Методические рекомендации МР 1.2.0264-21 "Оценка генотоксичности химических веществ в микроядерном тесте in vivo на эритроцитах костного мозга млекопитающих" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 25 октября 2021 г.)

Методические рекомендации МР 1.2.0264-21
"Оценка генотоксичности химических веществ в микроядерном тесте in vivo на эритроцитах костного мозга млекопитающих"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 25 октября 2021 г.)

ББК 51.21

О-93

ISBN 978-5-7508-2052-8

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Методические рекомендации (далее - МР) применяются для оценки генотоксичности химических веществ разных химических классов.

1.2. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научными и образовательными организациями (лабораториями), занимающимися оценкой опасности химических веществ в объектах окружающей среды.

II. Общие положения

2.1. МР содержат описание метода оценки генотоксичности химических веществ in vivo на эритроцитах костного мозга млекопитающих с применением в качестве тест-объекта мелких лабораторных грызунов и определяют порядок проведения испытаний химических веществ и их смесей (далее - объекты испытаний).

2.2. Метод может быть использован в качестве самостоятельного или в сочетании с другими методами.

III. Описание метода

3.1. Метод позволяет выявлять и количественно оценивать генотоксичность химических веществ на хромосомном уровне на основании учета индукции микроядер (далее - МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (далее - ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Микроядра представляют собой небольшие ДНК-содержащие тельца, существующие в клетке отдельно от основного ядра или связанные с ним хроматиновым мостиком, возникновение которых связано с такими повреждениями генома, как появление ацентрических фрагментов хромосом или целых хромосом, отставших в анафазе или телофазе митоза от веретена деления и не вошедших в дочерние ядра. Доля клеток с микроядрами в общей популяции клеток является показателем индукции нарушения структуры или количества хромосом в эукариотических клетках, в частности, после воздействия исследуемого вещества. Микроядерный тест является удобным методом благодаря простоте распознавания ПХЭ и их короткому жизненному циклу. При развитии эритробласта в ПХЭ основное ядро выталкивается, а образовавшееся микроядро может оставаться в цитоплазме, поэтому в лишенном основного ядра ПХЭ легко визуализировать микроядра, возникшие спонтанно или индуцированные исследуемыми агентами. Повышение частоты ПХЭ с микроядрами у обработанных исследуемым веществом животных является показателем индуцированных хромосомных повреждений.

3.2. В качестве тест-объекта используют мелких лабораторных грызунов (мыши, крысы) обоих полов, и наиболее часто - мышей линии CD-1, в отношении которых имеется большая база исторических данных. В качестве органа-мишени используют костный мозг.

3.3. Основным показателем является частота ПХЭ с микроядрами в костном мозге животных в группах обработки химическими веществами относительно отрицательного контроля.

IV. Средства измерений, испытательное, вспомогательное оборудование и материалы ¹

------------------------------

¹_{Примечание : допускается использование средств измерений, испытательного и вспомогательного оборудования и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.}

------------------------------

4.1. Для проведения исследований используют следующее оборудование, химическую посуду и реактивы:

- весы лабораторные высокого класса точности;

- весы для взвешивания животных;

- магнитная мешалка с подогревом;

- встряхиватель;

- фармацевтический холодильник с морозильником;

- термометр цифровой записывающий (логгер данных температуры);

- центрифуга на 12 мест для пробирок типа Эппендорф 1,5 - 2,0 мл со скоростью не менее 3000 об./мин;

- микроскоп медико-биологический;

- микроскоп инвертированный;

- счетчик форменных элементов крови;

- дозаторы пипеточные одноканальные с переменным объемом: от 20 до 200 мкл; от 100 до 1000 мкл;

- водяная баня;

- фильтрующие насадки на шприц с диаметром пор 0,22 - 0,45 мкм;

- цилиндры вместимостью 10, 25, 50 мл, второго класса точности в соответствии с ГОСТ 1770;

- пробирки лабораторные (мерные со шлифом, с притертой пробкой на 20 и 25 мл);

