Методические рекомендации МР 4.2.0338-23 "Методы тестирования факторов вирулентности и патогенности штаммов Staphylococcus aureus" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 21 декабря 2023 г.)

4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы

Методические рекомендации МР 4.2.0338-23
"Методы тестирования факторов вирулентности и патогенности штаммов Staphylococcus aureus"
(утв. Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 21 декабря 2023 г.)

ББК 52.649.211в64

М54

ISBN 978-5-7508-2091-7

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) описывают алгоритм организации и проведения тестирования факторов вирулентности и патогенности штаммов Staphylococcus aureus (далее - S. aureus).

1.2. Настоящие МР описывают методы выявления факторов вирулентности и патогенности посредством иммуноферментного анализа (далее - ИФА), полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) с электрофоретической и гибридизационно-флуоресцентной детекцией, секвенирования в пищевых продуктах, биоматериале от больных острыми и хроническими заболеваниями и носителей, при осуществлении федерального государственного санитарно-эпидемиологического контроля (надзора) ¹, скрининговых исследований для целей гигиенического мониторинга, санитарно-эпидемиологических экспертиз и оценок, санитарно-эпидемиологических расследований вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым и другими путями передачи, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов ².

------------------------------

¹Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения"; Федеральный закон от 31.07.2020 N 248-ФЗ "О государственном контроле (надзоре) и муниципальном контроле в Российской Федерации".

²Глава II СанПиН 2.3/2.4.3590-20 "Санитарно-эпидемиологические требования к организации общественного питания населения", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 27.10.2020 N 32 (зарегистрировано Минюстом России 11.11.2020. регистрационный N 60833).

------------------------------

II. Общие положения

2.1. S. aureus - микроорганизм, способный поражать различные системы и органы человека, вызывая более 100 нозологических форм заболеваний [22].

Набор факторов вирулентности S. aureus включает как структурные компоненты клетки, так и секретируемые продукты, играющие роль в патогенезе инфекционных заболеваний [29].

Потенциал вирулентности S. aureus различается у разных штаммов вследствие наличия или отсутствия мобильных генетических элементов, содержащих гены, кодирующие детерминанты вирулентности.

В своем геноме S. aureus может кодировать большое количество факторов вирулентности:

- факторы агглютинации А и В (ClfA, ClfB);

- поверхностные белки, связанные с колонизацией, такие как фактор слипания В и поверхностные белки G и X (SasG, SasX);

- белок, связанный с формированием биопленок (Bap);

- фибронектин-связывающие белки А и В (FnBPA, FnBPB);

- коллаген связывающий белок (Cna);

- железо-регулируемые поверхностные детерминанты А и В (Isd А, Isd В);

- плазмокоагулаза (Соа);

- белок A (Spa);

- внутриклеточные адгезины оперонов ica (гены icaA, icaB, icaC и icaD);

- факторы ускользания от иммунного надзора, такие как стафилокиназа (ген sak), обладающая фибринолитической активностью, ингибитор активации комплемента, блокирующий конвертазу С3 (сериновая протеаза, КФ 3.4.21.43, часть системы комплемента организма человека) (ген scn), ингибитор хемотаксиса лейкоцитов (ген chp)",

- фенолорастворимые модулины (PSM), приводящие к дезинтеграции мембраны; энтеротоксины (SE);

- эксфолиативные токсины А и В (далее - ETA, ЕТВ); лейкоцидин Пантон-Валентайна (далее - PVL) и лейкоцидин ED (далее - LukED);

- гемолизины (, и ) и токсин синдрома токсического шока (далее - TSST-1) [23].

Благодаря такому разнообразию факторов вирулентности обеспечивается пластичность S. aureus как вида, патоген способен приспосабливаться к разнообразным воздействиям внешней среды и занимать различные экологические ниши.

2.2. Патогенность S. aureus связана также с выраженной приобретенной резистентностью данного микроорганизма к широкому спектру антибактериальных препаратов.

Штаммы S. aureus обладают высокой адаптивной способностью формировать устойчивость практически к любым антимикробным химиопрепаратам [1].

2.3. Антибиотикорезистентность формируется благодаря наличию мигрирующих генетических элементов, а также хромосомных мутаций. Мигрирующие генетические элементы формируют кластеры генов, которые обеспечивают антибиотикорезистентность, например, комплекс устойчивости к метициллину SCCmec, в состав которого входит ген mecA/C (кодирует синтез дополнительного пенициллинсвязывающего белка) или комплекс резистентности к ванкомицину vanA.

Метициллин-резистентный S. aureus (англ. Methicillin-resistant S. aureus, далее - MRSA) относится к одним из основных патогенов с множественной лекарственной устойчивостью (англ. Multiple drug resistance, MDR)[1].

Устойчивость к метициллину является маркером устойчивости ко всему классу -лактамных антибиотиков. Штаммы MRSA характеризуются формированием резистентности к -лактамным антимикробным препаратам и другим группам антимикробных химиопрепаратов. Устойчивость к антимикробным химиопрепаратам (например, к макролидам, фторхинолонам, аминогликозидам, тетрациклинам), формируется в результате приобретения экзогенного генетического материала (например, erm-генов, ответственных за устойчивость к макролидами) или мутаций в собственных генах (например, мутаций в генах топоизомераз, приводящих к устойчивости к фторхинолонам).

Летальность при бактериемиях, вызываемых MRSA, достоверно выше, чем при инфекциях, вызываемых чувствительными штаммами [10]. В течение многих лет основными антибиотиками, эффективными при инфекциях, вызываемых MRSA, были гликопептиды, в частности ванкомицин [12]. Количество штаммов со сниженной чувствительностью к ванкомицину увеличивается [19].

2.4. Штаммы S. aureus продуцируют суперантигены, действие которых приводит к развитию различных интоксикаций, таких как пищевая токсикоинфекция и синдром токсического шока.

Существует более 23 токсинов стафилококковых суперантигенов, например, TSST-1, стафилококковые энтеротоксины от стафилококкового энтеротоксина А (англ. Staphylococcal enterotoxins А, далее - SEA) до стафилококкового энтеротоксина Т (англ. Staphylococcal enterotoxins Т, SET), а также 11 стафилококковых суперантигеноподобных белков (англ. Staphylococcal Superantigen-Like, SSL), кодируемых 11 генами ssl.

Суперантигены действуют системно, обладают способностью инициировать массивную неспецифическую активацию Т-клеток, приводящую к выбросу провоспалительных цитокинов (например, интерлейкин 2 (ИЛ-2), интерферон гамма (ИФН-) и фактор некроза опухоли (ФНО), вызывая появление симптомов (высокая температура, сыпь, десквамация эпителия, рвота, зуд, диарея, гипотония) и часто могут приводить к развитию полиорганной недостаточности [16].

2.5. Пищевые инфекции S. aureus регистрируются в виде спорадических случаев, и в виде эпидемических вспышек [9, 27]. Этиологическим фактором пищевой инфекции являются стафилококковые энтеротоксины, представляющие собой экзотоксины, влияющие на желудочно-кишечный тракт. Синтезируются энтеротоксины на логарифмической фазе роста или во время перехода из экспоненциальной фазы роста в стационарную. Энтеротоксины устойчивы к воздействиям внешней среды (например, высокие и низкие температуры, высушивание, низкие значения pH) и устойчивы к протеолитическим ферментам. Энтеротоксины способны функционировать в желудочно-кишечном тракте после проглатывания [9]. Энтеротоксины активны и действуют в концентрациях от нескольких сотен нанограмм до единиц микрограмм. Для возникновения пищевой инфекции достаточно 0,1 g энтеротоксина. Большинство случаев пищевой токсикоинфекции связано с продукцией основных энтеротоксинов: А, В, С, D и Е [11].

2.6. TSST-1, вызывающий синдром токсического шока при некоторых инфекциях, вызванных S. aureus, кодируется геном токсина синдрома токсического шока (далее - tst) [13]. Ген tst вместе с sec и sell часто обнаруживается в островках патогенности S. aureus (например, англ. S. aureus Pathogenicity Islands, SaPI) [33]. TSST-1 по-разному регулирует связанные с клетками и секретируемые маркеры активации эндотелиальных клеток, что может привести к нарушению регуляции врожденных иммунных ответов во время инфекционного эндокардита, вызванного S. aureus. Штаммы S. aureus, продуцирующие TSST-1, индуцируют апоптоз и активацию каспазы-3 в иммунокомпетентных клетках, а также активируют тромбоциты крови, что вызывает развитие тромбоцитопении и снижение уровня воспалительных цитокинов in vivo.

2.7. Этиологически важной группой токсинов S. aureus являются эксфолиативные токсины, патогенетический фактор эксфолиативного дерматита (болезнь Риттера, синдром ошпаренной кожи или эпидемическая пузырчатка новорожденных). Эксфолиативный дерматит преимущественно встречается у новорожденных, но может поражать и людей старшего возраста, у которых болезнь протекает с большими осложнениями и может привести к гибели пациента. Специфическая клиническая картина эксфолиативного дерматита возникает вследствие воздействия эксфолиативных токсинов, которые разрушают десмоглеин 1 в зернистом слое эпидермиса, вызывая, таким образом, его отслоение, что приводит к образованию пузырей на коже. Пузыри лопаются при механическом воздействии, оставляя пораженные участки тела без защитных слоев эпидермиса [18]. Эксфолиативный дерматит новорожденных поражает большие части тела и повреждения часто стерильны. К настоящему времени известно 4 типа эксфолиативных токсинов, доказанную клиническую роль имеют только два из них: ЕТА и ЕТВ [2].

2.8. PVL является фактором вирулентности и секретируется примерно 5 % клинических штаммов S. aureus и до 85 % внебольничных штаммов MRSA (доля особенно высока среди штаммов, которые стали причиной пневмонии и инфекций кожи и мягких тканей). Токсин представлен белками класса S и F (LukS-PV и LukF-PV). Токсин состоит из четырех единиц каждой формы октамерных бета-баррелей, взаимодействующих с мембранами лейкоцитов, что приводит к лизису клеток. В зависимости от комбинации специфических белков S и F образуется токсин с различными лейкоцитолитическими, эритроцитолитическими и дермонекротическими свойствами, что способствует развитию некротизирующей пневмонии и инфекциям кожи и мягких тканей (фурункул, кожные абсцессы и тяжелые некротические кожные инфекции). PVL индуцирует апоптоз нейтрофилов через митохондриальный путь при более низких концентрациях, тогда как при более высоких концентрациях PVL индуцирует некроз.

