткань (или салфетка), не содержащая ингибирующих веществ;

- стерильная губка с ручкой или без нее, без ингибирующих веществ.

Допускается применение других средств измерений, аппаратуры с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже указанных в настоящем стандарте.

8 Отбор и подготовка проб к исследованию

8.1 Отбор и подготовка проб пищевых продуктов - по ГОСТ ISO/TS 17728, ГОСТ ISO 707, ГОСТ ISO 17604, ГОСТ ISO 13307, ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ISO 6887-1, ГОСТ ISO 6887-2, ГОСТ ISO 6887-3, ГОСТ ISO 6887-4, ГОСТ ISO 6887-5, ГОСТ ISO 6887-6, ГОСТ 26669, ГОСТ 26670, ГОСТ 7702.2.0.

8.2 Отбор проб (смывов) с объектов окружающей производственной среды (технологического оборудования, тары, инвентаря, стен и полов производственных цехов, одежды и поверхности рук работников) осуществляется согласно приложению В с учетом нижеследующего:

- при отборе смывов с влажной поверхности допускается использовать сухой тампон/губку/ткань (салфетку) при условии отсутствия необходимости использования нейтрализатора;

- при отборе смывов с сухой поверхности необходимо использовать тампон, губку/ткань (салфетку), увлажненный нейтрализатором (см. 6.8.1) - в случае отбора смывов после дезинфекции или пептонной водой (см. 6.8.2) - в остальных случаях;

- смывы с площади меньше или равной 10  10 см (100 см ²) отбирают стерильным тампоном с хлопком или синтетическим материалом;

- при отборе смывов с площади более 100 см ² следует использовать губку/ткань (салфетку);

- смывы с мелких объектов (поверхность которых менее 100 см ²) берут со всей поверхности;

- при взятии смывов с ровной поверхности рекомендуется использовать стерильные металлические рамки-трафареты, ограничивающие площадь взятия смывов, которые должны быть фламбированы перед каждым повторным использованием;

- при взятии смывов с рук тщательно протирают не менее 5 раз ладони, а также пальцы, межпальцевое пространство и особенно ногтевое ложе стерильными и увлажненными ватными тампонами. С перчаток смывы берут только со стороны ладоней;

- смывы с санитарной одежды отбирают с помощью тампонов с четырех участков, каждый из которых должен быть не менее 25 см ², а именно нижняя часть каждого рукава и две площадки с верхней и средней частей передних пол одежды;

- для отбора проб в труднодоступных небольших участках следует использовать тампоны.

Примечания

1 Для увеличения извлекаемости микроорганизмов с области отбора смывов рекомендуется использовать увлажненные тампоны.

2 Для увеличения обнаружения микроорганизмов общая площадь выборки должна быть как можно большей. В связи с этим рекомендуется отбирать пробы площадью от 100 см ².

9 Проведение испытания

Схема проведения испытания пищевой продукции и смывов приведена в приложении А.

9.1 Проба для анализа и исходная суспензия

Анализируемую пробу X (г или см ³) вносят в селективную среду первичного обогащения, исходя из соотношения продукта и среды 1:9.

Смывы, отобранные по 8.2, вносят в селективную среду первичного обогащения согласно приложению Б.

9.2 Первичное обогащение

Исходную суспензию (см. 9.1) культивируют при температуре (30  1) °C в течение (25  1) ч.

9.3 Вторичное обогащение

9.3.1 Посевной материал, полученный по 9.2 в объеме 0,1 см ³, пересевают в пробирку, содержащую 10 см ³ среды селективного обогащения (см. 6.3).

9.3.2 Посевы (см. 9.3.1) культивируют при температуре (37  1) °C в течение (24  2) ч (для бульона Фразера). В случае использования другой селективной жидкой питательной среды продолжительность культивирования согласно инструкции производителя.

Примечание - Посевы на питательных средах первичного и вторичного обогащения после окончания культивирования перед пересевом на плотные селективные среды допускается хранить при температуре не выше 5 °C не более 72 ч.

9.4 Пересев на плотные селективные среды

9.4.1 Посевной материал, полученный после первичного и вторичного обогащения (см. 9.2 и 9.3) с помощью бактериологической петли, пересевают на поверхность первой плотной селективной среды ^* (см. 6.4.1) так, чтобы получить хорошо изолированные колонии.

