Откройте актуальную версию документа прямо сейчас
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Приложение А
(справочное)
Метод определения активности липазы
А.1 Сущность метода
Единицы активности липазы определяются титрованием жирных кислот, образующихся при гидролизе оливкового масла.
Одна единица липазы - это количество фермента, вырабатывающего 1 ммоль жирной кислоты в минуту при температуре 37 °С и рН 7,0.
А.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование и реактивы
Баня водяная с терморегулятором, обеспечивающим поддержание температуры от 5 °С до 100 °С с точностью 0,5 °С.
Блендер лабораторный или бытовой, гомогенизатор лабораторный, вихревой смеситель со скоростью вращения ножей до 16 000 об/мин.
Весы лабораторные по ГОСТ OlML R 76-1 с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более 0,01 г.
Мешалка механическая или электромагнитная.
Плитка электрическая с регулятором мощности нагрева по ГОСТ 14919.
Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 с диапазоном измерения от 0 °С до 100 °С, ценой деления 1 °С.
Холодильник электрический бытовой.
Колба Кн-1(2)-250 ТС по ГОСТ 25336.
Стакан В-1-100(150) ТХС по ГОСТ 25336.
Пипетка 1(2)-1(2)-1-5(10,25) по ГОСТ 29227.
Бюретка 1-1(2,3)-1(2)-25(50) по ГОСТ 29251.
Цилиндр 1(3)-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
Колбы 2(2а, 4, 4а)-100(1000)-1(2) по ГОСТ 1770.
Холодильник ХПТ-1 ХС по ГОСТ 25336.
Каплеуловитель КО-100 ХС по ГОСТ 25336.
Воронки В-36-80 ХС по ГОСТ 25336.
Секундомер.
Спирт поливиниловый по ГОСТ 10779, марки 16/1, 18/11, 20/1, 1-й сорт.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696 первой степени очистки.
Глицерин по ГОСТ 6259, ч.д.а. или х.ч.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч.д.а. или х.ч.
Натрия гидроокись, стандарт-титр.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, ч.д.а. или х.ч.
Кислота соляная, стандарт-титр.
Фенолфталеин.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный, ч или ч.д.а. по ГОСТ 11773.
Спирт этиловый по ГОСТ 17299, марки А, по ГОСТ 5962 не ниже "высшей очистки".
Ацетон по ГОСТ 2603, ч.д.а.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Масло оливковое рафинированное дезодорированное по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивы по качеству не ниже указанных.
А.3 Подготовка к определению
А.3.1 Приготовление раствора эмульгатора
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 помещают (20 0,5) г поливинилового спирта, приливают около 800 см 3 дистиллированной воды и нагревают на водяной бане при температуре от 75 °С до 80 °С в течение 60 мин, перемешивая. Раствор охлаждают до комнатной температуры, при необходимости фильтруют, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.
А.3.2 Приготовление субстрата
В емкость блендера помещают 300 см 3 раствора эмульгатора (А.3.1) (три части по объему) и 100 см 3 оливкового масла (одна часть по объему). Емкость блендера помещают в водяную баню с температурой от 8 °С до 10 °С так, чтобы содержимое емкости было полностью закрыто водой, и перемешивают в блендере со скоростью 12 000-16 000 об/мин в течение 10 мин. Затем полученный субстрат выдерживают в холодильнике при температуре от 8 °С до 10 °С в течение 60 мин. Перед использованием субстрата необходимо убедиться в отсутствии расслоения эмульсии субстрата.
А.3.3 Приготовление раствора фенолфталеина
В мерную колбу вместимостью 100 см 3 помещают 1,0 г фенолфталеина, приливают 70 см 3 этилового спирта и перемешивают до растворения. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Раствор хранят в холодильнике не более шести месяцев.
А.3.4 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) = 0,05 моль/дм 3
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят (500 1) см 3 раствора гидроокиси натрия молярной концентрации c(NaOH) = 1 моль/дм 3, приготовленной по ГОСТ 25794.1-83 (подраздел 2.2) или из стандарт-титра гидроокиси натрия согласно инструкции, прилагаемой к стандарт-титру.
Доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.
Раствор гидроокиси натрия хранят в закрытой емкости в холодильнике не более двух месяцев.
А.3.5 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCl) = 0,05 моль/дм 3
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят (500 1) см 3 раствора соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,1 моль/дм 3, приготовленной по ГОСТ 25794.1-83 (подраздел 2.1) или из стандарт-титра соляной кислоты согласно инструкции, прилагаемой к стандарт-титру.
Доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Раствор соляной кислоты хранят в закрытой емкости, не более шести месяцев.
А.3.6 Приготовление буферного раствора
В мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят 0,019 г лимонной кислоты и 0,014 г фосфорнокислого двузамещенного натрия, добавляют 60 см 3 дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.
А.3.7 Приготовление смеси этилового спирта с ацетоном
Смесь спирта с ацетоном готовят по объему из одной части этилового эфира и одной части ацетона.
А.4 Выполнение определения
При основном определении в коническую колбу вместимостью 50 см 3 вносят 5 см 3 раствора субстрата (А.3.2) и 4 см 3 буферного раствора (А.3.6), встряхивают и выдерживают на водяной бане при температуре (37 0,5) °С в течение 10 мин. Затем добавляют 1 см 3 раствора липазы (6.2.4), сразу встряхивают и выдерживают при температуре (37
0,5) °С в течение 20 мин для гидролиза субстрата. Добавляют 10 см 3 смеси этанола (95 %) и ацетона (1:1 по объему), встряхивают. Затем добавляют 10 см 3 раствора гидроокиси натрия молярной концентрации c(NaOH) = 0,05 моль/дм 3 и 10 см 3 смеси этилового спирта и ацетона (А.3.7), встряхивают. К полученному раствору добавляют две-три капли раствора индикатора фенолфталеина (А.3.3) и при постоянном перемешивании быстро титруют раствором соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,05 моль/дм 3 до исчезновения розовой окраски, устойчивой в течение 30 с.
Параллельно с основным определением выполняют контрольное определение следующим образом. В коническую колбу вместимостью 50 см 3 вносят 5 см 3 раствора субстрата (А.3.2) и 4 см 3 буферного раствора (А.3.6), встряхивают и выдерживают на водяной бане при температуре (37 0,5) °С в течение 10 мин. Затем добавляют 10 см 3 смеси этанола (95 %) и ацетона (1:1 по объему), 1 см 3 раствора липазы (6.2.4), сразу встряхивают. Добавляют 10 см 3 раствора гидроокиси натрия молярной концентрации c(NaOH) = 0,05 моль/дм 3, две-три капли раствора индикатора фенолфталеина (А.3.3) и при постоянном перемешивании быстро титруют раствором соляной кислоты молярной концентрации c(HCl) = 0,05 моль/дм 3 до исчезновения розовой окраски, устойчивой в течение 30 с.
А.5 Обработка результатов
А.5.1 Активность липазы А л, единиц/г, вычисляют по формуле
,
(А.1)
где а - объем раствора соляной кислоты, использованный при контрольном определении, см 3;
b - объем раствора соляной кислоты, использованный при основном определении, см 3;
М - количество липазы в 1 см 3 раствора (6.2.4), г.
20 - время гидролиза раствора субстрата, мин.
А.5.2 За результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений.
Вычисление выполняют с точностью до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.