- зонды внутрижелудочные для мелких грызунов;

- шприцы стерильные одноразовые, 1 мл с иглами;

- стекла предметные с адгезивным электростатическим покрытием, со шлифованными краями и полосой для записи;

- стекла предметные для растяжки мазков;

- ступки фарфоровые или стеклянные с пестиками разных размеров;

- стаканы стеклянные, емкости для окрашивания стекол со штативами;

- наконечники для дозаторов на 200 мкл, 1000 мл нестерильные;

- циклофосфамид (моногидрат) [N CAS 50-18-0, N CAS 6055-19-2];

- ножницы хирургические, остроконечные короткие;

- марля или бинт;

- шприцы инсулиновые одноразовые, иглы для инъекций внутримышечные, одноразовые;

- вода очищенная по ФС.2.2.002018 "Вода очищенная";

- микропробирки объемом 1,5 мл типа Эппендорф;

- штатив для микропробирок;

- фиксатор - спирт метиловый;

- краситель азур-эозин (можно применять готовый набор для фиксации и быстрого окрашивания мазков крови);

- фосфатный буфер таблетированный или концентрат;

- эмульгатор, например, Твин-80;

- масло иммерсионное, тип В (профессиональное);

- эмбриональная сыворотка теленка, инактивированная нагреванием при плюс 56 °C на водяной бане в течение 30 мин.

V. Проведение испытаний

5.1. Условия выполнения испытаний

5.1.1. При проведении испытаний в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура воздуха от плюс 18 до плюс 25 °C;

- относительная влажность воздуха не более 80 %;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа [(630 - 800 мм рт. ст.)].

5.2. Схема эксперимента

5.2.1. В стандартном эксперименте используют 10 групп животных (не менее 5 особей в каждой группе):

- 1 группа - отрицательный контроль, самки;

- 2 группа - отрицательный контроль, самцы;

- 3 группа - низкая доза, самки;

- 4 группа - низкая доза, самцы;

- 5 группа - средняя доза, самки;

- 6 группа - средняя доза, самцы;

- 7 группа - высокая доза, самки;

- 8 группа - высокая доза, самцы;

- 9 группа - положительный контроль, самки;

- 10 группа - положительный контроль, самцы.

5.2.2. Объекты испытания и отрицательный контроль вводят двукратно, с интервалом в 24 часа. Животным группы положительного контроля введение осуществляют однократно (во второй день эксперимента). Животных подвергают эвтаназии через 18 - 24 часа после второго введения.

5.2.3. В случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно на одних и тех же животных введение осуществляют 3 раза с интервалом 24 часа и животных подвергают эвтаназии через 3 - 6 часов после третьего введения.

5.3. Выбор доз для введения животным

5.3.1. В каждом исследовании используют не менее трех доз объекта испытания, которые определяют на основании данных о токсичности вещества (смеси веществ). В качестве высокой дозы использую либо 2000 мг/кг массы тела (м.т.) животных, либо (в случае высоко токсичных веществ) - максимальную переносимую дозу (далее - МПД).

5.3.2. МПД определяют в предварительном эксперименте с использованием не менее 2 групп животных каждого пола (не менее двух особей в каждой группе). В качестве максимальной дозы для проведения предварительного эксперимента используют дозу, составляющую 75 % от LD ₅₀. Последующие дозы выбирают, уменьшая предыдущую дозу в 2 - 4 раза. Если значение LD ₅₀ близко к 2000 мг/кг м.т., то в предварительном эксперименте используют только одну дозу (2000 мг/кг м.т.).

5.3.3. В основном эксперименте испытывают не менее трех доз с шагом в 2 - 4 раза при двукратном введении или при трехкратном введении (в эксперименте по одновременной оценке индукции микроядер и повреждений ДНК методом ДНК-комет). Низкая доза в эксперименте не должна вызывать видимых признаков токсичности. При наличии признаков токсичности у животных проводят дополнительное исследование с использованием меньших доз.