------------------------------

^*_{Допускается в Российской Федерации не использовать.}

------------------------------

Аналогичным образом проводят пересев и на вторую плотную селективную среду (см. 6.4.2, или 6.4.3, или 6.4.4, или 6.4.5).

9.4.2 Чашки с посевами на первой плотной селективной среде (см. 9.4.1) культивируют в термостате при температуре (37  1) °C в течение 24-48 ч.

Чашки с посевами на второй плотной селективной среде инкубируют согласно инструкции производителя питательных сред.

9.4.3 Через (24  3) ч или (48  2) ч [если после (24  3) ч отмечен слабый рост культуры или его отсутствие] культивирования на первой и второй плотной селективной средах (10.4) учитывают наличие колоний с ростом характерных для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.

9.4.3.1 На первой селективной плотной среде бактерии вида L. monocytogenes и L. ivanovii растут в виде сине-зеленых колоний, окруженные непрозрачным ореолом (типичные колонии). Другие виды бактерий рода Listeria также растут в виде сине-зеленых колоний, но без ореола.

Примечания

1 Некоторые штаммы L. monocytogenes могут давать очень слабый ореол помутнения питательного агара вокруг колонии или вовсе не иметь его. Это характерно для "поврежденных" клеток L. monocytogenes (например, вследствие воздействия кислот).

2 Некоторые штаммы L. monocytogenes характеризуются пониженной фосфатидилинозитолфосфолипазной C активностью. Для выявления таких штаммов требуется более продолжительное культивирование.

3 После инкубации посевы на плотных селективных средах до начала следующих тестов допускается хранить не более двух дней при температуре 5 °C.

9.4.3.2 Посевы на второй плотной селективной среде просматривают на наличие колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria.

На Палкам агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, иногда с черным центром.

На Оксфорд агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие сероватые колонии, окруженные черным ореолом.

На ПАЛ все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-желтые колонии с черным ореолом.

На Бриллианс Listeria агаре (BRILLIANCE LISTERIA agar) бактерии L. monocytogenes и L. ivanovii растут в виде сине-зеленых колоний, окруженные непрозрачным ореолом (типичные колонии). Другие виды бактерий рода Listeria растут в виде сине-зеленых колоний, но без ореола.

9.4.3.3 При отсутствии колоний с ростом, характерным для Listeria monocytogenes и рода Listeria (Listeria spp.) как на первой, так и на второй плотных селективных средах, исследование прекращают и делают заключение, в зависимости от поставленной задачи, об отсутствии в исследуемой пробе бактерий Listeria monocytogenes или рода Listeria (Listeria spp.).

9.5 Подтверждение принадлежности выделенных культур к роду Listeria

9.5.1 Выбор колоний для подтверждения

9.5.1.1 С каждой чашки с плотной селективной средой (см. 9.4.3) отбирают по пять колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria.

Если на чашке выросло менее пяти типичных колоний, отбирают их все.

9.5.1.2 Отобранные колонии пересевают на поверхность подсушенного плотного неселективного питательного агара (см. 6.5.1.1-6.5.1.3) так, чтобы получить изолированные колонии.

Посевы культивируют при температуре (37  1) °C в течение (24  3) ч.

На плотных неселективных питательных средах бактерии Listeria spp. растут в виде выпуклых, бесцветных и непрозрачных колоний в диаметре от 1,0 до 2,0 мм. Когда чашку Петри просматривают на свету (искусственном или естественном) под углом около 45, колонии имеют сине-серый цвет и зернистую поверхность.

Достаточно одной подтвержденной типичной колонии на образец. Если первая колония будет отрицательна, для проведения идентификации используют остальные отобранные колонии.

Для подтверждения принадлежности выделенной культуры к бактериям рода Listeria проводят тесты, приведенные в таблице 1.

