Методические рекомендации МР 1.2.0264-21 "Оценка генотоксичности химических веществ в микроядерном тесте in vivo на эритроцитах костного мозга млекопитающих" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 25 октября 2021 г.)

Методические рекомендации МР 1.2.0264-21
"Оценка генотоксичности химических веществ в микроядерном тесте in vivo на эритроцитах костного мозга млекопитающих"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 25 октября 2021 г.)

ББК 51.21

О-93

ISBN 978-5-7508-2052-8

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Методические рекомендации (далее - МР) применяются для оценки генотоксичности химических веществ разных химических классов.

1.2. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научными и образовательными организациями (лабораториями), занимающимися оценкой опасности химических веществ в объектах окружающей среды.

II. Общие положения

2.1. МР содержат описание метода оценки генотоксичности химических веществ in vivo на эритроцитах костного мозга млекопитающих с применением в качестве тест-объекта мелких лабораторных грызунов и определяют порядок проведения испытаний химических веществ и их смесей (далее - объекты испытаний).

2.2. Метод может быть использован в качестве самостоятельного или в сочетании с другими методами.

III. Описание метода

3.1. Метод позволяет выявлять и количественно оценивать генотоксичность химических веществ на хромосомном уровне на основании учета индукции микроядер (далее - МЯ) в полихроматофильных эритроцитах (далее - ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Микроядра представляют собой небольшие ДНК-содержащие тельца, существующие в клетке отдельно от основного ядра или связанные с ним хроматиновым мостиком, возникновение которых связано с такими повреждениями генома, как появление ацентрических фрагментов хромосом или целых хромосом, отставших в анафазе или телофазе митоза от веретена деления и не вошедших в дочерние ядра. Доля клеток с микроядрами в общей популяции клеток является показателем индукции нарушения структуры или количества хромосом в эукариотических клетках, в частности, после воздействия исследуемого вещества. Микроядерный тест является удобным методом благодаря простоте распознавания ПХЭ и их короткому жизненному циклу. При развитии эритробласта в ПХЭ основное ядро выталкивается, а образовавшееся микроядро может оставаться в цитоплазме, поэтому в лишенном основного ядра ПХЭ легко визуализировать микроядра, возникшие спонтанно или индуцированные исследуемыми агентами. Повышение частоты ПХЭ с микроядрами у обработанных исследуемым веществом животных является показателем индуцированных хромосомных повреждений.

3.2. В качестве тест-объекта используют мелких лабораторных грызунов (мыши, крысы) обоих полов, и наиболее часто - мышей линии CD-1, в отношении которых имеется большая база исторических данных. В качестве органа-мишени используют костный мозг.

3.3. Основным показателем является частота ПХЭ с микроядрами в костном мозге животных в группах обработки химическими веществами относительно отрицательного контроля.

IV. Средства измерений, испытательное, вспомогательное оборудование и материалы ¹

------------------------------

¹_{Примечание : допускается использование средств измерений, испытательного и вспомогательного оборудования и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками.}

------------------------------

4.1. Для проведения исследований используют следующее оборудование, химическую посуду и реактивы:

- весы лабораторные высокого класса точности;

- весы для взвешивания животных;

- магнитная мешалка с подогревом;

- встряхиватель;

- фармацевтический холодильник с морозильником;

- термометр цифровой записывающий (логгер данных температуры);

- центрифуга на 12 мест для пробирок типа Эппендорф 1,5 - 2,0 мл со скоростью не менее 3000 об./мин;

- микроскоп медико-биологический;

- микроскоп инвертированный;

- счетчик форменных элементов крови;

- дозаторы пипеточные одноканальные с переменным объемом: от 20 до 200 мкл; от 100 до 1000 мкл;

- водяная баня;

- фильтрующие насадки на шприц с диаметром пор 0,22 - 0,45 мкм;

- цилиндры вместимостью 10, 25, 50 мл, второго класса точности в соответствии с ГОСТ 1770;

- пробирки лабораторные (мерные со шлифом, с притертой пробкой на 20 и 25 мл);

- зонды внутрижелудочные для мелких грызунов;

- шприцы стерильные одноразовые, 1 мл с иглами;

- стекла предметные с адгезивным электростатическим покрытием, со шлифованными краями и полосой для записи;

- стекла предметные для растяжки мазков;

- ступки фарфоровые или стеклянные с пестиками разных размеров;

- стаканы стеклянные, емкости для окрашивания стекол со штативами;

- наконечники для дозаторов на 200 мкл, 1000 мл нестерильные;