5.4. Способ введения объекта испытаний животным

5.4.1. Способ введения для оценки генотоксичности химических веществ выбирают с учетом преимущественного пути поступления в организм. Как правило, используют внутрижелудочное введение через зонд.

5.5. Расчет навески объекта испытания при приготовлении растворов/суспензий/эмульсий и получение необходимых доз для введения животным

5.5.1. Доза объекта испытания, вводимого лабораторным животным, не должна превышать 2000 мг/кг м.т. животного, а объем вводимого объекта испытаний не должен превышать 1 мл на 100 г м.т. животного (в случае водных растворов максимальный объем может составлять 2 мл/100 г м.т.). Например, если масса мыши равна 20,0 г, то максимально приемлемый объем составляет:

1 мл х 20 г /100 г = 0,2 мл на одно животное
(или 0,4 мл в случае водных растворов),

при этом максимальная концентрация растворов/суспензий/эмульсий не должна превышать 2000 мг х 20 г/ 1000 г = 40 мг в 0,2 мл (0,4 мл водного раствора).

Расчеты концентрации растворов/суспензий/эмульсий проводят, исходя из выбранных доз исследуемого вещества в мг/кг м.т. животного и объема вводимого раствора/суспензии/эмульсии, но, не превышая указанные выше пределы.

5.5.2. Пример расчетов для приготовления раствора/суспензии/эмульсии объекта испытания:

Если необходимо приготовить раствор/суспензию/эмульсию объекта испытания X для введения животным в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг м.т. и средняя масса животного (мыши) - 20,0 г, то для приготовления 10 мл раствора/суспензии/эмульсии в высокой концентрации (доза 2000 мг/кг м.т.) необходимо взять навеску 2000 мг вещества. Полученный исходный раствор/суспензия/эмульсия соответствует наибольшей дозе для введения животным. Далее последовательно разбавляют каждый предыдущий раствор/суспензию/эмульсию для получения необходимого количества доз.

5.6. Технология приготовления растворов/суспензий/эмульсий химических веществ для введения животным

5.6.1. Подготовку объектов испытаний проводят непосредственно в день введения животным. Растворителем или дисперсионной средой (далее - носителем) для приготовления растворов/суспензий/эмульсий вещества может быть: 0,5 - 1,0 % раствор крахмала или метилцеллюлозы, масло растительное рафинированное, вода очищенная. В каждом случае носитель выбирают в соответствии с токсикологическими и физико-химическими свойствами (гидрофобностью или гидрофильностью, растворимостью, агрегатным состоянием и т.д.) конкретного химического вещества.

5.6.2. В случае если объект испытания представляет собой водный раствор или вещество, растворимое в воде, то в качестве носителя (растворителя) используют воду очищенную. Растворы готовят методом разбавления точного объема (если объект испытания в виде водного раствора или водорастворимой жидкости) или растворения точной навески в мерной посуде (цилиндре или мерной пробирке) и доведения до метки водой.

5.6.3. В случае если объект испытаний представляет собой жидкость или твердое вещество, растворимые в растительном масле, то в качестве носителя (растворителя) используют пищевое масло растительное рафинированное (обычно подсолнечное). Растворы готовят методом разбавления точного объема или растворения точной навески в мерной посуде (цилиндре или пробирке) и доведения до метки маслом. Густые, очень вязкие и медообразные объекты испытания дозируют по массе.