Уровень летальности при пневмонии, связанной с PVL-положительными штаммами S. aureus, более высокий по сравнению с PVL-отрицательными. Гены, кодирующие PVL, не были обнаружены у штаммов, ответственных за эндокардит, медиастинит, госпитальную пневмонию, инфекции мочевыводящих путей и энтероколит, синдром токсического шока [21].

2.9. Протеазы S. aureus. Стафилококки продуцируют различные протеазы, относящиеся к трем каталитическим типам протеолитических ферментов: сериновым, цистеиновым (тиоловым) и металлопротеиназам [7]. Роль этих ферментов в патогенезе стафилококковых инфекций и иммуноопосредованных заболеваний человека фактически не изучена. Протеолитические энзимы способствуют повреждению тканей и распространению бактерий, а также инактивируют такие антимикробные факторы слизистых оболочек и кожи как антимикробные пептиды (далее - АМП), секреторные иммуноглобулины [6].

Протеазы S. aureus способны расщеплять кателицидины, так, например, ауреолизин обеспечивает инактивацию LL-37 в тканях, инфицированных стафилококками [15]. Основная функция кателицидина кожи у человека - это обеспечение врожденной иммунной защиты от бактериальных инфекций, вызванных грамположительной бактериальной микрофлорой. Цистеиновые протеиназы (стафопаины) S. aureus эффективно инактивируют тканевые цистатины, что приводит к увеличению активности тканевых катепсинов в очаге воспаления и быстрой инактивации АМП [30].

Открыты более глубокие механизмы воздействия этих ферментов на иммунную систему, в частности, на фагоцитирующие клетки иммунной системы, клеточные рецепторы и цитокины. Иммунокомпетентные клетки взаимодействуют посредством химических сигналов, состоящих из небольших белковых молекул, называемых цитокинами. Эффекты, оказываемые бактериальными ферментами на цитокины, - важный фактор в их вирулентности. Способы этого влияния могут быть реализованы в нарушении сигнальной функции цитокинов путем протеолитической модификации их молекул и (или) клеточных рецепторов к ним. Цитокины и их рецепторы являются основными молекулярными мишенями целого спектра бактериальных протеаз [31].

2.10. В организме человека значительную роль в формировании устойчивости к бактериальной инфекции играет система контактной активации свертывания крови [5]. Система контактной активации свертывания крови представляет собой одну из распознающих подсистем врожденной иммунной системы организма [20]. Открыты и функционально описаны рецепторы, активируемые протеазами (англ. protease-activated receptors, далее - PARs) - прямое звено между системой контактной активации свертывания крови и врожденным иммунитетом. Эти рецепторы экспрессируются на эпителиальных и эндотелиальных клетках, а также на лейкоцитах и тромбоцитах, активируются протеазами свертывающей системы крови, которые представляют собой медиаторы врожденного иммунного ответа. Регулируют разнообразные функции лейкоцитов, участвуют в активации провоспалительных внутриклеточных сигнальных систем. PARs рассматриваются как интегральная часть антимикробной сигнальной защитной системы организма.

2.11. Сами рецепторы гетерогенны, у человека выделяют 4 типа PARs: PAR-1, 3 и 4 активируются в физиологических условиях тромбином, а PAR-2 может быть активирован другими эндогенными сериновыми протеазами. Показана возможность активации PAR-2 нейтрофилов, эпителиальных клеток бактериальными протеазами, что приводит к формированию провоспалительного ответа, продукции ИЛ-6 в зоне воспаления. Активация PAR-1,4 рецепторов тромбоцитов бактериальными протеазами приводит к агрегации и микротромбозу в очаге инфицирования [17]. Бактериальные протеазы способны разрушать внеклеточные домены PAR-2 рецептора эукариотических клеток и инактивировать его функционально, выступая в роли антагониста этого типа рецепторов.

2.12. Бактериальные протеазы способны ускорять преждевременную апоптотическую гибель фагоцитов и инактивировать их бактерицидную активность. Механизмы этих процессов заключаются в манипуляции каскадом модуляторов, вовлеченных во внутриклеточные сигнальные метаболические пути [3]. Избирательный протеолиз антител в "шарнирной" области, в частности, ауреолизином, способствует внутриклеточному выживанию S. aureus в фагоцитах [14]. Механизм, используемый бактериями для повреждения фагоцитов, - это протеолитическая модификация специфических рецепторов на их поверхности. Открыта способность бактериальных протеаз расщеплять цитокиновые рецепторы, например, C5aR ³, а также CD ⁴14 (мембранный гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок) CD31 (молекула адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов), CD44 (интегральный клеточный гликопротеин), синдекан-1 R и рецептора урокиназа-подобного активатора плазминогена [4].

------------------------------

³Примечание: рецептор С5а компонента комплемента человека.

⁴Примечание: CD - международная номенклатура дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека (англ Cluster of Differentiation).

------------------------------

У S. aureus открыт механизм избирательного расщепления CD11b (интегрин альфа-М) на фагоцитах стафопаином (SspB) цистеиновой протеиназой, которая обеспечивает эффективное устранение и гибель фагоцитов [25], эффекты показаны в отношении избирательного расщепления поверхностных рецепторов различных субпопуляций лимфоцитов у человека [28].

2.13. Выделяют следующие протеолитические ферменты, образуемые таксоном S. aureus:

1) ауреолизин (англ. aureolysin, Aur) - металлопротеиназа;

2) сериновая протеиназа Ssp А или глутамилэндопептидаза (V8-протеаза S. aureus), а также сериновые протеазы Sp1A-F;

3) эксфолиативный токсин - ETA, ЕТВ, эксфолиативный токсин D (ETD) (относятся к сериновым протеазам);

4) стафопаин A (Scp А), стафопаин В (Ssp В) - тиоловые протеазы.

2.14. Ауреолизин (К.Ф. 3.4.24.29) - термолизин-подобная цинк-зависимая, стабилизируемая ионами Са ²⁺ эндопептидаза, относится к семейству М4 (по классификации интегрированной базы данных пептидаз и их ингибиторов, далее - MEROPS). Молекулярная масса составляет от 12,0 - 26,8 кДа, а оптимум действия pH 7,0 - 8,8. Специфическими субстратами этого фермента являются стафилококковая про-V8-протеаза (pro-SspA), а также некоторые стафилококковые адгезины (фибронектин-связывающий белок, протеин А, и ClfB, из белков плазмы человека С3 компонент комплемента и плазминоген (рис. 1). Из трех основных внеклеточных протеаз S. aureus только ауреолизин играет существенную роль во внутриклеточном выживании S. aureus внутри макрофагов [26].

2.15. К сериновым протеиназам S. aureus относится несколько ферментов, с молекулярной массой от 26 до 38 кДа. Сериновые протеазы Spl A-F S. aureus относятся к "конститутивным" ферментам, роль в вирулентности изучена недостаточно, секретируются в позднюю экспоненциальную/раннюю стационарную фазу роста культуры на питательных средах. Глутамилэндопептидаза V-8 протеаза выделяется микробной клеткой в виде профермента, который при участии ауреолизина путем протеолитической модификации конвертируется в активный фермент. Специфическими субстратами данного фермента являются гликопротеины плазмы крови человека, такие как иммуноглобулины всех классов, а также секреторный SC-пептид молекулы slgA.

2.16. К тиоловым протеиназам стафилококка относят стафопаины А, В (Scp A, Ssp В, К.Ф. 3.4.22.48), которые входят в семейство СА, С47 протеиназ (MEROPS). Молекулярная масса стафопаинов после посттрансляционной модификации белка не превышает 13,0 - 20,0 кДа, оптимальное значение pH по некоторым данным от 6,5 до 8,0, изоэлектрическая точка (pI) некоторых форм составляет 9,4. Специфические субстраты стафопаинов (SspB) представляют собой небольшие белковые молекулы, а также некоторые рецепторные белки фагоцитов крови CD31, CD11b. Избирательное расщепление молекул CD11b на нейтрофилах и моноцитах крови стафопаином (SspB) приводит к индуцированному апоптозу фагоцитов [26]. Показано участие стафопаинов (стафопаин А) в протеолизе кининогенов плазмы крови человека с образованием брадикинина и LMK-брадикинина, которые воздействую на брадикининовые рецепторы, вызывают усиление проницаемости сосудов, выход белков плазмы в ткани и снижение артериального давления. Установлено также действие стафопаинов на плазменный прохемерин, в результате протеолиза которого образуется хемерин - лиганд CMKLR1-рецепторов дендритных клеток и макрофагов, участвующий в развитии воспалительной реакции [32]. Показана способность стафопаинов активировать факторы свертывания крови - фактор XII, плазменный прокалликреин.

2.17. Бактерии S. aureus в процессе своего развития приобрели систему специализированных ферментов, в частности, протеаз, которые достаточно эффективно воздействуют на различные молекулярные и клеточно-опосредованные механизмы иммунной системы организма. Бактерии вида S. aureus, образуя целый спектр протеолитических ферментов с широкой субстратной специфичностью, способны расщеплять такие соединения, как АМП, различные классы иммуноглобулинов (sIgA, IgG) [24], являющиеся защитными факторами организма. Протеолитические ферменты стафилококков играют существенную роль в патогенезе поражений кожи, слизистых оболочек верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы [8].

Рис. 1. Схема каскада активации внеклеточных протеаз у S. aureus.

Примечание: стрелки, отмеченные знаком вопроса "?" представляют предполагаемые протеолитические этапы в каскаде активации ферментов [24];
Unidentified protease - не классифицируемые протеазы; Pro-Aur - профермент ауреолизина; ur - ауреолизин; Pro-SspA - про-V8-протеаза S. aureus, SspA-V8-протеаза S. aureus, Pro-SspB - профермент стафопаин В; SspB - стафопаин В; Pro-ScpA - профермент стафопаин A; ScpA - стафопаин А

III. Выделение чистой культуры и идентификация бактерий рода Staphylococcus spp. из биоматериала

Отбор и транспортировка биоматериала в лабораторию ⁵

------------------------------

⁵Глава XLIII СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021. регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21); приказ Минздрава России от 18.05.2021 N 464н "Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований" (зарегистрирован Минюстом России 01.06.2021, регистрационный N 63737) (далее - приказ Минздрава России от 18.05.2021 N 464н).

------------------------------

3.1. При микробиологической диагностике клинический материал отбирается из организма больного и (или) носителя. Для качественного проведения лабораторного исследования имеет значение правильное взятие материала, правильное приготовление мазков и производство бактериологического посева. Посев от каждого больного сопровождается одновременно приготовлением двух мазков из того же очага, откуда сделан посев. Качество окраски мазков зависит и от их приготовления: материал в мазках может располагаться равномерным, тонким слоем, но в то же время содержать достаточно материала для исследования.

