Методические рекомендации МР 4.2.0287-22 "Организация внутреннего контроля качества в лабораториях, проводящих исследования на специфические антитела к вирусу кори методом иммуноферментного анализа" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 мая 2022 г.)

4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы

Методические рекомендации МР 4.2.0287-22
"Организация внутреннего контроля качества в лабораториях, проводящих исследования на специфические антитела к вирусу кори методом иммуноферментного анализа"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 мая 2022 г.)

Введены впервые

I. Область применения

1.1. В настоящих методических рекомендациях (далее - МР) представлен алгоритм проведения внутреннего контроля качества (далее - ВКК) лабораторных исследований, направленных на выявление специфических антител классов IgM и IgG к вирусу кори методом иммуноферментного анализа (далее - ИФА) с применением внутренних контрольных препаратов (далее - ВКП).

1.2. В МР использована система ВКК, позволяющая определять достоверность получаемых результатов и анализировать с помощью карты Леви-Дженнингса данные, полученные при обследовании больных и переболевших корью, а также привитых против этой инфекции. Алгоритм может применяться при использовании различных контрольных препаратов:

- собственного изготовления, приготовленных на основе пула положительных сывороток;

- коммерческих препаратов;

- при проведении анализов на тест-системах других производителей.

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научными и медицинскими организациями, исследующими гуморальный иммунитет к антигенам вируса кори методом ИФА.

II. Общие положения

2.1. Контроль качества лабораторных исследований является одной из важнейших составляющих работы современных клинико-диагностических лабораторий. Проведение мероприятий по ВКК является необходимым условием работы лабораторий, входящих в лабораторную сеть Всемирной организации здравоохранения (далее - ВОЗ) по кори и краснухе.

В рамках международной программы по надзору за корью и краснухой организована единая лабораторная сеть, включающая 10 субнациональных лабораторий в Российской Федерации и 10 лабораторий в странах СНГ [6, 7], в задачи которой входит подтверждение диагноза "корь" с использованием единого протокола исследования методом ИФА в соответствии с рекомендациями ВОЗ [8]. Отсутствие единого контрольного препарата при проведении ВКК и появление ложноположительных антител у лиц с аутоиммунными процессами потребовали усовершенствования контроля качества (далее - КК) исследований методом ИФА и увеличения кратности обследования пациентов на этапе элиминации инфекции [9 - 14].

2.2. Данные серологического мониторинга, а также выборочное изучение состояния специфического гуморального иммунитета к вирусу кори методом ИФА позволяют объективно оценить фактическую защищенность от кори лиц декретированных возрастов и профессиональных групп на территориях всех субъектов Российской Федерации в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹ и методическими документами ². При этом особое значение в лабораторных исследованиях имеют вопросы стабильности определения IgG-антител методом ИФА, позволяющие не только получать достоверную информацию, но и сопоставлять результаты разных исследователей [4, 14].

------------------------------

¹_{Пункт 2727 глава XXXV СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500).}

²_{МУ 3.1.2943-11 "Организация и проведение серологического мониторинга и состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит В)", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 15.07.2011.}

------------------------------

2.3. Определение восприимчивости к вирусу кори зависит от чувствительности и специфичности тест-систем, используемых в ИФА, а также от правильности интерпретации полученных результатов с учетом клинических и эпидемиологических данных ³ [4, 8].

------------------------------

³_{Приказ Минздрава Российской Федерации от 07.02.2000 N 45 "О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации"; ОСТ 91500.13.0001 "Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов", утвержденный приказом Минздрава России от 26.05.2003 N 220.}

------------------------------

При наличии случайных и систематических ошибок при проведении лабораторных исследований необходимо проведение процедур КК, одним из составных частей которого является ВКК. Система ВКК является оперативной формой контроля, данные которой свидетельствуют о степени достоверности полученных результатов.

Необходимость введения контрольного препарата для совершенствования системы ВКК исследований по определению антител к вирусу кори количественным и качественным методом ИФА обусловлена наличием нескольких сертифицированных в Российской Федерации тест-систем, различающихся по своим техническим характеристикам, а также наличием нескольких серий в пределах каждой тест-системы в течение одного года, что затрудняет анализ данных в рамках всей страны в течение длительного временного периода.