5.6.4. В случае если объект испытания представляет собой нерастворимое в воде или масле твердое вещество, готовят суспензию в масле, воде или растворе крахмала:

- если вещество представляет собой очень мелкий аморфный пылевидный порошок, то измельчение не требуется;

- если вещество представляет собой кристаллический порошок или комковатую субстанцию, необходимо измельчение - в таком случае расчетное количество навески объекта испытания увеличивают примерно в 1,5 раза (чтобы учесть потери при измельчении); измельчение можно проводить с использованием ступки с пестиком или пробирки с пластиковым пестиком-гомогенизатором (для навесок до 250 мг);

- взвешивают точную навеску измельченного порошка объекта испытания в мерной емкости для приготовления суспензии (стеклянной или пластиковой);

- в мерную емкость небольшими порциями добавляют выбранный носитель (осторожно смачивая порошок и перемешивая до получения однородной пульпы (густой концентрированной суспензии)). Концентрированную суспензию постепенно разбавляют носителем и доводят до нужного объема;

- суспензию тщательно встряхивают и перемешивают до однородности, при необходимости с применением встряхивателя;

- готовят серию разбавлений полученной суспензии в соответствии с расчетами доз.

5.6.5. В случае если объектом испытаний является концентрат суспензии (например, в случае препаративной формы пестицида), то рабочие суспензии для введения животным готовят разведением с использованием подходящего носителя.

5.6.6. В случае если объект испытания представляет собой жидкость, несмешивающуюся с водой или маслом, то готовят, соответственно, эмульсию в масле, воде или 0,5 - 1,0 % крахмале:

- в тарированный стеклянный или пластиковый стакан на 50 - 60 мл отвешивают навеску объекта испытания (густой или пастообразной консистенции) или отмеряют точный объем дозатором (если жидкость близка по плотности к воде), добавляют выбранный носитель (масло растительное, 0,5 - 1,0 % крахмал в воде, вода очищенная) в объеме, примерно равном объему диспергируемой жидкости;

- тщательно перемешивают на магнитной мешалке до однородности, полученную концентрированную эмульсию разбавляют порциями носителя, каждый раз перемешивая до однородности, до объема, равного 2/3 от общего расчетного объема;

- концентрированную эмульсию переносят в мерную емкость, остатки смывают со стенок стакана несколькими порциями носителя, которые переносят в ту же емкость, объем эмульсии доводят до метки носителем;

- при необходимости, если вещество трудно подвергается диспергированию, допускается добавление 1 капли эмульгатора Твин-80.

5.7. Приготовление раствора положительного контроля

5.7.1. В качестве положительного контроля можно использовать этилметансульфонат, этилнитрозомочевину, митомицин С, циклофосфамид и триэтиленмеламин. Учитывая большое количество накопленных данных по оценке генотоксичности в разных лабораториях мира, в которых использовали циклофосфамид, именно это вещество рекомендуют в качестве положительного контроля при тестировании химических веществ и их смесей, что позволит сопоставлять результаты, полученные разными исследователями.

5.7.2. Циклофосфамид вводят в дозе 20 - 40 мг/кг м.т. животного. Навеску циклофосфамида растворяют в воде очищенной в мерной пробирке, фильтруют, пропуская через фильтрующую насадку на шприц с диаметром пор 0,22 - 0,45 мкм и разливают на аликвоты объемом 1,5 мл в пробирки типа Эппендорф. Аликвоты хранят в морозильной камере при минус 20 2 °C в течение 12 мес. Размороженный раствор подлежит использованию в течение нескольких часов, а остаток утилизируют. Повторное замораживание не допустимо.

5.8. Отрицательный контроль

5.8.1. В качестве отрицательного контроля применяют растворитель или носитель, используемый при приготовлении растворов/суспензий/эмульсий исследуемого вещества, в эквивалентном объеме.

5.9. Лабораторные животные

5.9.1. Эксперимент проводят на молодых здоровых мелких лабораторных грызунах (мышах, крысах) обоих полов. Наиболее широко используют мышей линии CD-1 (7 - 9 недельного возраста). Животных после получения из питомника содержат на карантине в течение 7 дней до начала эксперимента. Животных содержат в соответствии с ГОСТ 32216.

5.9.2. Перед началом эксперимента всех животных взвешивают и маркируют. Отклонение в массе тела животных в группах не должно превышать 20 % от средней массы для каждого пола. Животных случайным образом распределяют по группам и рассаживают в клетки. В предварительном эксперименте по выбору доз - не менее 2 животных в группе, в основном - не менее 5. Средняя масса животных в разных группах примерно равная. Каждую группу животных содержат в отдельной клетке. На клетку прикрепляют этикетку с указанием исследования, даты начала эксперимента, группы, пола, дозы исследуемого образца.