Таблица 1 - Подтверждающие тесты на бактерии рода Listeria

Статус тестов	Тесты для идентификации бактерий рода Listeria	Результаты
Обязательные	Микроскопия	Тонкие короткие грамположительные палочки или коккобациллы
	Реакция на каталазу	+
Необязательные	VP тест	+
	Подвижность при 25 °C	+

9.5.2 Микроскопия

Культуры, выделенные по 9.5.1.2, окрашивают по Граму согласно ГОСТ 30425 или ГОСТ ISO 7218 и микроскопируют.

Бактерии рода Listeria spp. представляют собой грамположительные тонкие, короткие палочки или коккоподобные палочки.

9.5.3 Реакция на каталазу

Берут изолированную колонию, выделенную по 9.5.1.2, и вносят в каплю 3 %-ного раствора перекиси водорода (см. 6.6.1). Мгновенное образование пузырьков газа указывает на положительную реакцию.

Бактерии Listeria spp. являются каталазоположительными.

9.5.4 Реакция Фогеса-Проскауэра (VP)

Пробирку, содержащую 3 см ³ среды VP (см. Б.10.3.1) инокулируют с помощью петли культурой, полученной по 9.5.1.2, и инкубируют при температуре 37 °C в течение (24  3) ч. После инкубации добавляют 0,6 см ³ 5 %-ного раствора -нафтола (см. Б.10.3.2) и 0,2 см ³ 40 %-ного раствора гидроксида калия (см. Б.10.3.3), хорошо встряхивают, наклоняя пробирку, чтобы увеличить площадь поверхности раздела воздух - жидкость и учитывают результат через 15 мин и 1 ч. Положительная реакция обозначена ярко-красным цветом раствора.

9.5.5 Определение подвижности

Культуру, выделенную по 9.5.1.2, пересевают в жидкую неселективную питательную среду (см. 6.5.2).

Посевы культивируют при температуре (25  1) °C от 8 до 24 ч до появления мутности в бульоне. Затем каплю культуральной жидкости помещают на предметное стекло, накрывают сверху покровным стеклом и микроскопируют.

В поле зрения микроскопа должны наблюдаться короткие палочки с опрокидывающими движениями.

При культивировании посевов в жидкой питательной среде при температуре выше (25  1) °C подвижность бактерий не наблюдается.

В качестве альтернативного теста определения подвижности можно использовать посев культуры уколом в питательную среду (см. 6.6.4).

Посевы культивируют в термостате при температуре (25  1) °C в течение 48 ч.

Бактерии Listeria spp. подвижны при температуре (25  1) °C, образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик. Если рост слабый, необходимо культивировать еще пять суток с ежедневным просмотром посевов.

9.6 Подтверждение Listeria monocytogenes

Для подтверждения Listeria monocytogenes культуры, выделенной по 9.5.1.2, проводят тесты, приведенные в таблице 2.

Таблица 2 - Подтверждающие тесты на L. monocytogenes

Статус тестов	Тесты для идентификации L. monocytogenes	Результаты
Обязательные	Микроскопия *	Тонкие короткие грамположительные палочки или коккобациллы
	В-гемолиз	+
Обязательные	Ферментация L-рамнозы	+
	Ферментация D-ксилозы	-
Необязательные	Реакция на каталазу	+
	Подвижность при 25 °C	+
	КАМП-тест	+
* Микроскопия необязательна для колоний, отобранных с первой и для второй плотной селективной среды, если они позволяют различать патогенные и непатогенные виды Listeria spp.

9.6.1 Определение бета-гемолитической активности

9.6.1.1 С использованием кровяного агара

Поверхность кровяного агара (см. 6.7.1.1) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и проколоть каждый маркированный квадрат бактериальной иглой с колонией культуры, полученной по 9.5.1.2. На каждую чашку с кровяным агаром, кроме исследуемых культур, должны быть посеяны контрольные штаммы, такие как L. monocytogenes (положительный контроль) и L. innocua (отрицательный контроль).

Посевы культивируют при температуре (37  1) °C в течение (24  2) ч.

Зона -гемолиза на кровяном агаре у культуры L. monocytogenes - в виде узкой, чистой, светлой зоны; L. innocua - нет зоны гемолиза вокруг укола; L. seeligeri - слабая зона гемолиза; L. ivanovii - широкая, четко обозначенная зона гемолиза.