Имеющиеся в коммерческих наборах для ИФА внутритестовые контроли не обеспечивают выявления всех ошибок, которые могут повлиять на конечный результат. Использование ВКК в ИФА предусмотрено плановыми мероприятиями ВОЗ во всех лабораториях, входящих в международную лабораторную сеть (около 700 лабораторий) по надзору за корью и краснухой [9].

До ноября 2015 года лаборатории, входящие в лабораторную сеть по кори Российской Федерации и стран СНГ, готовили контрольные образцы для проведения ВКК, используя собственный банк положительных сывороток. Положительные сыворотки, обладая разной специфической активностью, не являются стандартными образцами, и использование их с целью КК может влиять на достоверность получаемых результатов.

2.4. Материально-техническое обеспечение метода ИФА с применением ВКП представлено в приложении 1 к настоящим МР.

III. Сущность контроля качества и внутреннего контроля качества

3.1. При проведении неколичественными методами ИФА каждой серии лабораторных исследований по определению противокоревых антител с помощью ИФА рекомендуется выполнять контрольные измерения, отображать их результаты на контрольных картах Леви-Дженнингса и на основании полученных данных принимать решение о степени достоверности полученных результатов [8].

3.2. ВКК является составной частью КК лабораторных исследований [11, 17].

Основной целью ВКК является выявление, оценка и оперативное устранение ошибок, возникающих в процессе лабораторных исследований. Данные ошибки могут быть связаны со сбоем в используемой аналитической системе, условиями окружающей среды и работой оператора.

Оперативная информация о напряженности специфического иммунитета необходима при расследовании последствий иммунизации и оценки уровня иммунитета населения к кори для проведения дополнительной вакцинации серонегативных лиц в индикаторных группах или ревакцинации.

Для лабораторий, входящих в лабораторную сеть ВОЗ по кори и краснухе, введение и использование в повседневной практике процедур ВКК является обязательным условием получения и продления аккредитации ВОЗ.

3.3. Факторами, влияющими на достоверность результатов при использовании положительных сывороток в качестве контрольных материалов, являются:

- объем образца и/или реагентов;

- качество аналита;

- соблюдение температурных режимов на всех этапах исследования, в том числе при хранении и транспортировке образцов;

- время инкубации и получения результатов;

- правильность записей и передачи результатов;

- тип и качество используемой тест-системы (в частности тип встроенных в тест-систему контролей);

- проблемы с калибровкой средств измерений;

- особенности работы оператора, проводящего исследования;

- отсутствие стандартного алгоритма проведения мероприятий по ВКК.

3.4. В Российской Федерации разработаны ВКП ⁴ для исследования IgM-антител к вирусу кори (далее - ВКП-IgM) и IgG-антител (далее - ВКП-IgG) ⁵, которые безвозмездно предоставляются в лаборатории, сертифицированные ВОЗ для диагностики кори и краснухи.

------------------------------

⁴_{Примечание. Допускается использование препаратов с аналогичными или лучшими характеристиками.}

⁵_{В качестве примера рассмотрены лиофилизированные препараты "ВЛК Корь-IgM" и "ВЛК Корь-IgG".}

------------------------------

3.5. Контрольные препараты для ВКК исследований могут быть:

- нативными, приготовленными на основе банка положительных сывороток;

- лиофилизированными, приготовленными промышленным способом для одной лаборатории или лабораторной сети (некоммерческие);

- лиофилизированными, приготовленными промышленным способом и находящимися в свободной продаже (коммерческие).

Условия при проведении ВКК серологических исследований вне зависимости от типа препарата [8]:

- контрольные материалы готовятся из биологического материала, родственного исследуемым образцам;

- рабочий раствор контрольного препарата (цельный или его рабочее разведение) не должен содержать нецелевые маркеры;

- процедура получения рабочего раствора должна быть последовательна (разведение исходного препарата, тестирование цельного препарата и его разведений в ИФА, определение сходимости), а полученные результаты воспроизводимы;

- контрольный препарат исследуется в аналитических сериях и условиях, как пробы пациентов;

- контрольный препарат должен проходить все этапы подготовки к проведению процедуры ВКК при переходе на новую тест-систему.