Пробы биоматериала собираются до начала антибактериальной терапии, либо перед повторным применением препаратов, в количестве, необходимом для выполнения анализа, с предотвращением загрязнения материала представителями нормофлоры. Все собранные пробы отправляют в микробиологическую лабораторию немедленно после получения, за исключением случаев использования емкостей с транспортировочными средами, предназначенными к применению для этих целей.

Пробы, получаемые из глаза, следует сеять на питательные среды у постели больного или в процедурном кабинете, или в кабинете врача во время приема, и засеянный материал передавать в лабораторию для культивирования, выделения, идентификации и определения антибиотикочувствительности возбудителей. Отделяемое собирают стерильной стеклянной палочкой или стерильным зондом-тампоном: двумя - тремя движениями проводят по слизистой оболочке нижней переходной складки, с края век, с роговицы, с уголков век. Секрет из слезного мешка собирают стерильным зондом-тампоном после осторожного массажа. Материал, взятый палочкой и (или) зондом-тампоном, помещают в емкость с транспортировочной средой или в стерильную стеклянную пробирку с жидкой средой и доставляют в лабораторию.

Получение аспирата из очага воспаления, например, пупочной ранки и (или) абсцесса. Участок поверхности кожи над очагом воспаления обрабатывают 70 %-м этиловым спиртом, затем 1 - 2 %-м раствором йода или другим антисептиком, разрешенным к применению для этих целей в установленном порядке ⁶, удаляют избыток йода салфеткой, смоченной 70 %-м этиловым спиртом, после высыхания дезинфектанта в течение 2 мин шприцем аспирируют самую глубокую область очага, удаляют иглу, плотно закрывают шприц стерильной резиновой пробкой и передают в лабораторию.

------------------------------

⁶Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (далее - Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ); постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий" (далее - постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416); пункт 3.4 глава III МУ 3.5.1.3674-20 "Обеззараживание рук медицинских работников и кожных покровов пациентов при оказании медицинской помощи", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 14.12.2020.

------------------------------

Фекалии собирают сразу после дефекации из предварительно продезинфицированных, тщательно промытых судна или горшка. В некоторых ситуациях собирают материал у пациента стерильным ректальным зондом-тампоном или петлей из нержавеющего материала, подлежащего стерилизации. При наличии в испражнениях патологических примесей их следует включить в отбираемую пробу. В качестве емкости для сбора фекалий рекомендуется использовать стерильный одноразовый контейнер с широким горлом и завинчивающейся крышкой, содержащий ложечку-шпатель, вмонтированную в крышку контейнера.

Пробы для определения наличия в крови биологических агентов получают венопункцией периферических вен (чаще вены локтевого сгиба), артерий или из пятки у новорожденных. При остром сепсисе, менингите, остеомиелите, артрите, острых бактериальных пневмониях собирают 2 пробы из двух сосудов или двух участков кровеносного сосуда перед началом антибактериальной терапии в объеме 5 - 10 мл. Сбор проб крови для посева производят у постели больного или в процедурной соблюдая правила асептики.

Забор биоматериала из носовой полости и зева проводят стерильным тампоном до начала антибактериальной терапии или после ее окончания не ранее чем через 14 дней.

Посев биоматериала осуществляют на комплекс питательных сред, включающий помимо 5 % кровяного агара, желточно-солевой агар или маннит-солевой агар, или Стафилококкагар и др. (агар Фогеля-Джонсона, Байрд-Паркера, молочно-солевой агар). Учет результатов проводят визуально через (48 2) ч инкубации посевов при температуре (37 1) °С (приложение к настоящим МР).

Микрофлору кожи исследуют методом бактериальных отпечатков с использованием стерильных пластиковых микрочашек площадью 10 см ² с набором питательных сред: 5 %-й кровяной, желточно-солевой агары. Отпечатки забирают с различных топографических зон гладкой кожи (пораженной и интактной). Время аппликации составляет 5 с. Учет колоний проводят спустя 24 ч инкубации при температуре (37 1) °С. После инкубации на каждой микрочашке подсчитывают общее количество колоний, выделяемых с гладкой кожи с оценкой их дифференциально-диагностических признаков. При необходимости микроорганизмы идентифицируют до вида. При учете колоний используются следующие значения: скудный рост - до 10 колоний на 10 см ², умеренный рост - до 100 колоний на 10 см ² и обильный рост - более 100 колоний на 10 см ².

Микробиологическое исследование биоматериала и обнаружение бактерий рода Staphylococcus spp.

3.2. На желточно-солевом агаре, Стафилококкагаре, молочно-солевом агаре колонии стафилококков белые или светло-желтые, выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие с ровными краями, диаметром 1,5 - 4,0 мм.

На маннит-солевом агаре штаммы S. aureus ферментируют маннит и образуют желтые колонии, окруженные зоной пожелтения среды, диаметром от 1,5 до 2,0 мм. Для получения достоверных результатов посевы образцов рекомендуется производить не менее чем в трех повторах.

На среде Фогеля-Джонсона стафилококки, ферментирующие маннит, образуют черные колонии, окруженные желтой зоной; не ферментирующие маннит-черные колонии без пожелтения среды вокруг.

На агаре Байрд-Паркера рост стафилококков, с характерными особенностями: вокруг колоний наблюдаются окрашенные зоны и кольца, образующиеся в результате липолиза и протеолиза.

На кровяном агаре стафилококки образуют непрозрачные, слегка выпуклые колонии средних размеров с гладкой, блестящей, словно полированной поверхностью, четко очерченным краем, маслянистой консистенции с прозрачными зонами гемолиза вокруг гемолитических штаммов. На желточно-солевом агаре штаммы S. aureus образуют колонии с зоной помутнения вокруг них и характерным радужным венчиком по периферии (лецитовителлазная реакция). Выявляют наличие пигмента колоний, который может быть золотистым, палевым, белым, желтым, оранжевым. Из характерных типов колоний готовят мазки, окрашивают по Граму. В мазках, окрашенных по Граму, стафилококки располагаются по одиночке, парами или в виде скоплений (гроздей) неправильной формы. Размеры микробных клеток у стафилококков (диаметр) 0,5 - 1,5 мкм. Проводят идентификацию выделенных чистых культур, проверяют морфологические и тинкториальные свойства, плазмокоагулазную активность и другие дифференцирующие тесты.

Определение ферментативных свойств штаммов бактерий рода Staphylococcus spp.

3.3. Для идентификации используют тест на каталазу. Стафилококки, имеющие фермент каталазу, способны расщеплять перекись водорода, образуя воду и газообразный кислород.

3.4. Определение ферментации глюкозы. Полужидкие среды (0,3 % агар), содержащие 1 % глюкозы являются готовой средой с индикатором ВР или среда Хью-Лейфсона с индикатором бромтимоловым синим. Если какой-либо штамм дал отрицательный результат на среде с индикатором ВР, его следует повторно исследовать на среде Хью-Лейфсона. Суточную агаровую культуру исследуемого штамма с помощью бактериологической петли сеют в столбик среды уколом до дна пробирки, а затем на поверхность агара наливают 1,5 мл стерильного вазелинового масла для создания анаэробных условий. Посев инкубируют при температуре 37 °C в течение 5 суток, ежедневно регистрируя результаты. Реакция считается положительной, если происходит желтое окрашивание столбика среды, занимающее не менее 2/3 его высоты. Длительные сроки учета реакции представляют известные неудобства, поэтому на практике дальнейшую идентификацию стафилококков проводят, обычно не дожидаясь результатов анаэробной ферментации глюкозы. В этой связи результаты указанного теста дополняют результаты других тестов, полученных на следующих этапах идентификации. При ферментации глюкозы в анаэробных условиях образуется молочная кислота, в связи с чем среда закисляется и pH ее снижается. Закисление среды выявляется по изменению окраски индикатора, добавленного в среду.

3.5. Определение плазмокоагулазной активности. Плазмокоагулазу выявляют путем внесения выделенной культуры в пробирку с цитратной плазмой кролика. Перед употреблением в ампулу с сухой цитратной кроличьей плазмой добавляют 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и после полного растворения ее разводят этим же раствором до соотношения 1:5 и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл. Полную петлю культуры стафилококков эмульгируют в пробирке с плазмой и помещают в термостат на 3 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 18 - 20 ч. Предварительный учет свертывания плазмы проводят через 3 ч, окончательный на второй день. Если культура обладает только плазмокоагулазой или только лецитовителлазной активностью, для окончательного установления вида стафилококка определяются дополнительные критерии:

- ферментация маннита в анаэробных условиях;

- дезоксирибонуклеазная активность;

- продукция фосфатазы;

- чувствительность к новобиоцину.

3.6. Определение ферментации маннита. Ферментацию маннита в анаэробных условиях можно определять, используя среду Хью-Лейфсона с индикатором бромтимоловым синим, где в качестве субстрата применяют 1 %-й раствор маннита. Суточную агаровую культуру исследуемого штамма с помощью бактериологической петли сеют в столбик среды уколом до дна пробирки, а затем на поверхность агара наливают 1,5 мл стерильного вазелинового масла для создания анаэробных условий. Посев инкубируют при температуре (37 1) °C в течение 5 суток, ежедневно регистрируя результаты. Реакция считается положительной, если происходит желтое окрашивание столбика среды, занимающее не менее 2/3 его высоты. Эта проба положительна у 94 - 96 % штаммов S. aureus.

3.7. Определение окисления маннита. Для постановки опыта рекомендуется плотная (1,8 % агара) среда с индикатором ВР и среда Хью-Лейфсона, содержащие 1 % маннита. Среду разливают в чашки Петри. Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов сеют на среду бляшками (не более 16 штаммов на одну чашку). Посевы инкубируют при температуре 37 °C, результаты регистрируют через 1 сутки. Появление желтого окрашивания вокруг макроколонии свидетельствует о положительной реакции. При окислении маннита в аэробных условиях, образуется уксусная кислота, которая закисляет среду, что выявляется с помощью индикатора.

3.8. Определение дезоксирибонуклеазной активности. Определение проводят на пептонном агаре, содержащем дезоксирибонуклеиновую кислоту (далее - ДНК) (2 мг на 1 мл среды). Перед использованием агар расплавляют, добавляют хлористый кальций (0,8 мг на 1 мл). После инкубации посевов в течение 18 - 20 ч их заливают 5 мл 1 н HCl. Через 10 мин кислоту сливают и проводят учет результатов. HCl, реагируя с ДНК, образует непрозрачный белый преципитат. Если культура продуцирует ДНК-азу, последняя деполимеризует ДНК и при добавлении HCl вокруг полосок культур возникает прозрачная зона, что свидетельствует о наличии фермента ДНК-азы.