После инкубирования проводят визуальное сравнение прозрачности зон вокруг анализируемых и контрольных культур.

Примечание - Зона -гемолиза более четко видна при удалении колонии с поверхности агара вокруг места посева.

9.6.1.2 С использованием суспензии эритроцитов барана

В 0,15 см ³ жидкой неселективной питательной среды (см. 6.5.2) необходимо внести одну колонию культуры, полученную по 9.5.1.2.

Посевы культивируют при температуре (37  1) °C в течение 24 ч. Затем добавляют 0,15 см ³ суспензии эритроцитов барана (см. 6.7.1.2) и продолжают культивирование при температуре (37  1) °C от 15 до 60 мин, с последующим охлаждением при температуре (3  2) °C около 2 ч.

При наличии у культуры гемолитической активности - жидкость окрашена в соломенно-коричневый цвет и отсутствует осадок красных кровяных клеток на дне лунки.

При отсутствии гемолитической активности наблюдается осадок красных кровяных клеток на дне лунки. Клетки могут быть красно-коричневыми по цвету.

Если реакция неопределенная, следует оставить культуру при температуре (3  2) °C на 24 ч.

9.6.2 Определение лецитиназной активности (при необходимости)

При необходимости изучения лецитиназной активности культуры, полученной по 9.5.1.2, можно использовать лецитин-агар с активированным углем и без угля.

Поверхность лецитин-агара с активированным углем и без угля (см. 6.6.5) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и высевать на каждый маркированный квадрат бактериологической петлей колонию культуры, полученной по 9.5.1.2. На каждую чашку с лецитин-агаром с активированным углем и без угля, кроме исследуемых культур, должен быть посеян контрольный штамм L. monocytogenes (положительный контроль).

Посевы культивируют при температуре (37  1) °C в течение (48  2) ч.

L. monocytogenes при росте дает плотную зону помутнения шириной 3,0-6,0 мм на лецитин-агаре с активированным углем за счет гидролиза лецитина.

L. monocytogenes при росте не дает плотную зону помутнения на лецитин-агаре без активированного угля.

9.6.3 Определение ферментативных свойств L. monocytogenes

У культур, полученных по 9.5.1.2, определяют ферментативные свойства. Для этого используют суточную культуру.

Посевы следует культивировать при температуре (37  1) °C.

Положительную реакцию в отношении углеводов определяют по изменению окраски среды в желтый цвет за счет образования кислоты. Изменение цвета среды происходит, как правило, в течение 24-48 ч. При использовании микрообъемов питательных сред ферментативные реакции протекают быстрее. Продолжительность культивирования согласно инструкции производителя питательных сред.

9.6.4 КАМП-тест

В случае возникновения сомнений при интерпретации результатов гемолитического теста допускается использовать КАМП-тест как вспомогательный тест.

Существуют редкие штаммы L. monocytogenes, которые не показывают (3-гемолиз или положительную реакцию на КАМП-тесте в условиях, описанных в настоящем стандарте.

Двухсуточные культуры гемолитических штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi высевают на кровяной агар, как показано на рисунке 1.

Рисунок 1 - Посев и интерпретация КАМП-теста

Между вертикальными линиями Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают параллельными линиями исследуемые культуры на расстоянии друг от друга не менее 1 см и от вертикальных линий - 0,5 см.

Посевы культивируют при температуре (37  1) °C в течение 24 ч.

Для положительного контроля рекомендуется провести посев тест-штамма Listeria monocytogenes аналогично посеву исследуемых культур.

После культивирования посевов отмечают изменение (расширение и просветление) зоны гемолиза в зонах, соседствующих с вертикальными штрихами Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi.

Listeria monocytogenes дает положительную реакцию (расширение и просветление зоны гемолиза) около штриха Staphylococcus aureus и отрицательную (отсутствие изменений в зоне гемолиза) - около штриха Rhodococcus equi.

9.7 Интерпретация морфологических и физиологических свойств и биохимических реакций

Все Listeria spp. - мелкие, грамположительные коккоподобные палочки, которые дают положительную реакцию VP и являются каталазоположительными.