3.6. Проведение процедуры ВКК осуществляется в соответствии с алгоритмом ВКК исследований IgM и IgG к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов согласно приложению 2 к настоящим МР.

Приготовление рабочего раствора контрольных препаратов осуществляется согласно инструкции по их использованию. Контрольный препарат готовится в достаточном для проведения ВКК количестве.

Этапы приготовления и использования рабочего раствора контрольного препарата:

1) выбор рабочего разведения контрольного препарата осуществляют его двукратным титрованием с применением отрицательной донорской сыворотки (далее - ОДС) и тестированием полученных образцов методом ИФА. Подобранное рабочее разведение контрольного препарата должно находиться в диапазоне 2 - 3 cut off ⁶ (о.е.) в случае определения IgM или в диапазоне 0,5 - 1,5 о.е. при определении IgG;

------------------------------

⁶_{Cut off или отсечка - уровень оптической плотности (в единицах оптической плотности), отсекающий отрицательное и положительное значение при тестировании проб сыворотки крови.}

------------------------------

2) после выбора рабочего разведения контрольного препарата (он может быть цельным, если отвечает вышеуказанным условиям) переходят к процедуре ВКК. Исследуют внутрисерийную сходимость результатов измерений контрольного препарата путем оценки результатов измерений 10 независимых проб подобранного ранее рабочего раствора контрольного препарата методом ИФА в одной аналитической серии на одном планшете с расчетом коэффициента вариации (CV ₁₀) по формулам (приложение 3 к настоящим МР). Показатель CV ₁₀ контрольного препарата не должен превышать 8 % по ГОСТ Р 53133.1-4;

3) при выполнении правила CV ₁₀ < 8 %, контрольный препарат (цельный или его рабочее разведение) разливают по 20 мкл (объем, достаточный на одну постановку ИФА), замораживают и хранят при температуре (от минус 25 °C до минус 30 °C) не более 3 мес.;

4) оценивается воспроизводимость результатов по результатам измерений 20 проб цельного или выбранного рабочего разведения контрольного препарата в разных аналитических сериях методом ИФА с расчетом коэффициента вариации (CV ₂₀) по ГОСТ Р 53133.1-4 (приложение 3 к настоящим МР). Результаты могут быть получены одним оператором в течение 20 дней, или 10 дней при проведении 2 измерений в день, или несколькими сотрудниками, которые обычно выполняют анализ в лаборатории;

5) по результатам измерений 20 проб рабочего раствора контрольного препарата с использованием формул (приложение 3 к настоящим МР) строят контрольную карту Леви-Дженнингса. Алгоритм построения контрольной карты представлен в приложении 4 к настоящим МР. Контрольная карта используется для осуществления оперативного (текущего) контроля качества результатов исследования образцов. С этой целью в каждой аналитической серии образцов исследуют готовый контрольный образец с соблюдением процедур, предусмотренных инструкцией к тест-системе;

6) интерпретацию результатов проводят с использованием правил Вестгарда ⁷ (приложение 5 к настоящим МР). Правила Вестгарда [18] предназначены для проверки стабильности работы аналитической системы и используются при оценке приемлемости результатов анализа образцов.

------------------------------

⁷_{Правила Вестгарда позволяют регистрировать отклонение полученного значения протестированного контрольного препарата в пределах колебания среднеквадратического отклонения (S) +/-2S или +/-3S, а также позволяют установить систему отслеживания динамики таких отклонений в указанном промежутке.}

------------------------------

Для использования правил Вестгарда соблюдаются следующие условия:

1) рабочий раствор контрольного препарата должен соответствовать используемой тест-системе и положениям, изложенным в п. 3.4;

2) карта Леви-Дженнингса должна представлять собой графическую систему, где среднее значение рабочего раствора контрольного препарата и среднеквадратические отклонения (S) были определены на основе 20 повторных измерений рабочего раствора контрольного препарата с помощью используемой тест-системы;

3) учет результатов, полученных методом ИФА, может осуществляться только при соблюдении критериев валидации внутритестовых контролей, установленных производителем используемой тест-системы.