3.9. Определение устойчивости к новобиоцину.

Устойчивость к новобиоцину определяют посевом культуры на мясопептонный агар или другой неселективный питательный агар с новобиоцином (1,6 мкг/мл). Бактерии вида S. aureus чувствительны к этому антибиотику, а относящиеся к виду Staphylococcus saprophyticus - устойчивы.

Идентификация штаммов микроорганизмов до вида возможна с применением указанных рутинных методик, а также для определения биохимических свойств стафилококков возможно использование коммерческих тест-систем, зарегистрированных в Российской Федерации.

Идентификация S. aureus с использованием высокопроизводительной времяпролетной MALDI-TOF масс-спектрометрии

3.10. Работы с микроорганизмами проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁷. Используют свежевыращенные культуры микроорганизмов, культивирование которых проводили на плотных питательных средах при температуре (37 1) °C в течение 18 - 24 ч. Пробоподготовка и идентификация S. aureus проводится в соответствии с инструкциями производителей. Отклонение от инструкции может повлечь технические сбои в работе прибора, получение ложного результата, а также возможный отказ от дальнейшего технического обслуживания.

------------------------------

⁷Пункты 134, 135 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Рекомендуемый пример инструкции для проведения пробоподготовки бактерий: готовятся реактивы (70 % этиловый спирт, 80 % трифторуксусная кислота, 70 % водный раствор муравьиной кислоты, свежий раствор матрицы (-циано-4-гидроксикоричная кислота); проводится калибровка прибора в соответствии с инструкцией.

Для идентификации путем прямого белкового профилирования возможно применение расширенного метода прямого нанесения с муравьиной кислотой, для чего из изолированной колонии свежей культуры иглой или одноразовой микробиологической петлей наносят биомассу равномерным тонким слоем в лунку мишени, после высыхания на биомассу наносят 1 мкл 70 % муравьиной кислоты, после высыхания наносят 1 мкл раствора матрицы.

Возможно использование метода экстракции белков с применением муравьиной кислоты и трифторуксусной кислоты, для этого одну колонию микроорганизма переносят в пробирку типа "Эппендорф" с 300 мкл воды и встряхивают на вортексе в течение 1 мин, добавляют 900 мкл 96 % этанола и встряхивают в течение 1 мин, центрифугируют в течение 2 мин при скорости вращения 11000 х g, супернатант удаляют, осадок высушивают на воздухе; суспендируют в 20 - 80 мкл 70 %-го водного раствора муравьиной кислоты, затем добавляют эквивалентный объем 100 % ацетонитрила, 1 мкл полученного супернатанта наносят на металлическую мишень масс-спектрометра и высушивают при комнатной температуре; на поверхность высушенного супернатанта наносят 1 мкл раствора матрицы (раствор -циано-4-гидроксикоричной кислоты в водном растворе 50 % ацетонитрила и 2,5 % трифторуксусной кислоты) и высушивают при комнатной температуре (приложение к настоящим МР). Идентификация основывается на биоинформационном анализе полученных спектров белков с референсными спектрами базы данных. Для каждой исследуемой единицы (колония, штамм) используют 5 лунок для получения достоверного результата.

Работа с чистой культурой S. aureus
Приготовление супернатантов 12-часовой чистой культуры штаммов бактерий S. aureus

3.11. Выделенную чистую культуру засевают на мясопептонный агар или другой неселективный питательный агар и культивируют в аэробных условиях при температуре (37 1) °C в течение 12 ч. Одну колонию чистой исследуемой культуры S. aureus переносят бактериологической петлей с мясопептонного агара или другого неселективного питательного агара в 100 мл жидкой питательной среды 199 с солями Хенкса с глутатионом (далее - жидкая питательная среда 199) и культивируют в среде до оптической плотности (OD ₆₀₀) равной (1,0 0,07) в аэробных условиях при температуре (37 1) °C в течение 2 ч. Забирают стерильной пипеткой (возможно применение одноразовых пластиковых пипеток) 1,0 мл стандартной жидкой питательной среды N 199 с культурой и вносят ее в стерильный 1,0 % пептоный бульон. Культивируют 1,0 % пептоный бульон с засеянной культурой в аэробных условиях в течение 12 ч при температуре (37 1) °C (приложение к настоящим МР). После культивирования бактериальные клетки отделяют от жидкой среды центрифугированием при температуре 4 °C в течение 15 мин при 10000 g. Супернатант используют для тестирования протеолитических свойств и определения энтеротоксинов.

Фенотипическое определение антибиотикочувствительности штаммов S. aureus

3.12. Резистентность S. aureus к бензилпенициллину (продукция бета-лактамаз) и цефокситину (наличие дополнительного пенициллинсвязывающего белка ПСБ2а) определяется диско-диффузионным методом (далее - ДДМ) ⁸. Изоляты S. aureus, резистентные к бензилпенициллину, но чувствительные к цефокситину, являются чувствительными к ингибиторозащищенным бета-лактамам, изоксазолилпенициллинам (оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин и флуклоксациллин), нафциллину, карбапенемам. Изоляты S. aureus, резистентные к цефокситину, являются резистентными ко всем бета-лактамным антимикробным химиопрепаратам и относятся к MRSA. Более точным методом определения принадлежности к MRSА является выявление гена mecA методом ПЦР.

------------------------------

⁸МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 04.03.2004; Рекомендации "Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам".

------------------------------

3.13. Для выявления резистентности к фторхинолонам в качестве метода скрининга можно использовать ДДМ с норфлоксацином. Изоляты, чувствительные к норфлоксацину, также оцениваются как чувствительные к моксифлоксацину и (чувствительные при увеличенной экспозиции) к ципрофлоксацину и левофлоксацину. Для изолятов, нечувствительных к норфлоксацину, следует определять чувствительность к каждому препарату, между препаратами нет полной перекрестной резистентности.

3.14. Для скрининга резистентности к амикацину используют определение чувствительности к канамицину.

3.15. Эритромицин может быть использован в ДДМ для определения чувствительности к азитромицину, кларитромицину и рокситромицину. При выявлении нечувствительных изолятов ДДМ подтвердить результат одним из методов определения минимально-подавляющей концентрации (далее - МПК).

3.16. Чувствительные в ДДМ к тетрациклину изоляты являются также чувствительными к доксициклину и миноциклину. Некоторые изоляты, резистентные к тетрациклину, могут быть чувствительными к миноциклину и (или) доксициклину. При необходимости определения чувствительности к доксициклину у тетрациклин-резистентных изолятов следует использовать один из методов определения МПК.

3.17. Чувствительность S. aureus к фосфомицину, хлорамфениколу, фузидиевой кислоте, рифампицину, триметоприм/сульфаметаксазолу можно выявлять ДДМ. Референтный метод определения чувствительности к фосфомицину - метод разведений в агаре, среда для определения МПК может содержать глюкозо-6-фосфат (в конечной концентрации 25 мг/л). Использование коммерческих систем осуществляется в соответствии с инструкцией производителя.

3.18. При определении чувствительности к гликопептидам (МПК) рекомендуется использовать метод микроразведений в бульоне ⁹. При МПК ванкомицина более 2 мг/л штамм относится к резистентным. Для определения МПК среда может Использование коммерческих систем осуществляется в соответствии с инструкцией производителя. Изоляты S. aureus, чувствительные к ванкомицину, оцениваются, как чувствительные к далбаванцину, оритаванцину, телаванцину.

------------------------------

⁹ГОСТ Р ИСО 20776-1 "Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод микроразведений в бульоне для лабораторного исследования активности антимикробных агентов по отношению к быстрорастущим аэробным бактериям, вызывающим инфекционные заболевания", введенный приказом Госстандарта от 10.11.2022 N 1266-ст.

------------------------------

3.19. Оксазолидиноны являются препаратами резерва для лечения инфекций, вызванных MRSA. Изоляты, чувствительные к линезолиду в ДДМ, оцениваются как чувствительные к тедизолиду.

3.20. Для определения МПК даптомицина методом микроразведений в бульоне среда может содержать Са ²⁺ (в конечной концентрации 50 мг/л). Использование коммерческих систем осуществляется в соответствии с инструкцией производителя. Нечувствительные изоляты встречаются редко или еще не обнаружены. Во всех случаях выявления таких изолятов рекомендуется повторить идентификацию и определение чувствительности и отправить изолят в референтную лабораторию.

Определение стафилококковых энтеротоксинов А, В, С, D, Е с помощью серологических реакций (ИФА)

3.21. Метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, C1, С2, С3, D, Е (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах, в птице и птицепродуктах), клинических материалах от больных на основе ИФА.

3.22. Отбор проб для анализа проводится в соответствии с законодательством Российской Федерации ¹⁰, а также методическими документами ¹¹.

------------------------------

¹⁰Пункты 134, 135 главы IV СанПиН 3.3686-21; Приказ Минздрава России от 18.05.2021 N 464н.

¹¹МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", утвержденные Первым заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России, заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 29.10.1996; МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23.12.2005, ГОСТ ISO/TS 17728 "Микробиология пищевой цепи. Методы отбора проб пищевой продукции и кормов для микробиологического анализа", введенный приказом Госстандарта от 27.10.2017 N 1541-ст.

------------------------------

3.23. Оборудование, используемое при отборе образцов, чистым, а при необходимости стерильным способом (в зависимости от цели анализа) (приложение к настоящим МР). Отбор проб крупной продукции рекомендуется проводить на предприятии. Не рекомендуется помещать в один транспортный контейнер пробы, температура которых различна (горячие пробы, пробы с комнатной температурой, охлажденные и замороженные пробы). Порцию продукции отбирают подходящим инструментом и помещают в мешок или ящик (если продукция твердая) либо во флакон (если продукция жидкая), после чего контейнер плотно закрывают во избежание утечки содержимого и маркируют. Помещают контейнер в сумку-холодильник, в холодильник или в бокс с термоизоляцией в соответствии с характеристиками пробы. Пробы надлежащим образом упаковывают, маркируют, составляют акт отбора проб и транспортируют в лабораторию. Отобранные пробы перед исследованием тщательно перемешивают, при необходимости нейтрализуют.

3.24. При проверке наличия стафилококковых энтеротоксинов методом ИФА в приготовленных макаронных изделиях, рисе, мясе, мороженом, полуфабрикатах и других продуктах с содержанием жира менее 40 %, измельчить 10 - 25 г образца и гомогенизировать с 1,5 мл буфера PBS (pH 7,4) на 1 г образца (например, к 10 г образца добавить 15 мл буфера), далее встряхивать в течение 15 мин, центрифугировать 10 мин (3500 g, при температуре (10 1) °C или охладить продукт заранее), при необходимости удалить верхний жировой слой. Для проведения анализа используют 100 мкл полученного супернатанта на лунку.