L. monocytogenes отличаются от других видов Listeria spp. биохимическими свойствами, указанными в таблице 3.

Таблица 3 - Биохимические свойства различных видов бактерий рода Listeria

Виды	Реакция на -гемолиз	Ферментация		КАМП-тест
		рамноза	ксилоза	S. aureus	R. equi
L. monocytogenes	+	+	-	+	-
L. innocua	-	V	-	-	-
L. ivanovii	+	-	+	-	+
L. seeligeri	(+)	-	+	(+)	-
L. welshimeri	-	V	+	-	-
L. grayisubsp. grayi	-	-	-	-	-
L. grayisubsp. murrayi	-	V	-	-	-
Примечание - В данной таблице приведены следующие обозначения: "V" - вариабельная реакция; "(+)" - слабая реакция; "+" - > 90 % положительных реакций; "-" - нет реакции.

Примечание - Для изучения биохимических свойств выделенных по 9.5.1.2 колоний можно использовать следующие коммерческие тест-системы: Listeria ID MID-67, Microbact 12L, API Listeria и другие тест-системы, валидированные по ГОСТ ISO 16140.

9.8 Ускоренное обнаружение и идентификация бактерий Listeria spp. и Listeria monocytogenes с использованием различных тестов и тест-систем

Для ускоренного обнаружения (скрининга) и идентификации Listeria spp. и Listeria monocytogenes допускается использование валидированных по ГОСТ ISO 16140 тестов и тест-систем в соответствии с инструкциями производителя, в том числе следующих.

9.8.1 Идентификация бактерий до рода Listeria

Listeria Latex Kit.

Singlepath Listeria.

VIDAS Listeria Duo (LDUO).

Анализатор GENE-UP.

API Listeria.

Listeria ID MID-67.

Microbact 12L.

9.8.2 Идентификация бактерий Listeria monocytogenes

VIDAS Listeria monocytogenes II (LM02).

VIDAS L. monocytogenes Xpress (LMX).

Singlepath L'mono.

API Listeria.

Listeria ID MID-67.

Microbact 12L.

BAX System PCR assay for L. monocytogenes.

BAX System PCR assay for L. monocytogenes 24E.

TaqMan Listeria monocytogenes Detection Kit и Prep Man Ultra Sample Preparation Reagent.

Food proof Listeria monocytogenes Detection Kit, 5'nuclease.

MDS Система молекулярного анализа.

Vitek 2 Compact.

MALDI-TOF масс-спектрометрический анализатор.

ПЦР-РВ: "АмплиСенс  Listeria momocytogenes-скрин/монитор-FL" (ООО "Интерлабсервис");

"Listeria monocytogenes" (ООО "ДНК-Технология").

9.9 Типирование выделенных штаммов Listeria monocytogenes

По эпидемиологическим показаниям штаммы, идентифицированные как L. monocytogenes, направляют в референс лаборатории для серотипирования и/или генотипирования.

10 Обработка результатов испытаний

Обработку результатов проводят по ГОСТ ISO 7218 и отмечают наличие или отсутствие L. monocytogenes и Listeria spp. в исследованной пробе с указанием массы в граммах, объема в см ³ или площади в см ².

11 Оформление протокола испытания

В протоколе испытания необходимо указать метод испытания и полученные результаты. В нем должны быть также упомянуты все процедуры, не указанные в настоящем стандарте, или рассматриваемые как дополнительные, а также сведения о любых случаях, вероятно повлиявших на результаты.

В протокол испытаний должна быть включена вся информация, необходимая для точной идентификации образца.

12 Требования безопасности

Требования безопасности при выполнении работ и квалификации оператора - по ГОСТ ISO 7218, а также выполнение требований национальных нормативных документов по обеспечению безопасности работ с условно-патогенными и патогенными агентами.

Для защиты здоровья лабораторного персонала настоятельно рекомендуется проводить работу, связанную с выявлением L. monocytogenes и Listeria spp., в лабораториях с квалифицированным микробиологом и соблюдать особую осторожность при работе с зараженным материалом. В частности, не рекомендуется беременному персоналу работать с бактериями L. monocytogenes и Listeria spp.

Ключевые слова: пищевые продукты, бактерии рода Listeria, Listeria monocytogenes, селективное обогащение, идентификация.