Система правил Вестгарда применяется для интерпретации карт Леви-Дженнингса с двумя или более контролями в каждой аналитической серии, но она может быть использована и в исследованиях с одним контролем. Если результат тестирования контрольного препарата нарушает правила Вестгарда, причины такого отклонения должны быть расследованы и, при необходимости, исследование проведено повторно.

IV. Пример проведения внутреннего контроля качества лабораторных исследований на наличие специфических IgM и IgG антител к вирусу кори методом иммуноферментного анализа с применением контрольных препаратов ⁸

------------------------------

⁸_{В качестве примера рассмотрены лиофилизированные препараты "ВЛК Корь-IgM" и "ВЛК Корь-IgG".}

------------------------------

4.1. Характеристика контрольных препаратов ВКП-IgM и ВКП-IgG, используемых для примера проведения внутреннего контроля качества лабораторных исследований на наличие специфических IgM и IgG антител к вирусу кори методом ИФА:

- ВКП-IgM - лиофилизированный контрольный препарат для оценки качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса М к вирусу кори;

- ВКП-IgG - лиофилизированный контрольный препарат для оценки качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса G к вирусу кори.

Дополнительно используется препарат ОДС, представляющий собой отрицательную донорскую сыворотку, не содержащую IgM/IgG к вирусу кори, который используется для приготовления разведений контрольных препаратов ВКП-IgM и ВКП-IgG.

ВКП-IgM и ВКП-IgG, а также ОДС изготавливают на основе сыворотки крови человека, инактивированной прогреванием (56 °C в течение 1 часа). Препараты не должны содержать HBsAg, антител к ВГС, Т. Pallidum, ВИЧ-1,2, антиген р24 ВИЧ-1.

Примеры показателей специфической активности препаратов, полученных при аттестации контрольных препаратов с использованием тест-систем разных форматов ("indirect" и "capture"), приводятся в табл.

Таблица

Примеры показателей специфической активности контрольных препаратов ВКП-IgM и ВКП-IgG ⁹

------------------------------

⁹_{Показатели специфической активности (ОП, о.е.) для IgM и (ОП, о.е.) и значения МЕ/мл для IgG в контрольных препаратах (ВКП-IgM и ВКП-IgG) были определены при проведении 24 измерений каждого образца [13].}

------------------------------

Контрольный препарат	Тест-система	Среднее значение ОП (о.е.)	Дисперсия (D)	t-статистика	t-критическое	Уровень значимости (р)
ВКП-IgM	Тест-система 1 (формат "indirect")	2,83	0,02	59,78	2,03	7,85Е-30 (<0,05)
	Тест-система 2 (формат "capture")	0,70	0,007
ВКП-IgG	Тест-система 1	0,89	0,018	3,32	2,03	0,0398 (<0,05)
	Тест-система 2	0,76	0,040

Для возможности использования наборов разной модификации и разных производителей рекомендуется использовать оптическую плотность (далее - ОП) рабочего раствора контрольного препарата (цельного или его разведения) для неколичественного метода определения IgM в интервале 2 - 3 cut off (о.е.) используемой тест-системы [14].

4.2. Оценка качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса М к вирусу кори с применением контрольного препарата ВКП-IgM и проведение процедур ВКК осуществляется в соответствии с приложением 2 к настоящим МР.

4.3. Оценка качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса G к вирусу кори качественным и количественным методом ИФА с использованием контрольного препарата ВКП-IgG осуществляется в соответствии с приложением 2 к настоящим МР.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

3. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

4. МУ 3.1.2943-11 "Организация и проведение серологического мониторинга и состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит В)".

5. ГОСТ Р 53133.1-4 "Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований".

6. Национальный план мероприятий по реализации программы "Элиминация кори и краснухи, достижение спорадической заболеваемости эпидемическим паротитом в Российской Федерации" (2021 - 2025 гг.)".