- циклофосфамид (моногидрат) [N CAS 50-18-0, N CAS 6055-19-2];

- ножницы хирургические, остроконечные короткие;

- марля или бинт;

- шприцы инсулиновые одноразовые, иглы для инъекций внутримышечные, одноразовые;

- вода очищенная по ФС.2.2.002018 "Вода очищенная";

- микропробирки объемом 1,5 мл типа Эппендорф;

- штатив для микропробирок;

- фиксатор - спирт метиловый;

- краситель азур-эозин (можно применять готовый набор для фиксации и быстрого окрашивания мазков крови);

- фосфатный буфер таблетированный или концентрат;

- эмульгатор, например, Твин-80;

- масло иммерсионное, тип В (профессиональное);

- эмбриональная сыворотка теленка, инактивированная нагреванием при плюс 56 °C на водяной бане в течение 30 мин.

V. Проведение испытаний

5.1. Условия выполнения испытаний

5.1.1. При проведении испытаний в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура воздуха от плюс 18 до плюс 25 °C;

- относительная влажность воздуха не более 80 %;

- атмосферное давление (84 - 106) кПа [(630 - 800 мм рт. ст.)].

5.2. Схема эксперимента

5.2.1. В стандартном эксперименте используют 10 групп животных (не менее 5 особей в каждой группе):

- 1 группа - отрицательный контроль, самки;

- 2 группа - отрицательный контроль, самцы;

- 3 группа - низкая доза, самки;

- 4 группа - низкая доза, самцы;

- 5 группа - средняя доза, самки;

- 6 группа - средняя доза, самцы;

- 7 группа - высокая доза, самки;

- 8 группа - высокая доза, самцы;

- 9 группа - положительный контроль, самки;

- 10 группа - положительный контроль, самцы.

5.2.2. Объекты испытания и отрицательный контроль вводят двукратно, с интервалом в 24 часа. Животным группы положительного контроля введение осуществляют однократно (во второй день эксперимента). Животных подвергают эвтаназии через 18 - 24 часа после второго введения.

5.2.3. В случае проведения микроядерного теста и оценки повреждений ДНК методом ДНК-комет in vivo одновременно на одних и тех же животных введение осуществляют 3 раза с интервалом 24 часа и животных подвергают эвтаназии через 3 - 6 часов после третьего введения.

5.3. Выбор доз для введения животным

5.3.1. В каждом исследовании используют не менее трех доз объекта испытания, которые определяют на основании данных о токсичности вещества (смеси веществ). В качестве высокой дозы использую либо 2000 мг/кг массы тела (м.т.) животных, либо (в случае высоко токсичных веществ) - максимальную переносимую дозу (далее - МПД).

5.3.2. МПД определяют в предварительном эксперименте с использованием не менее 2 групп животных каждого пола (не менее двух особей в каждой группе). В качестве максимальной дозы для проведения предварительного эксперимента используют дозу, составляющую 75 % от LD ₅₀. Последующие дозы выбирают, уменьшая предыдущую дозу в 2 - 4 раза. Если значение LD ₅₀ близко к 2000 мг/кг м.т., то в предварительном эксперименте используют только одну дозу (2000 мг/кг м.т.).

5.3.3. В основном эксперименте испытывают не менее трех доз с шагом в 2 - 4 раза при двукратном введении или при трехкратном введении (в эксперименте по одновременной оценке индукции микроядер и повреждений ДНК методом ДНК-комет). Низкая доза в эксперименте не должна вызывать видимых признаков токсичности. При наличии признаков токсичности у животных проводят дополнительное исследование с использованием меньших доз.

5.4. Способ введения объекта испытаний животным

5.4.1. Способ введения для оценки генотоксичности химических веществ выбирают с учетом преимущественного пути поступления в организм. Как правило, используют внутрижелудочное введение через зонд.

5.5. Расчет навески объекта испытания при приготовлении растворов/суспензий/эмульсий и получение необходимых доз для введения животным

5.5.1. Доза объекта испытания, вводимого лабораторным животным, не должна превышать 2000 мг/кг м.т. животного, а объем вводимого объекта испытаний не должен превышать 1 мл на 100 г м.т. животного (в случае водных растворов максимальный объем может составлять 2 мл/100 г м.т.). Например, если масса мыши равна 20,0 г, то максимально приемлемый объем составляет:

1 мл х 20 г /100 г = 0,2 мл на одно животное
(или 0,4 мл в случае водных растворов),

при этом максимальная концентрация растворов/суспензий/эмульсий не должна превышать 2000 мг х 20 г/ 1000 г = 40 мг в 0,2 мл (0,4 мл водного раствора).