3.25. В случае выделения микроорганизмов, перед посевом готовят десятикратные разведения продукта в стерильных растворах разбавленного фосфатного буфера, изотонического раствора натрия хлорида, пептонной воды или лимоннокислого натрия (для сыра). Для чего отбирают стерильной пипеткой 10,0 см ³ продукта и вносят в 90,0 см ³ одного из стерильных растворов, используемых для приготовления разведений, взбалтывают в течение (4 1) мин. круговыми движениями до возможно более полного растворения. Для приготовления разведения готовят все необходимые стерильные материалы и посуду в соответствии со спецификой анализа исследуемого продукта. Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку. Время от момента приготовления разведений до посева не может превышать 20 - 30 мин. Посев осуществляют на комплекс питательных сред в зависимости от исследуемой пробы.

3.26. При работе с чистой культурой микроорганизмов используют свежевыращенные культуры, культивирование которых проводили при температуре (37 1) °C в течение 18 - 24 ч на плотных питательных средах. Одну колонию чистой исследуемой культуры S. aureus переносят бактериологической петлей с мясопептонного агара или другого неселективного питательного агара в 100 мл стандартной жидкой питательной среды N 199 и культивируют в среде до оптической плотности (OD ₆₀₀) равной 1,0 0,07 в аэробных условиях при температуре (37 1) °C в течение 2 ч. Забирают стерильной пипеткой 1,0 мл стандартной жидкой питательной среды N 199 с культурой и вносят ее в стерильный 1,0 % пептоный бульон. Культивируют 1,0 % пептоный бульон с засеянной культурой в аэробных условиях в течение 12 ч при температуре (37 1) °C. После культивирования бактериальные клетки отделяют от жидкой среды центрифугированием при температуре (4 1) °C в течение 15 мин при 10000 g (приложение к настоящим МР). Супернатант используют для определения энтеротоксинов.

Подготовка реагентов для проведения реакции

3.27. Перед использованием набора температура всех реагентов доводится до комнатной, сразу после использования все реагенты охлаждаются до температуры (4 1) °C. В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета. Воспроизводимость результатов ИФА существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. На всех стадиях инкубации следует избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации рекомендуется прикрыть планшет крышкой.

3.28. Приготовление моющего буфера. Для приготовления моющего буфера смешивают 1 часть концентрированного моющего буфера и 9 частей дистиллированной воды (например, 10 мл концентрата и 90 мл дистиллированной воды). Если во флаконе с концентрированным буфером образовались кристаллы, следует предварительно их растворить, нагревая флакон в водяной бане при температуре (37 1) °C. Срок хранения готового моющего буфера при температуре (4 1) °C составляет не более четырех недель. Температура моющего буфера перед его использованием доводится до комнатной.

3.29. Подготовка планшета. Фольгированная упаковка планшета открывается со стороны застежки. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре (4 1) °C.

3.30. Положительный контроль. В качестве положительного контроля используют смесь энтеротоксинов А, В, С, D, Е (концентрация каждого энтеротоксина составляет 2 нг/мл), раствор входит в комплект набора в готовом к использованию виде.

Проведение анализа

3.31. Вставить в рамку планшета стрипы с адсорбированными антителами в количестве, соответствующем числу проб, подготовленных для анализа. Добавить по 100 мкл исследуемого раствора в лунки A-G соответствующего стрипа, в лунку Н добавить 100 мкл положительного контроля, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее производят трехкратную отмывку лунок готовым моющим буфером, каждый раз используя объем буфера по 250 мкл, лунки планшета осушают. Добавить в каждую лунку по 100 мкл конъюгата, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре.

3.32. После инкубации повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще три раза (см. п. 3.31).

3.33. Добавить по 50 мкл субстрата и хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.

3.34. Добавить в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. В течение 30 мин после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм (в качестве нулевого считывания использовать показатели оптической плотности, измеренной в пустой лунке планшета).

Обработка результатов измерения

3.35. Определение пороговой величины. Для каждой пробы отдельно вычисляется среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках F и G (отрицательный контроль). Для того, чтобы получить пороговую величину, к этому среднему значению следует добавить 0,15, пример в (табл. 1).

Таблица 1

Вычисление среднего значения оптической плотности

Пример:

Отрицательный контроль 1 = 0,08 Отрицательный контроль 2 = 0,10 Среднее значение = 0,09 Пороговая величина = 0,09 + 0,15 = 0,24

Область достоверности (контроль качества анализа стафилококковых энтеротоксинов):

1) оптическая плотность, измеренная в лунках с положительным контролем, может быть равна или больше 0,5;

2) средняя оптическая плотность, измеренная в лунках F и G (отрицательный контроль) может быть равна или меньше 0,3;

3) если условия 1 и 2 не соблюдаются, результаты не подлежат интерпретации.

Интерпретация результатов

3.36. Результат интерпретируется как отрицательный, если величина оптической плотности ниже пороговой. Результат интерпретируется как положительный, если величина оптической плотности выше пороговой или равна ей.

IV. Тестирование протеолитической активности штаммов Staphylococcus aureus методом иммуноферментного анализа

Приготовление планшета для калибровки концентрации с сорбированным IgG или IgA

4.1. Растворяют IgA или IgG человека в 0,05 М натрий-фосфатном буфере или фосфатно-солевом буфере (далее - ФСБ), pH 7,4 до концентрации 80 мкг/мл в стеклянных пробирках, вносят в лунки высокосорбционного 96 луночного плоскодонного планшета, содержащих по 25 мкл ФСБ, и после этого производят серию из 10 двух кратных разведений (табл. 1). В последние 2 лунки ряда вносят только 50,0 мкл ФСБ, таким образом получают серию лунок с разведением IgA или IgG (субстрата), сорбированного к полистиролу (табл. 2).

Таблица 2

Схема внесения субстрата

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	25 мкл ФСБ	50 мкл ФСБ	50 мкл ФСБ
1 мкг	0,5 мкг	0,25 мкг	0,13 мкг	0,07 мкг	0,035 мкг	0,015 мкг	0,005 мкг	0,25 x 10 -2 мкл	0,1 х 10 -3 мкл	-	-

4.2. Планшет закрывают пленкой и оставляют на 12 ч при температуре (4 1) °C. После инкубации лунки планшета три раза отмывают 0,15 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,05 % твин-20, заливая по 100,0 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. Готовый калибровочный планшет сохраняют при температуре (4 1) °C в течение 3 месяцев в рефрижераторе в закрытом виде с влагопоглотителем.

Приготовление субстратного планшета (СПЛ IgA/IgG)

4.3. Растворяют IgA или IgG в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,4 ФСБ до концентрации 20 мкг/мл в стеклянных пробирках и вносят по 50 мкл в лунки высоко-сорбционного 96-луночного плоскодонного планшета (Микролон). Планшет содержит 1 мкг IgA или IgG.

Проведение реакции протеолиза

4.4. В лунки субстратного планшета (СПЛ-IgA/IgG) вносят по 100 мкл 0,05 М Трис-HCl буферного раствора, pH 8,0. В одну из лунок планшета вносят 100,0 мкл супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма S. aureus в том же буфере. Далее производят от 2 до 5 двукратных разведений супернатанта, используя несколько следующих лунок. После инкубации в термостате в течение 60 мин при температуре 25 °C, трех отмывок 0,15 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,05 % твин-20, лунки планшета осушают.

Постановка иммуноферментного анализа

4.5. В каждую лунку калибровочного планшета (КПЛ-lgA/IgG) и субстратного планшета (СПЛ-IgA/IgG), в котором проводилась реакция протеолиза, вносят по 100 мкл конъюгата (англ. anti-Human IgA peroxidase, белок A S. aureus с пероксидазой), предварительно разведенного в зависимости от рекомендаций производителя 0,15 М натрий фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,05 % твин-20, например, 1:20000 - 1:30000.

4.6. Инкубируют в термостате в течение 45 мин при температуре (37 1) °C, затем проводят отмывку 0,15 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,05 % твин-20.

4.7. В каждую лунку вносят по 100,0 мкл субстратного раствора 5 мг 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин гидрохлорида (далее - ТМБ) в 0,1 М натрий-цитратном буфере, pH 9,0, и 8 мкл 0,03 % перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50,0 мкл 25 % раствора H ₂SO ₄. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм.

Построение калибровочной кривой

4.8. Протеиназную активность рассчитывают по калибровочной кривой (рис. 2), построенной после проведения ИФА в лунках калибровочного планшета (КПЛ-lgA/IgG). По оси абсцисс откладывается содержание субстрата (в нанограммах) в соответствующих лунках, по оси ординат - значение их оптической плотности при 492 нм при постановке иммуноферментной реакции с заданным разведением конъюгата.

Рис. 2. Построенный калибровочный график: (по оси абсцисс содержание субстрата IgG или IgA в нг, по оси ординат ОП ₄₉₂ нм)

Расчет протеолитической активности

4.9. Расчет протеолитической активности осуществляют по формуле (1):

,

(1)

где:

А - активность супернатанта 12-часовой бульонной культуры в удельных единицах активности (далее - У.Е.);

C _k - содержание иммуноглобулина в лунках калибровочного планшета (1000 нг);

С _о - концентрация иммуноглобулина в лунках субстратного планшета (СПЛ-IgA/IgG), куда вносились исследуемый образец с минимальным значением оптической плотности, рассчитывается по калибровочной кривой (рис. 2);

t - время инкубации, 60 мин;

m - разведение супернатанта в лунке с минимальной оптической плотностью;

C _f - концентрация белка в 1 мл супернатанта (по методу Бредфорд), г.

4.10. Например, для расчета удельной активности супернатанта 12-часовой бульонной культуры штамма S. aureus АТСС25923 получены значения, представленные в табл. 3.

Таблица 3

Значения удельной активности супернатанта 12-часовой бульонной культуры штамма S. aureus АТСС25923

C k	С о	Т	m	C f
1	0,135	60	6	0,02 г

Используя формулу (1) и данные табл. 3, рассчитывается удельная активность в У.Е. 1 мл супернатанта 12-часовой бульонной культуры исследуемого штамма S. aureus АТСС25923, которая составила 4,35 мкг IgA/за 1 мин на г белка. В качестве субстрата используют иммуноглобулин А человека.