7. Тихонова Н.Т., Мамаева Т.А., Шульга С.В., Ежлова Е.Б., Лыткина И.Н., Цвиркун О.В., Герасимова А.Г. Лабораторное обеспечение Программы ликвидации эндемичной кори в Российской Федерации // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. N 1. С. 36 - 39.

8. WHO. Manual for the Laboratory-based Surveillance of Measles, Rubella, and Congenital Rubella Syndrome; 3nd ed. Geneva. Switzerland: WHO, 2018.

9. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Epidemiological update: Measles - monitoring European outbreaks, 7 July 2017. Stockholm: ECDC; [Accessed 31 Aug 2017]. Available from: https://ecdc.europa.eu/en/news-events/epidemiological-update-measles-monitoring-european-outbreaks-7-july-2017.

10. Filia A., Bella A., Del Manso M., Baggieri M., Magurano F., Rota M.C. Ongoing outbreak with well over 4,000 measles cases in Italy from January to end August 2017 - what is making elimination so difficult? Euro Surveill. 2017. Vol. 22(37), P. 30614.

11. World Health Organization Regional Office for Europe (WHO/Europe). Fifth Meeting of the European Regional Verification Commission for Measles and Rubella Elimination (RVC) 24-26 October 2016, Copenhagen, Denmark. Copenhagen: WHO/Europe; [Accessed 31 Aug 2017]. Available from: http://www.euro.who.int/_data/assets/pdf_file/0005/330917/5th-RVC-meeting-report.pdf?ua=1.

12. Топтыгина А.П., Мамаева T.A., Алешкин B.A. Особенности специфического гуморального иммунного ответа против вируса кори // Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 1. N 3. С. 243 - 250.

13. Цвиркун О.В., Герасимова А.Г., Тихонова Н.Т., Ежлова Е.Б., Мельникова А.А., Дубовицкая Е.Л., Орлова А.А., Басов А.А., Фролов Р.А. Заболеваемость корью в разных возрастных группах в период элиминации инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017. Т. 16. N 3. С. 18 - 25.

14. Мамаева Т.А., Железнова Н.В., Наумова М.А., Говорухина М.В., Калашикова Н.А., Бичурина М.А., Мукомолов С.Л. Алгоритм лабораторного подтверждения и дифференциальной диагностики коревой инфекции в период элиминации кори в Российской Федерации // Инфекция и иммунитет. 2015. Т. 5. N 1. С. 55 - 62.

15. Голева О.В., Самойлова И.Г., Мурина Е.А., Мундруева А.А. Особенности противокоревого иммунитета у населения Санкт-Петербурга // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012. N 6. С. 25 - 29.

16. Топтыгина А.П., Смердова М.А., Наумова М.А., Владимирова Н.П., Мамаева Т.А. Влияние особенностей популяционного иммунитета на структуру заболеваемости корью и краснухой // Инфекция и иммунитет. 2018. Т. 8. N 3. С. 341 - 348.

17. Нетесова И.Г., Бобкова М.Р. Проведение внутрилабораторного контроля качества неколичественных методов иммуноферментного анализа // Справочник заведующего КДЛ. 2011. N 6. С. 9 - 15.

18. Westgard J.O. Design of internal quality control for reference value studies // Clin Chem Lab Med 2004. Vol. 42. P. 863 - 867.

19. Мамаева T.A., Железнова H.B., Наумова M.A., Чехляева Т.С., Воробейчиков Е.В., М. Бен Маму, Алешкин В.А. Совершенствование контроля качества исследований методом ИФА при лабораторном подтверждении кори и краснухи на этапе элиминации этих инфекций // Инфекция и иммунитет. 2017. Т. 7. N 1. С. 69 - 78.

20. Смердова М.А., Мамаева Т.А., Наумова М.А., Корецкий К.А., Иванов Д.С., Топтыгина А.П. Опыт проведения внутрилабораторного контроля качества при определении антител класса G к вирусу кори методом иммуноферментного анализа с помощью контрольного материала // Российский иммунологический журнал. 2019. Т. 13 (22). N 4. С. 1402 - 1410.