Расчеты концентрации растворов/суспензий/эмульсий проводят, исходя из выбранных доз исследуемого вещества в мг/кг м.т. животного и объема вводимого раствора/суспензии/эмульсии, но, не превышая указанные выше пределы.

5.5.2. Пример расчетов для приготовления раствора/суспензии/эмульсии объекта испытания:

Если необходимо приготовить раствор/суспензию/эмульсию объекта испытания X для введения животным в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг м.т. и средняя масса животного (мыши) - 20,0 г, то для приготовления 10 мл раствора/суспензии/эмульсии в высокой концентрации (доза 2000 мг/кг м.т.) необходимо взять навеску 2000 мг вещества. Полученный исходный раствор/суспензия/эмульсия соответствует наибольшей дозе для введения животным. Далее последовательно разбавляют каждый предыдущий раствор/суспензию/эмульсию для получения необходимого количества доз.

5.6. Технология приготовления растворов/суспензий/эмульсий химических веществ для введения животным

5.6.1. Подготовку объектов испытаний проводят непосредственно в день введения животным. Растворителем или дисперсионной средой (далее - носителем) для приготовления растворов/суспензий/эмульсий вещества может быть: 0,5 - 1,0 % раствор крахмала или метилцеллюлозы, масло растительное рафинированное, вода очищенная. В каждом случае носитель выбирают в соответствии с токсикологическими и физико-химическими свойствами (гидрофобностью или гидрофильностью, растворимостью, агрегатным состоянием и т.д.) конкретного химического вещества.

5.6.2. В случае если объект испытания представляет собой водный раствор или вещество, растворимое в воде, то в качестве носителя (растворителя) используют воду очищенную. Растворы готовят методом разбавления точного объема (если объект испытания в виде водного раствора или водорастворимой жидкости) или растворения точной навески в мерной посуде (цилиндре или мерной пробирке) и доведения до метки водой.

5.6.3. В случае если объект испытаний представляет собой жидкость или твердое вещество, растворимые в растительном масле, то в качестве носителя (растворителя) используют пищевое масло растительное рафинированное (обычно подсолнечное). Растворы готовят методом разбавления точного объема или растворения точной навески в мерной посуде (цилиндре или пробирке) и доведения до метки маслом. Густые, очень вязкие и медообразные объекты испытания дозируют по массе.

5.6.4. В случае если объект испытания представляет собой нерастворимое в воде или масле твердое вещество, готовят суспензию в масле, воде или растворе крахмала:

- если вещество представляет собой очень мелкий аморфный пылевидный порошок, то измельчение не требуется;

- если вещество представляет собой кристаллический порошок или комковатую субстанцию, необходимо измельчение - в таком случае расчетное количество навески объекта испытания увеличивают примерно в 1,5 раза (чтобы учесть потери при измельчении); измельчение можно проводить с использованием ступки с пестиком или пробирки с пластиковым пестиком-гомогенизатором (для навесок до 250 мг);

- взвешивают точную навеску измельченного порошка объекта испытания в мерной емкости для приготовления суспензии (стеклянной или пластиковой);

- в мерную емкость небольшими порциями добавляют выбранный носитель (осторожно смачивая порошок и перемешивая до получения однородной пульпы (густой концентрированной суспензии)). Концентрированную суспензию постепенно разбавляют носителем и доводят до нужного объема;

- суспензию тщательно встряхивают и перемешивают до однородности, при необходимости с применением встряхивателя;

- готовят серию разбавлений полученной суспензии в соответствии с расчетами доз.

5.6.5. В случае если объектом испытаний является концентрат суспензии (например, в случае препаративной формы пестицида), то рабочие суспензии для введения животным готовят разведением с использованием подходящего носителя.

5.6.6. В случае если объект испытания представляет собой жидкость, несмешивающуюся с водой или маслом, то готовят, соответственно, эмульсию в масле, воде или 0,5 - 1,0 % крахмале:

- в тарированный стеклянный или пластиковый стакан на 50 - 60 мл отвешивают навеску объекта испытания (густой или пастообразной консистенции) или отмеряют точный объем дозатором (если жидкость близка по плотности к воде), добавляют выбранный носитель (масло растительное, 0,5 - 1,0 % крахмал в воде, вода очищенная) в объеме, примерно равном объему диспергируемой жидкости;

- тщательно перемешивают на магнитной мешалке до однородности, полученную концентрированную эмульсию разбавляют порциями носителя, каждый раз перемешивая до однородности, до объема, равного 2/3 от общего расчетного объема;

- концентрированную эмульсию переносят в мерную емкость, остатки смывают со стенок стакана несколькими порциями носителя, которые переносят в ту же емкость, объем эмульсии доводят до метки носителем;

- при необходимости, если вещество трудно подвергается диспергированию, допускается добавление 1 капли эмульгатора Твин-80.