Интерпретация полученных результатов

4.11. При сравнении штаммов по удельной протеолитической активности по показателю в У.Е. учитывают, что чем выше удельная протеолитическая активность штамма, тем более выражены у данного штамма свойства, которые обеспечивают ему способность нейтрализовать защитные факторы организма человека - белки иммуноглобулины и АМП. К штаммам S. aureus с минимальной протеолитической активностью относят культуры с удельной протеолитической активностью в У.Е. 0,1 мкг IgG (IgA)/3a 1 мин на г белка.

V. Тестирование дик штаммов Staphylococcus aureus на наличие генов вирулентности методом полимеразной цепной реакции и верификация результатов с помощью секвенирования полученных ампликонов

Экспресс выделение геномной ДНК методом термического лизиса

5.1. Для получения клеточной суспензии, 2 - 3 колонии S. aureus, выросших на полноценной питательной среде (например, 5 % кровяной агар), ресуспендируют в объеме 100 мкл деионизованной воды. Полученную суспензию прогревают при температуре 95 °C в течение 30 мин, после чего замораживают при температуре минус 18 °C. Затем полученный лизат размораживают при комнатной температуре, центрифугируют при 10000 g, отбирают в стерильные микропробирки супернатант, который в последующем используется в качестве матрицы для проведения ПЦР. Выделенную ДНК хранят при температуре минус 18 °C.

Все процедуры по молекулярно-биологическому анализу культуры S. aureus выполняются в соответствии с методическими документами ¹².

------------------------------

¹²МУК 4.2.2872-11 "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору" в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 15.06.2011.

------------------------------

Амплификация ДНК

5.2. Определение генов вирулентности проводят с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров (табл. 4). Амплификацию ДНК проводят в 25 мкл реакционной смеси, содержащей: 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера; 150 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ); 0,5 мкМ соответствующего прямого и обратного олигонуклеотидного праймера, 1 ед. Taq-полимеразы и 2 мкл (50 нг) матрицы, исследуемой геномной ДНК, выделенной методом термического лизиса. Наряду с геномной ДНК исследуемых образцов обязательно используют геномную ДНК референсных штаммов S. aureus в качестве положительного и отрицательного контроля ПЦР из коллекций штаммов S. aureus ¹³. Выбор референсных штаммов aureus определяется наличием соответствующих генов факторов вирулентности в их геномах.

------------------------------

¹³ Официальный сайт Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (далее - ГКПМ-Оболенск): www.obolensk.org/science/state-coll-microorg (в свободном доступе).

------------------------------

Реакцию ПЦР проводят при следующих условиях: предварительная денатурация при температуре (95 1) °C в течение 3 мин с последующими 0 циклами амплификации (30 с денатурации при температуре (95 1) °C, 30 с отжига праймеров при температуре, указанной в табл. 4, 40 с элонгации (удлинения) при температуре (72 1) °C) и завершающей элонгацией при температуре (72 1) °C в течение 10 мин. Визуализацию результатов осуществляют с помощью гель-электрофореза в 1 % растворе агарозы.

Таблица 4

Праймеры для детекции генов токсинов S. aureus

Целевой ген	Название праймера	t отжига, °C	Олигонуклеотидная последовательность (5' 3')	Размер ПЦР-продукта, п.н.
Ген нуклеазы	nucSa-F	56	5'-gcgattgatggtgatacggtt-3'	279
	nucSa-R		5'-agccaagccttgacgaactaaagc-3'
Вариабельный участок гена коагулазы	coa-F	57	5'-atagagatgctggtacagg-3'	вариабельный
	coa-R		5'-gcttccgattgttcgatgc-3'
Гены лейкоцидина Пантон-Валентайна	luk-PV-F	58	5'-atcattaggtaaaatgtctggacatgatcca-3'	433
	luk-PV-R		5'-gcatcaagtgtattggatagcaaaagc-3'
Гены лейкоцидина LukED	lukED-F	56	5'-cagatgtgaagggtagtgga-3'	833

	lukED-R		5'-tcattatcagatgttgctgttg-3'
Ген гемолизина А	hla-F	56	5'-gaagtctggtgaaaaccctga-3'	704
	hla-R		5'-tgaatcctgtcgctaatgcc-3'
Ген гемолизина В	hlb-F	56	5'-caatagtgccaaagccgaat-3'	496
	hlb-R		5'-tccagcaccacaacgagaat-3'
Ген токсина синдрома токсического шока	tst-F	56	5'-acccctgttcccttatcatc-3'	326
	tst-R		5'-ttttcagtatttgtaacgcc-3'
Ген энтеротоксина А	sea-F	57	5'-ggttatcaatgtgcgggtgg-3'	102
	sea-R		5'-cggcacttttttctcttcgg-3'
Ген энтеротоксина В	seb-F	57	5'-gtatggtggtgtaactgagc-3'	164
	seb-R		5'-ccaaatagtgacgagttagg-3'
Ген энтеротоксина С	sec-F	58	5'-agatgaagtagttgatgtgtat-3'	451
	sec-R		5'-cacacttttagaatcaaccg-3'
Ген энтеротоксина D	sed-F	57	5'-ctagtttggtaatatctcct-3'	318
	sed-R		5'-taatgctatatcttataggg-3'
Ген энтеротоксина Е	see-F	57	5'-tagataaagttaaaacaagc-3'	169
	see-R		5'-taacttaccgtggacccttc-3'
Ген энтеротоксин-подобного белка О	seo-F	58	5'-agtttgtgtaagaagtcaagtgtaga-3'	180
	seo-R		5'-atctttaaattcagcagatattccatctaac-3'
Ген эксфолиативного токсина А	eta-F	58	5'-actgtaggagctagtgcatttgt-3'	189
	eta-R		5'-tggatacttttgtctatctttttcatcaac-3'
Ген эксфолиативного токсина В	etb-F	58	5'-cagataaagagctttatacacacattac-3'	610
	etb-R		5'-agtgaacttatctttctattgaaaaacactc-3'
Пенициллин-связывающий белок ПСБ2а	mec-F	56	5'-actgctatccaccctcaaac-3'	163
	mec-R		5'-ctggtgaagttgtaatctgg-3'

Проведение электрофореза в агарозном геле

5.3. Анализ продуктов амплификации проводят в 1 % агарозном геле. Для приготовления агарозы и для проведения электрофореза используют трис-боратный буфер (ТВЕ, двадцатикратный буфер содержит 216 г основного трис(гидроксиметил)аминометана (далее - Трис), 108 г борной кислоты, 80 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (далее - ЭДТА), pH 8,0 на 1 л дистиллированной воды). Электрофорез проводят в горизонтальной электрофорезной камере с добавлением красителя бромфенолового синего с глицерином или другого аналогичного красителя. Для установления молекулярного размера продукта амплификации используют подходящий маркер длин двухцепочечных молекул ДНК в интервале 100 - 1500 п.н. После электрофореза гель окрашивают в течение 10 мин в растворе интеркалирующего красителя бромистого этидия (5 мкг/мл), при активном покачивании на шейкере, с последующей промывкой в достаточном объеме дистиллированной воды.

Учет результатов тестирования ДНК штаммов S. aureus методом ПЦР на наличие генов вирулентности

5.4. Гель-документацию результатов амплификации генов вирулентности S. aureus осуществляют в проходящем УФ-свете с длиной волны 254 нм с использованием подходящего оборудования. По результатам гель-документации проводят идентификацию генов вирулентности в геноме исследуемых штаммов S. aureus. Для этого определяют наличие ПЦР-продукта в тестируемом образце, идентичного по размеру положительному контролю, ПЦР-продукту, амплифицированному с ДНК-матрицы референс-штамма. Размеры ПЦР-продуктов определяемых генов вирулентности для референс-штаммов (положительный контроль) представлены в табл. 4. Наличие ПЦР-продукта в тестируемом образце учитывается только при отсутствии соответствующего ПЦР-продукта в отрицательном контроле.

Верификация результатов ПЦР-тестирования методом определения нуклеотидной последовательности ампликонов

5.5. ПЦР-продукты, полученные при амплификации со специфическими олигонуклеотидными праймерами, аккуратно вырезают стерильным скальпелем из агарозного геля под визуальным контролем в проходящем УФ-свете с длиной волны 254 нм, так чтобы в одном фрагменте геля находился один ПЦР-продукт. Перед вырезанием каждого нового ПЦР-продукта производят дезинфекцию скальпеля 96 % спиртом и обжиганием. Гель с ДНК помещают в заранее заготовленные стерильные пробирки. Для очистки продуктов амплификации из агарозного геля используют любой набор для экстракции линейных ДНК, имеющих размер в диапазоне от 100 п.н. до 3 т.п.н., по инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты используют в качестве матриц для реакции секвенирования на автоматическом секвенаторе.

5.6. Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей проводят с помощью свободного биоинформационного программного обеспечения. Анализ последовательностей ДНК по результатам секвенирования проводят с помощью программного обеспечения (например, программное обеспечение Unipro UGENE ¹⁴). Выравнивание нуклеотидных последовательностей и идентификацию генов вирулентности S. aureus осуществляют с помощью программного обеспечения (например, программа BLAST ¹⁵). Для верификации результатов ПЦР-тестирования рекомендуется сравнить полученные в результате секвенирования последовательности с референс-последовательностями генов вирулентности S. aureus с помощью программного обеспечения (например, база данных GenBank ¹⁶). Перечень референс-последовательностей генов вирулентности S. aureus с номерами последовательностей в базе данных NCBI GenBank представлен в табл. 5.

------------------------------

¹⁴ Официальный сайт свободного программного обеспечения для работы молекулярного биолога (Unipro UGENE): ugene.net/ru (в свободном доступе).

¹⁵ Официальный сайт программного обеспечения для поиска локального выравнивания (BLAST): blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (в свободном доступе).

¹⁶ Официальный сайт базы данных генетических последовательностей ДНК (GenBank): ncbi.nlm.nih.gov/genbank (в свободном доступе).

------------------------------

Таблица 5

Референс-последовательности генов вирулентности S. aureus в базе данных NCBI GenBank

Ген	Продукт гена	Номер последовательности в базе данных NCBI GenBank
1	2	3
nuc	Стафилококковая нуклеаза	DQ399678
coa	Плазмакоагулаза	LC425082
lukS-PV, lukF-PV	Лейкоцидин Пантон-Валентайна	EF571841
lukE, lukD	Лейкоцидин ED	MN450303
hla	Гемолизин A	KT279561
hlb	Гемолизин В	KC242859
tst	Токсин синдрома токсического шока	EF531615
sea	Энтеротоксин А	EF520720
seb	Энтеротоксин В	АМ158256
sec	Энтеротоксин С	АВ084256
sed	Энтеротоксин D	KX168619
see	Энтеротоксин Е	М21319
seo	Энтеротоксин-подобный белок О	MN450303
eta	Эксфолиативный токсин А	М17347
etb	Эксфолиативный токсин В	M17348
mecA	Ген метициллин-резистентности	LC424989

VI. Идентификация и дифференциация ДНК метициллин-чувствительных и метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, с выявлением штаммов Staphylococcus aureus, несущих гены токсинов, методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени"

6.1. Метод предназначен для быстрой идентификации штаммов S. aureus и MRSA, дифференциации S. aureus от Staphylococcus epidermidis (далее - S. epidermidis), и выявления штаммов S. aureus, несущих гены клинически важных стафилококковых токсинов: токсина синдрома токсического шока, лейкоцидина Пантон-Валентайна и эксфолиативного токсина В методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени".