5.9.3. На определенный участок хвоста животного нетоксичным маркером наносят групповые и индивидуальные метки, представляющие собой одну или несколько цветных полосок, при этом индивидуальный номер животного закодирован цветом, сочетанием цветов, количеством и расположением полосок.

Удерживая животное за кончик хвоста, маркером аккуратно наносят полоски (метки) достаточной толщины, чтобы при необходимости животное можно было быстро и легко идентифицировать в группе; метки наносят у основания хвоста, и (или) посередине хвоста, и (или) на конце хвоста по одной, две или три полоски. Схему маркировки заносят в протокол эксперимента напротив порядкового номера животного в эксперименте (пример протокола представлен в приложении 1 к настоящим МР).

Групповую метку наносят у основания хвоста одной полосой определенного цвета.

Индивидуальные метки наносят после групповой.

Пример индивидуальных меток в группе (нанося одним цветом):

- одна полоса у основания хвоста - животное N 1;

- две полосы у основания хвоста - животное N 2;

- одна полоса в середине хвоста - животное N 3;

- две полосы в середине хвоста - животное N 4;

- одна полоса у кончика хвоста - животное N 5.

Примеры сочетания индивидуальных и групповых меток и расшифровка:

- у основания хвоста одна красная полоса (группа "отрицательный контроль") и одна синяя полоса (животное N 1);

- у основания хвоста одна красная полоса (группа "отрицательный контроль") и две синих полосы (животное N 2);

- у основания хвоста одна черная полоса (группа "положительный контроль") и одна зеленая полоса в середине хвоста (животное N 43);

- у основания хвоста одна черная полоса (группа "положительный контроль") и две зеленых полосы в середине хвоста (животное N 44).

5.10. Введение растворов/суспензий/эмульсий объектов испытания и контролей лабораторным животным

5.10.1. Выбор способа введения зависит от предполагаемого пути поступления химического вещества в организм. Наиболее часто используют внутрижелудочное введение через зонд. Объем одновременно вводимого раствора/суспензии/эмульсии не более 1 мл/100 г м.т. животного. Например, мыши массой 20 г ввести 0,20 мл; мыши массой 21 г ввести 0,21 мл и т.д. Каждый день перед введением и перед эвтаназией в протоколе указывают массу тела животных, а также клинические признаки токсичности, если таковые имеются (пример протокола представлен в приложении 1 к настоящим МР).

5.11. Эвтаназия животных

5.11.1. Животных подвергают эвтаназии методом цервикальной дислокации через 18 - 24 часов после последнего введения.

5.12. Забор костного мозга для анализа

5.12.1. Забор костного мозга производят непосредственно после эвтаназии. Для этого необходимо:

- промаркировать микропробирки, содержащие 1 мл сыворотки;

- набрать в шприц сыворотку из пробирки (без пузырьков);

- кожу над коленным суставом задней конечности собрать в складку и надрезать ножницами;

- оттянуть под колено кожу и мышечную массу, проткнуть их ножницами вблизи сустава и разрезать, оголив бедренную кость;

- отделить заднюю конечность от тела вместе с частью тазовой кости;

- растягивая коленный сустав и осторожно выворачивая его, вычленить дистальную часть бедренной кости, оставляя костно-мозговой канал закрытым;

- вычленить бедренную кость и очистить ее от мягких тканей, используя ножницы и марлевую салфетку;

- отрезать верхний проксимальный конец бедренной кости так, чтобы стал виден просвет костно-мозгового канала;

- продвинуть иглу в просвет костно-мозгового канала с дистального конца, при этом погрузить косточку в пробирку с сывороткой (кость должна быть полностью покрыта жидкостью) затем выдавить из шприца сыворотку через канал косточки, вымывая клетки костного мозга;

- визуально оценить количество выделенного костного мозга и если, по мнению исследователя, количество выделенного костного мозга недостаточно, процедуру повторить с другой конечностью, и костный мозг из второй бедренной кости добавить в ту же пробирку;

- пробирки плотно закрыть и центрифугировать со скоростью 800 - 1000 об/мин в течение 3 минут.