5.7. Приготовление раствора положительного контроля

5.7.1. В качестве положительного контроля можно использовать этилметансульфонат, этилнитрозомочевину, митомицин С, циклофосфамид и триэтиленмеламин. Учитывая большое количество накопленных данных по оценке генотоксичности в разных лабораториях мира, в которых использовали циклофосфамид, именно это вещество рекомендуют в качестве положительного контроля при тестировании химических веществ и их смесей, что позволит сопоставлять результаты, полученные разными исследователями.

5.7.2. Циклофосфамид вводят в дозе 20 - 40 мг/кг м.т. животного. Навеску циклофосфамида растворяют в воде очищенной в мерной пробирке, фильтруют, пропуская через фильтрующую насадку на шприц с диаметром пор 0,22 - 0,45 мкм и разливают на аликвоты объемом 1,5 мл в пробирки типа Эппендорф. Аликвоты хранят в морозильной камере при минус 20 2 °C в течение 12 мес. Размороженный раствор подлежит использованию в течение нескольких часов, а остаток утилизируют. Повторное замораживание не допустимо.

5.8. Отрицательный контроль

5.8.1. В качестве отрицательного контроля применяют растворитель или носитель, используемый при приготовлении растворов/суспензий/эмульсий исследуемого вещества, в эквивалентном объеме.

5.9. Лабораторные животные

5.9.1. Эксперимент проводят на молодых здоровых мелких лабораторных грызунах (мышах, крысах) обоих полов. Наиболее широко используют мышей линии CD-1 (7 - 9 недельного возраста). Животных после получения из питомника содержат на карантине в течение 7 дней до начала эксперимента. Животных содержат в соответствии с ГОСТ 32216.

5.9.2. Перед началом эксперимента всех животных взвешивают и маркируют. Отклонение в массе тела животных в группах не должно превышать 20 % от средней массы для каждого пола. Животных случайным образом распределяют по группам и рассаживают в клетки. В предварительном эксперименте по выбору доз - не менее 2 животных в группе, в основном - не менее 5. Средняя масса животных в разных группах примерно равная. Каждую группу животных содержат в отдельной клетке. На клетку прикрепляют этикетку с указанием исследования, даты начала эксперимента, группы, пола, дозы исследуемого образца.

5.9.3. На определенный участок хвоста животного нетоксичным маркером наносят групповые и индивидуальные метки, представляющие собой одну или несколько цветных полосок, при этом индивидуальный номер животного закодирован цветом, сочетанием цветов, количеством и расположением полосок.

Удерживая животное за кончик хвоста, маркером аккуратно наносят полоски (метки) достаточной толщины, чтобы при необходимости животное можно было быстро и легко идентифицировать в группе; метки наносят у основания хвоста, и (или) посередине хвоста, и (или) на конце хвоста по одной, две или три полоски. Схему маркировки заносят в протокол эксперимента напротив порядкового номера животного в эксперименте (пример протокола представлен в приложении 1 к настоящим МР).

Групповую метку наносят у основания хвоста одной полосой определенного цвета.

Индивидуальные метки наносят после групповой.

Пример индивидуальных меток в группе (нанося одним цветом):

- одна полоса у основания хвоста - животное N 1;

- две полосы у основания хвоста - животное N 2;

- одна полоса в середине хвоста - животное N 3;

- две полосы в середине хвоста - животное N 4;

- одна полоса у кончика хвоста - животное N 5.

Примеры сочетания индивидуальных и групповых меток и расшифровка:

- у основания хвоста одна красная полоса (группа "отрицательный контроль") и одна синяя полоса (животное N 1);

- у основания хвоста одна красная полоса (группа "отрицательный контроль") и две синих полосы (животное N 2);

- у основания хвоста одна черная полоса (группа "положительный контроль") и одна зеленая полоса в середине хвоста (животное N 43);

- у основания хвоста одна черная полоса (группа "положительный контроль") и две зеленых полосы в середине хвоста (животное N 44).