Подготовка образцов к проведению ПЦР

6.2. Выделение ДНК из суспензий штаммов S. aureus для анализа методом ПЦР в режиме "реального времени" проводят в соответствии с методическими документами ¹⁷.

------------------------------

¹⁷МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее - МУ 1.3.2569-09).

------------------------------

6.3. Для выделения ДНК используют коммерческие наборы для экстракции ДНК из клинического материала, разрешенные к применению и зарегистрированные в установленном порядке ¹⁸. Выделение проводят в соответствии с инструкцией к набору для экстракции ДНК. Выделенную ДНК хранят в течение года при температуре не выше минус 18 °C.

------------------------------

¹⁸Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

Подготовка положительных и отрицательных контрольных образцов к проведению ПЦР

6.4. В качестве положительного контроля используют ДНК штаммов:

- положительный контроль в ПЦР на MRSA (K+MRSA) - S. aureus АТСС ¹⁹ BAA-1720;

------------------------------

¹⁹Примечание: АТСС - англ. American Type Culture Collection.

------------------------------

- положительный контроль в ПЦР на MRSE (Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis) (далее - MRSE) (K+MRSE) - S. epidermidis АТСС 14990;

- положительный контроль в ПЦР на наличие генов токсинов (К+ТОХ) - смесь штаммов S. aureus АТСС 25923 (luk-PV), S. aureus CCUG 47205 (etb) и S. aureus ГКПМ-Оболенск B-7778 (tst);

- другие референсные штаммы с аналогичными характеристиками.

В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду.

Подготовка праймеров для амплификации

6.5. Для проведения реакции амплификации используют олигонуклеотидные праймеры и зонды, меченные соответствующими флуоресцентными красителями (табл. 6, 7).

Таблица 6

Праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени" (реакция "А")

Название праймера	Целевой ген/ Последовательность праймера или зонда	Флуоресцентные красители
ген нуклеазы S. aureus
nuc-S	5'-TTACATAAAGAACCTGCGAC-3'	ROX
nuc-AS	5'-GATGCTTTGTTTCAGGTG-3'
nuc-Taq	5'-CAAAGGTCAACCAATGACATTCAGACT-3'
ген устойчивости к метициллину mecA S. aureus
mecA-S	5'-CATTG ATCGCAACGTTCAATTT-3'	HEX
mecA-AS	5'-TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA-3'
mecA-Taq	5'-TGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCAT-3'
гена femA для S. epidermidis
femA-S	5'-CAACTCGATGCAAATCAGCAA-3'	FAM
femA-AS	5'-G AACCGCATAGCTCCCTGC-3'
femA-Taq	5'-TACTACGCTGGTGGAACTTCAAATCGTTATCG-3'

Таблица 7

Праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени" (реакция "В")

Название праймера	Целевой ген/ Последовательность праймера или зонда	Флуоресцентные красители
1	2	3
Ген лейкоцидина Пантон-Валентайна S. aureus (luk-PV)
luk-pv-S	5'-AAATGTCTGGACATGATCC-3'	НЕХ
luk-pv-AS	5'-CTGTATTGGATAGCAAAAGC-3'
luk-pv-Taq	5'-AATCCGAGAGACTATTTTGTGTCAGAC-3'
Ген токсина синдрома токсического шока S. aureus (tst)
tst-S	5'-ACTGGTATAGTAGTGGGTCTGA-3'	Су5
tst-AS	5'-GGGCTATAATAAGGACTCGG-3'
tst-Taq	5'-AGGCTGATGCTGCCATCTGTGTTT-3'
Ген эксфолиативного токсина S. aureus (etb)
etb-S	5'-ACGGCTATATACATTCAATTC-3'	FAM
etb-AS	5'-TTGGATTATTAGGGTATTAGGT-3'
etb-Taq	5'-TGGATATTGTAGAATGTGTCATGGTTATTACC-3'

Подготовка амплификации с детекцией в режиме "реального времени"

6.6. Подготовка пробирок для амплификации. Для каждой анализируемой культуры готовят по две пробирки ("А" и "В") для двух независимых реакций. Пробирка "А" предназначена для идентификации и дифференциации S. aureus, S. epidermidis и метициллин-резистентных штаммов S. aureus. Пробирка "В" предназначена для выявления штаммов S. aureus, несущих ген токсина синдрома токсического шока, и (или) ген лейкоцидина Пантон-Валентайна и (или) ген эксфолиативного токсина В.

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы ДНК - 10 мкл. Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме "реального времени". Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

Предварительно подготовить ПЦР-смесь для реакции "А" и ПЦР-смесь для реакции "В". Для формирования ПЦР-смеси для реакции "А" смешивают 3 пары праймеров в количестве 0,5 нмоль каждого, и флуоресцентные зонды, в количестве 0,3 нмоль каждого (табл. 6). Для формирования ПЦР-смеси для реакции "В" смешивают 3 пары праймеров в количестве 0,5 нмоль каждого, и флуоресцентные зонды, в количестве 0,3 нмоль каждого (табл. 7). Компоненты смешиваются в равных количествах, так чтобы объем ПЦР-смеси составлял 5 мкл.

6.7. В каждую пробирку вводят по 10 мкл Taq-ПЦР буфера, 0,25 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), так чтобы получилось в ПЦР смеси по 150 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата и 0,5 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед/мкл). В пробирку "А" вводят 5 мкл ПЦР смеси для реакции "А", в пробирку "В" вводят 5 мкл ПЦР смеси для реакции "В". Полученные смеси следует перемешать на вортексе и сбросить капли кратковременным центрифугированием. Затем, используя наконечники с фильтром, в подготовленные пробирки внести 10 мкл ДНК-пробы (исследуемые образцы и контроля). В пробирку отрицательного контроля ПЦР вносят 10 мкл ДНК буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8.0). Общий объем реакционной смеси в каждой пробирке составляет 25 мкл, при том, что объем ДНК-пробы - 10 мкл ²⁰.

------------------------------

²⁰Примечание: при использовании термоциклеров с считыванием через крышку (например, ДТ-96 или CFX96) не рекомендуется наносить маркировку на крышку пробирок.

------------------------------

Проведение реакции ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией

6.8. Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки прибора для амплификации (амплификатор с системой детекции в режиме "реального времени"). Запрограммировать прибор согласно инструкции производителя. В программе указывают объем реакционной смеси, выбирают тип пробирок и задают следующие параметры эксперимента:

1) удержание (англ. Hold) температуры: 95 °C - 5 мин;

2) циклирование (англ. Cycling): при температуре (95 1) °C - 15 с; при температуре (58 1) °C - 15 с; при температуре (72 1) °C - 15 с;

3) цикл (англ. Cycle repeats): число повторов - 40 раз.

Каналы детекции: 6-карбоксифлуоресцеин (англ. fluorescein amidites, далее - FAM), гексахлорфлуоресцеин (англ. 6-carboxy-2,4,4,5,7,7-hexachlo rofluorescein succinimidyl ester, далее - HEX), родамин X (англ. rhodamine X, далее - ROX), цианин-5 (англ. cyanine 5, далее-Су5).

6.9. После завершения программы амплификации отработанные пробирки обеззараживают в соответствии с методическими документами ²¹.

------------------------------

²¹МУ 1.3.2569-09.

------------------------------

Анализ и интерпретация результатов

6.10. Полученные данные, кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме "реального времени" в соответствии с инструкцией производителя к прибору.

6.11. Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла "Ct" для исследуемого образца).

6.12. Результат считается достоверным только в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК (см. табл. 8).

Таблица 8

Оценка результатов анализа контрольных образцов

Контроля	Результат (значение Ct)
	НЕХ (mecA; Luk-PV)	FAM (femA-SE; etb)	ROX (nuc)	Cy5 (tst)
К+	(+)	(+)	(+)	(+)
К-	(-)	(-)	(-)	(-)
Примечание: (+) - наличие пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией; (-) - отсутствует значение порогового цикла Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию).

6.13. Для положительного результата ПЦР-анализа образца по соответствующему каналу флуорофора регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации в виде характерной кривой флуоресценции по сравнению с отрицательным контролем ПНР. Появление любого значения Ct для отрицательного контроля на каналах HEX, FAM, ROX и Су5 свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недостоверными. Следует повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Принцип интерпретации результатов первой реакции

6.14. В исследуемом образце идентифицирован ген нуклеазы (nuc) S. aureus, если для данной пробы по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации гена nuc S. aureus при корректном прохождении контролей.

6.15. В исследуемом образце идентифицирован ген femA-SE S. epidermidis, если для данной пробы по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК S. epidermidis при корректном прохождении контролей.

6.16. В исследуемом образце идентифицирован ген тес A S. aureus, если для данной пробы по каналу для флуорофора НЕХ регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации гена тес А в специфической области хромосомы S. aureus, обнаруживаемой только у метициллин-резистентных штаммов при корректном прохождении контролей.

6.17. Образец считается отрицательным (гены nuc, femA-SE и mecA не обнаружены), если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на каналах ROX, FAM и НЕХ, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы. Результаты анализа исследуемых образцов принимаются только при выполнении всех вышеперечисленных условий для контрольных образцов.

Принцип интерпретации результатов второй реакции

6.18. В исследуемом образце идентифицирован ген tst S. aureus, если для данной пробы по каналу для флуорофора Су5 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации гена tst S. aureus при корректном прохождении контролей.

6.19. В исследуемом образце идентифицированы гены лейкоцидина Пантон-Валентайна (Luk-PV) S. aureus, если для данной пробы по каналу для флуорофора НЕХ регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации генов лейкоцидина Пантон-Валентайна Luk-PV) S. aureus при корректном прохождении контролей.

6.20. В исследуемом образце идентифицирован ген эксфолиативного токсина В (далее - etb) S. aureus, если для данной пробы по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации гена etb S. aureus при корректном прохождении контролей.