5.13. Приготовление микропрепаратов костного мозга

5.13.1. Для приготовления мазков:

- разложить предметные стекла на столе;

- на шероховатой части стекла мягким карандашом нанести маркировку;

- надосадок из пробирки удалить пипеткой с наконечником на 1000 мкл, оставляя примерно 20 - 50 мкл в зависимости от объема осадка клеток, осадок осторожно ресуспендировать пипеткой с наконечником на 200 мкл, не допуская образования пузырьков;

- пипеткой каплю суспензии поместить на предметное стекло у границы шероховатого края;

- стекло для растяжки мазков поместить под углом 45° впереди капли, добиться распределения капли вдоль скошенного края и одним плавным движением, не отрывая стекла для растяжки мазков от предметного стекла и не меняя угла его наклона, распределить материал по предметному стеклу;

- просмотреть готовый мазок под инвертированным микроскопом с целью контроля качества: клетки должны лежать отдельно, не перекрываясь. В случае слишком редкого или густого мазка следует переделать микропрепарат, сконцентрировав или разбавив образец костного мозга;

- высушить мазок на воздухе в горизонтальном положении в теплом месте или на термостолике (температура плюс (36 1) °C).

- от каждого животного приготовить по 2 мазка.

5.13.2. Фиксацию, окраску и промывку мазков производить строго в вытяжном шкафу:

- приготовить фосфатный буфер из таблеток или концентрата, следуя инструкции, из расчета 600 мл на 1 штатив с 30 стеклами;

- подготовить пять емкостей со штативами для окраски стекол и заполнить их растворами для фиксации (метанол), азура, эозина и буфером для промывания (2 емкости). Уровень жидкости в емкостях должен быть такой, чтобы при погружении в них стекол мазки оказывались полностью в растворе.

- подготовить 2 стакана объемом 2 л с дистиллированной водой;

- вставить стекла в штативы для окраски;

- погрузить штатив со стеклами в первую емкость (фиксатор) на 1 - 2 секунды, достать из емкости, наклонить штатив набок, прислоняя к краю емкости и дать возможность избытку реагента стечь в емкость, повторить 5 раз, затем промокнуть излишек жидкости, поставив штатив на фильтровальную бумагу;

- погрузить штатив со стеклами во вторую емкость (раствор эозина) на 1 - 2 секунды, поступая так же, как при фиксации, повторить 3 - 4 раза, промокнуть излишек краски;

- погрузить штатив со стеклами по 1 - 2 секунде в третью емкость (раствор азура) на 1 - 2 секунды, поступая так же, как при фиксации, повторить 6 раз, промокнуть излишек краски;

- погрузить штатив со стеклами на 1 - 2 секунды в емкости с фосфатным буфером (емкости 4, 5) по 2 раза в каждую, поступая так же, как при покраске, промокнуть излишек;

- погрузить штатив со стеклами на 2 - 3 секунды по 2 раза последовательно в два стакана с дистиллированной водой, в последнем стакане вода после промывания стекол должна быть почти бесцветной;

- подсушить штатив со стеклами на фильтровальной бумаге.

5.13.3. После окраски микропрепаратов провести контроль окрашивания: выбрать 3 - 4 стекла из штатива, подсушить мягкой салфеткой с нижней стороны и просмотреть под микроскопом при увеличении х20 или (если необходимо) при увеличении х100 с масляной иммерсией (только для сухих стекол). В поле зрения не должно быть голубых разводов от краски, ПХЭ должны быть окрашены в серо-фиолетовый цвет, а нормохроматофильные эритроциты (далее - НХЭ) - в розовый. Если НХЭ имеют синеватый или желтоватый оттенок, то штатив промыть в дистиллированной воде еще раз.