5.10. Введение растворов/суспензий/эмульсий объектов испытания и контролей лабораторным животным

5.10.1. Выбор способа введения зависит от предполагаемого пути поступления химического вещества в организм. Наиболее часто используют внутрижелудочное введение через зонд. Объем одновременно вводимого раствора/суспензии/эмульсии не более 1 мл/100 г м.т. животного. Например, мыши массой 20 г ввести 0,20 мл; мыши массой 21 г ввести 0,21 мл и т.д. Каждый день перед введением и перед эвтаназией в протоколе указывают массу тела животных, а также клинические признаки токсичности, если таковые имеются (пример протокола представлен в приложении 1 к настоящим МР).

5.11. Эвтаназия животных

5.11.1. Животных подвергают эвтаназии методом цервикальной дислокации через 18 - 24 часов после последнего введения.

5.12. Забор костного мозга для анализа

5.12.1. Забор костного мозга производят непосредственно после эвтаназии. Для этого необходимо:

- промаркировать микропробирки, содержащие 1 мл сыворотки;

- набрать в шприц сыворотку из пробирки (без пузырьков);

- кожу над коленным суставом задней конечности собрать в складку и надрезать ножницами;

- оттянуть под колено кожу и мышечную массу, проткнуть их ножницами вблизи сустава и разрезать, оголив бедренную кость;

- отделить заднюю конечность от тела вместе с частью тазовой кости;

- растягивая коленный сустав и осторожно выворачивая его, вычленить дистальную часть бедренной кости, оставляя костно-мозговой канал закрытым;

- вычленить бедренную кость и очистить ее от мягких тканей, используя ножницы и марлевую салфетку;

- отрезать верхний проксимальный конец бедренной кости так, чтобы стал виден просвет костно-мозгового канала;

- продвинуть иглу в просвет костно-мозгового канала с дистального конца, при этом погрузить косточку в пробирку с сывороткой (кость должна быть полностью покрыта жидкостью) затем выдавить из шприца сыворотку через канал косточки, вымывая клетки костного мозга;

- визуально оценить количество выделенного костного мозга и если, по мнению исследователя, количество выделенного костного мозга недостаточно, процедуру повторить с другой конечностью, и костный мозг из второй бедренной кости добавить в ту же пробирку;

- пробирки плотно закрыть и центрифугировать со скоростью 800 - 1000 об/мин в течение 3 минут.

5.13. Приготовление микропрепаратов костного мозга

5.13.1. Для приготовления мазков:

- разложить предметные стекла на столе;

- на шероховатой части стекла мягким карандашом нанести маркировку;

- надосадок из пробирки удалить пипеткой с наконечником на 1000 мкл, оставляя примерно 20 - 50 мкл в зависимости от объема осадка клеток, осадок осторожно ресуспендировать пипеткой с наконечником на 200 мкл, не допуская образования пузырьков;

- пипеткой каплю суспензии поместить на предметное стекло у границы шероховатого края;

- стекло для растяжки мазков поместить под углом 45° впереди капли, добиться распределения капли вдоль скошенного края и одним плавным движением, не отрывая стекла для растяжки мазков от предметного стекла и не меняя угла его наклона, распределить материал по предметному стеклу;

- просмотреть готовый мазок под инвертированным микроскопом с целью контроля качества: клетки должны лежать отдельно, не перекрываясь. В случае слишком редкого или густого мазка следует переделать микропрепарат, сконцентрировав или разбавив образец костного мозга;

- высушить мазок на воздухе в горизонтальном положении в теплом месте или на термостолике (температура плюс (36 1) °C).

- от каждого животного приготовить по 2 мазка.

5.13.2. Фиксацию, окраску и промывку мазков производить строго в вытяжном шкафу:

- приготовить фосфатный буфер из таблеток или концентрата, следуя инструкции, из расчета 600 мл на 1 штатив с 30 стеклами;

- подготовить пять емкостей со штативами для окраски стекол и заполнить их растворами для фиксации (метанол), азура, эозина и буфером для промывания (2 емкости). Уровень жидкости в емкостях должен быть такой, чтобы при погружении в них стекол мазки оказывались полностью в растворе.

- подготовить 2 стакана объемом 2 л с дистиллированной водой;

- вставить стекла в штативы для окраски;

- погрузить штатив со стеклами в первую емкость (фиксатор) на 1 - 2 секунды, достать из емкости, наклонить штатив набок, прислоняя к краю емкости и дать возможность избытку реагента стечь в емкость, повторить 5 раз, затем промокнуть излишек жидкости, поставив штатив на фильтровальную бумагу;

- погрузить штатив со стеклами во вторую емкость (раствор эозина) на 1 - 2 секунды, посту