Примечание: окраску можно производить готовым раствором красителей по Романовскому в соответствие с прилагаемой инструкцией по его применению.

5.14. Кодирование микропрепаратов

5.14.1. Перед проведением микроскопического анализа все микропрепараты кодируют. Сотрудникам, непосредственно выполняющим исследование микропрепаратов, не рекомендовано иметь доступ к информации о кодировании.

5.14.2. Кодирование микропрепаратов проводят следующим образом:

- установить непосредственное количество стекол, требующее кодирования;

- с помощью генератора случайных чисел в сети "Интернет" или вручную составить случайную последовательность целых чисел так, чтобы количество чисел в последовательности точно соответствовало количеству кодируемых микропрепаратов, и чтобы ни одно число в последовательности не повторялось более одного раза (было уникальным для последовательности);

- оформить электронную таблицу (пример электронной таблицы представлен в приложении 2 к настоящим МР);

- распечатать таблицу и, сверяясь с ней, подписать на каждом микропрепарате соответствующий код.

5.15. Микроскопический анализ

5.15.1. Микроскопический анализ проводят в проходящем свете под объективом х100 с масляной иммерсией.

5.15.2. Показателем качества мазка является отсутствие поврежденных клеток. Клетки лежат отдельно, ПХЭ имеют серо-фиолетовый цвет, НХЭ окрашены в красновато-розовый цвет. Анализируют хорошо расправленные, неповрежденные, отдельно лежащие клетки без наложений. Микроядра выглядят в виде телец, не преломляющих свет и гомогенно окрашенных в красно-фиолетовый цвет, размером не более "А диаметра клетки (рисунок).

Рисунок. Мазок костного мозга мыши, содержащий полихроматофильные эритроциты с микроядрами

5.15.3. Подсчет клеток удобно осуществлять с помощью счетчика форменных элементов крови. Для определения доли ПХЭ среди общего числа эритроцитов подсчитывают не менее 250 клеток (ПХЭ + НХЭ) на каждом стекле (не менее 500 клеток на каждое животное). Для оценки частоты ПХЭ с микроядрами подсчитывают не менее 2000 ПХЭ на каждом стекле (не менее 4000 ПХЭ на каждое животное). Данные заносят в протокол (пример протокола представлен в приложении 3 к настоящим МР).

5.15.4. Доля ПХЭ среди общего числа эритроцитов (ПХЭ + НХЭ) не должна быть менее 20 % от значения в отрицательном контроле.

5.16. Обработка результатов и критерии их приемлемости

5.16.1. Данные эксперимента переносят в таблицу, оформленную в соответствии с приложением 2 к настоящим МР. Декодирование микропрепаратов производят одновременно с переносом первичных данных.

5.16.2. Статистический анализ результатов исследования в микроядерном тесте проводят стандартными статистическими методами при уровне значимости = 0,05 (можно использовать любую подходящую компьютерную программу).

5.16.3. Рекомендуется проверить нормальность распределения данных, оценить однородность дисперсии, различия между полами и группами обработки, наличие зависимости эффекта от дозы объекта испытания. Например, проверку нормальности распределения данных можно проводить методом Шапиро-Уилка; проверку однородности дисперсии - методом Ливиня.

5.16.4. В случае нормального распределения и однородности дисперсии дальнейший статистический анализ проводят параметрическими методами: t-тестом для независимых выборок (для сравнения двух групп), тестом Даннетта (для трех и более групп).

5.16.5. В случае ненормального распределения прибегают к непараметрическим критериям: Манна-Уитни (для сравнения двух групп) и Краскела-Уоллиса (для трех и более групп). Для выявления зависимости доза - эффект можно использовать метод Мантеля-Хензеля.

5.16.6. Оценка приемлемости результатов испытаний проводят по следующим критериям:

- количество животных на группу не менее 5 голов;

- на приготовленных микропрепаратах костного мозга отсутствуют поврежденные ядерные клетки, эритроциты хорошо расправлены, микропрепараты равномерно окрашены, на них находится достаточное количество ПХЭ для определения частоты ПХЭ с микроядрами;

- проанализировано не менее 4000 клеток на одно животное;

- спонтанная частота ПХЭ с микроядрами в группе отрицательного контроля соответствует частоте в историческом контроле.

- доля ПХЭ от общего числа эритроцитов в группах обработки исследуемым веществом должна быть не менее 20 % от уровня в отрицательном контроле;

- частота ПХЭ с микроядрами в группе положительного контроля значимо выше, чем значения этого параметра для отрицательного контроля.

5.17. Оценка, интерпретация результатов, отчет

5.17.1. Исследуемое вещество является генотоксичным, если:

- по меньшей мере, в одной из групп обработки наблюдается статистически значимое повышение частоты ПХЭ с микроядрами по сравнению с сопутствующим отрицательным контролем;

- повышение частоты ПХЭ с микроядрами зависит от дозы (на основании подходящего теста оценки тренда);

- какой-либо из полученных результатов находится вне границ распределения исторического отрицательного контроля в лаборатории (например, выходит за 95 %-е контрольные пределы для распределения Пуассона) ².

------------------------------

²_{Примечание : Исторический отрицательный контроль в лаборатории представляет собой данные (диапазон и распределение значений частоты встречаемости полихроматофильных эритроцитов с микроядрами), полученные в микроядерном тесте при введении животным только растворителя/разбавителя в результате проведения минимум 10 экспериментов (предпочтительно 20 экспериментов) в сходных экспериментальных условиях.}

------------------------------

5.17.2. Исследуемое вещество не является генотоксичным, если:

- ни в одной из групп обработки не обнаружено статистически значимого повышения частоты ПХЭ с микроядрами по сравнению с отрицательным контролем;

- нет зависимого от дозы повышения частоты ПХЭ с микроядрами (на основании подходящего теста оценки тренда);

- все результаты находятся в пределах границ распределения исторического отрицательного контроля.

5.17.3. Повторный эксперимент проводят в модифицированных экспериментальных условиях, например, вводят дополнительные дозы (не превышающие МПД), увеличивают количество введений (с интервалами в 24 часа) в тех случаях, когда:

- имеет место статистически значимое повышение частоты полихроматофильных эритроцитов с микроядрами на одной из доз, но нет зависимости эффекта от дозы;

- выявлена зависимость эффекта от дозы, но значения при всех уровнях доз не отличаются статистически значимо от сопутствующего отрицательного контроля, или получены статистически значимые и зависимые от дозы эффекты, которые не выходят за 95 %-е контрольные пределы распределения значений в историческом отрицательном контроле;

5.17.4. Если после дополнительного исследования данные не позволяют сделать однозначный вывод, что тестируемое вещество дает положительный или отрицательный результат, то в заключении указывают, что результат теста является сомнительным.

5.17.5. Пример представления отчета о результатах эксперимента указан в приложении 4 к настоящим МР.

Библиографические ссылки

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Федеральный закон от 19.07.1997 N 109-ФЗ "О безопасном обращении с пестицидами и агрохимикатами".

3. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю), утвержденные решением Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299.

4. СанПиН 2.1.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "СанПиН 2.1.3685-21" следует читать "СанПиН 1.2.3685-21"

5. МУ 1.2.3364-16 "Оценка мутагенной активности пестицидов".

6. Р 1.2.3156-13 "Оценка токсичности и опасности химических веществ и их смесей для здоровья человека".

7. ФС.2.2.0020.18 "Вода очищенная".

8. ГОСТ 34660 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Микроядерный анализ на эритроцитах млекопитающих".

9. ГОСТ 33216 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами".

10. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, Мензурки, Колбы, Пробирки. Общие технические условия".

11. OECD Test No. 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, 2016.