6.21. Образец считается отрицательным (гены tst, Luk-PV и etb не обнаружены), если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на каналах ROX, FAM, НЕХ и Су5, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы. Результаты анализа исследуемых образцов принимаются только при выполнении всех вышеперечисленных условий для контрольных образцов.

Специфическая активность в первой реакции

6.22. Выявление ДНК S. aureus MSSA - (Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus) и MRSA и S. epidermidis (MSSE и MRSE) в исследуемых пробах определяется в реакции "A":

- обнаружен MRSA, если по каналам для флуорофоров НЕХ и ROX регистрируется сигнал и характерная кривая амплификации;

- обнаружен MRSE, если по каналам для флуорофоров FAM и ROX регистрируется сигнал и характерная кривая амплификации;

- обнаружен MSSA, если по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал и характерная кривая амплификации; по каналу для флуорофора НЕХ отсутствует сигнал;

- обнаружен MSSE, если по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал и характерная кривая амплификации; по каналу для флуорофора НЕХ отсутствует сигнал;

- не обнаружены S. aureus и S. epidermidis, если по каналам FAM и ROX отсутствует рост сигнала флуоресценции.

Специфическая активность во второй реакции

6.23. Выявление ДНК S. aureus, несущих гены клинически значимых токсинов, в исследуемых пробах определяется в реакции "В":

- обнаружен штамм S. aureus, несущий ген etb, если по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал и характерная кривая амплификации;

- обнаружен штамм S. aureus, несущий гены Luk-PV, если по каналу для флуорофора НЕХ регистрируется сигнал и характерная кривая амплификации;

- обнаружен штамм S. aureus, несущий ген tst, если по каналу для флуорофора Су5 регистрируется сигнал и характерная кривая амплификации;

- не обнаружены ДНК S. aureus, несущие гены клинически значимых токсинов, если по каналам FAM, НЕХ и Су5 отсутствует рост сигнала флуоресценции.

Результаты второй реакции могут регистрироваться как по одному каналу, так и по всем трем одновременно.

Нормативные и методические документы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации".

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

4. Федеральный закон от 31.07.2020 N 248-ФЗ "О государственном контроле (надзоре) и муниципальном контроле в Российской Федерации".

5. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

6. СанПиН 2.3/2.4.3590-20 "Санитарно-эпидемиологические требования к организации общественного питания населения".

7. Приказ Минздрава России от 18.05.2021 N 464н "Об утверждении правил проведения лабораторных исследований".

8. МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории".

9. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

10. МУ 3.5.1.3674-20 "Обеззараживание рук медицинских работников и кожных покровов пациентов при оказании медицинской помощи".

11. МУК 4.2.2429-08 "Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах".

12. МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

13. МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

14. МУК 4.2.2872-11 "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией".

15. Рекомендации "Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам".

16. ГОСТ P ИСО 20776-1 "Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод микроразведений в бульоне для лабораторного исследования активности антимикробных агентов по отношению к быстрорастущим аэробным бактериям, вызывающим инфекционные заболевания".

17. ГОСТ ISO/TS 17728 "Микробиология пищевой цепи. Методы отбора проб пищевой продукции и кормов для микробиологического анализа".

18. ГОСТ 83 "Натрий углекислый. Технические условия".

19. ГОСТ 4201 "Натрий углекислый кислый. Технические условия".

20. ГОСТ 4204 "Кислота серная концентрированная. Технические условия".

21. ГОСТ 177 "Водорода перекись. Технические условия".

22. ГОСТ 4233 "Натрий хлористый. Технические условия".

23. ГОСТ 4172 "Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия".

24. ГОСТ 4198 "Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия".

25. ГОСТ 4234 "Калий хлористый. Технические условия".

26. ГОСТ 3652 "Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия".

27. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

28. ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия".

29. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

30. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

Библиографические ссылки

1. Дехнич А.В. Терапия нозокомиальных стафилококковых инфекций в России: время менять стереотипы / А.В. Дехнич // Врач. 2010. N 10. С. 18 - 22.

2. Gismene С. Staphylococcus aureus Exfoliative Toxin E, Oligomeric State and Flip of P186: Implications for Its Action Mechanism / C. Gismene, JE. Hernandez Gonzalez, ARN Santisteban, AF Ziem Nascimento, L Dos Santos Cunha, FR de Moraes, CLP de Oliveira, CC Oliveira. P Jocelan Scarin Provazzi, PG Pascutti, RK Ami, R. Barros Mariutti // Int J Mol Sci. 2022. Vol. 30, N 23(17). P. 9857.

3. Chiang-Ni C. Streptococcal pyrogenic exotoxin В causes mitochondria damage to polymorphonuclear cells preventing phagocytosis of group A streptococcus / C. Chiang-Ni, C.H. Wang, P. J., Tsai, W. J. Chuang. Y.S. Lin, M.T. Lin, С. C Liu., J. J. Wu // Med Microbiol Immunol. 2006. N 195. P. 55 - 63.

4. Cichy J. / J Cichy, R Bals, J Potempa, A Mani, E Pure // Proteinase-mediated release of epithelial cell-associated CD44. Extracellular CD44 complexes with components of cellular matrices//J Biol Chern. 2002. V. 277. P. 44440 - 7.

5. Drapeau G.R. Purification and properties of an extracellular protease of Staphylococcus aureus / G.R. Drapeau, Y. Boily, J. Houmard // J Biol Chern. 1972. vol. 247. P. 6720 - 6726.

6. Drapeau G.R. Role of metal loprotease in activation of the precursor of staphylococcal protease / G.R. Drapeau // J. Bacteriol. 1978. V. 136. P. 734 - 739.

7. Dubin G. Extracellular proteases of Staphylococcus spp. / G. Dubin // Biol Chem. 2002. V. 383. P. 1075 - 86.

8. Ellis S.R. The skin and gut microbiome and its role in common dermatologic conditions / S.R. Ellis, M Nguyen, A.R. Vaughn, M. Notay, W.A. Burney, S. Sandhu, R.K. Sivamani // Microorganisms. 2019. N 11. 7(11). P. 550 - 558.

9. Hennekinne J.A. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation / J. A. Hennekinne, M.L. De Buyser, S. Dragacci H FEMS Microbiol Rev. 2012. V. 36, N 4. P. 815 - 836.

10. Holmes N.E. Morbidity from in-hospital complications is greater than treatment failure in patients with Staphylococcus aureus bacteraemia / N.E. Holmes, J.O. Robinson, S.J. van Hal, W.J. Munckhof, E. Athan, T.M. Korman, A.C. Cheng, J.D. Tumidge, P. D.R. Johnson, B.P. Howden // BMC Infectious Diseases 2018. V. 18. N 1. P. 1 - 9.

11. Kadariya J. Staphylococcus aureus and staphylococcal food-borne disease: an ongoing challenge in public health / J. Kadariya, T.C. Smith, D. Thapaliya// Biomed Res Int. 2014. - 827965.

12. Khan A. Current and future treatment options for community-associated MRSA infection / A. Khan, B. Wilson, I.M. Gould // Expert Opin Pharmacother. 2018. V. 19(5). P.457 - 470.

13. Kaneko H. The emerging threat of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clone ST22-PT, carrying both Panton-Valentine leucocidin and toxic shock syndrome toxin 1 genes / H. Kaneko, Y. Yanagi, S. Otake, M. Sato, T. Saito, H. Nakaminami // J Antimicrob Chemother. 2023. Vol. 3, N 78(4). P. 1023 - 1027.

14. Kubica M. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages / M. Kubica, K. Guzik, J. Koziel, et al. // PLoS One. 2008. N 3. - e1409.

15. Lai Y. The human anionic antimicrobial peptide dermcidin induces proteolytic defence mechanisms in staphylococci / Y. Lai, A.E. Villaruz, M. Li, D. J. Cha, D. E Sturdevant., M. Otto // Mol Microbiol. 2007. V. 63. P. 497 - 506.

16. Lina G. Standard nomenclature for the superantigens expressed by Staphylococcus / G. Lina, G.A. Bohach, S.P. Nair, K. Hiramatsu, E. Jouvin-Marche, R. Mariuzza // J Infect Dis. 2004. V. 189, N 12. P. 2334 - 2336.

17. Lourbakos A. Arginine-specific protease from Porphyromonas gingivalis activates protease-activated receptors on human oral epithelial cells and induces interleukin-6 secretion / A. Lourbakos, J. Potempa, J. Travis, M. D'Andrea R., P. Andrade-Gordon, R. Santulli, E.J. Mackie, R.N. Pike // Infect Immun.2001. V. 69. P. 5121 - 5130.

18. Lyell A. Toxic epidermal necrolysis / A. Lyell // Nurs. Mirror Midwives J. 1973. N. 136. P. 42 - 45.

19. McGuinness W. A. Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus / W.A. McGuinness, N. Malachowa, F.R. DeLeo // Yale J Biol Med. 2017. V. 90(2). P. 269 - 281.

20. Oehmcke S. Contact system activation in severe infectious diseases/ S. Oehmcke, H. Herwald // J Mol Med (Berl). 2010. V. 88(2). P. 121 - 126.

21. Oliveira D. Staphylococcus aureus toxins and their molecular activity in infectious diseases / D. Oliveira, A. Borges, M. Simoes // Toxins (Basel).2018. V. 19. N 10(6). P. 252 - 259.

22. Plata K. Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemistry and molecular genetics of its pathogenicity /K. Plata, A.E. Rosato, G. Wegrzyn // Acta Biochimica Polonica. 2009. V. 56. P. 597 - 612.

23. Rasmussen G. Prevalence of clonal complexes and virulence genes among commensal and invasive Staphylococcus aureus isolates in Sweden / G. Rasmussen, S. Monecke, R. Ehricht, B. Soderquist // PLoS One. 2013. V. 8. N 10. e77477.

24. Shaw L. The role and regulation of the extracellular proteases of Staphylococcus aureus / L. Shaw, E. Golonka, J. Potempa, et al. // Microbiology. 2004. V. 150. P. 217 - 228.

25. Smagur, J. A new pathway of staphylococcal pathogenesis: Apoptosislike death induced by Staphopain В (SspB) in human peripheral blood neutrophils and monocytes / J. Smagur, K. Guzik, L. Magiera et al. // J Innate Immun. 2009. V. 1. P. 456 - 178.

26. Smagur J. Staphylococcal cysteine protease staphopain В (SspB) induces rapid engulftnent of human neutrophils and monocytes by macrophages / J. Smagur, K. Guzik, M. Bzowska, M. Kuzak, M. Zarebski, T. Kantyka, M. Walski, B. Gajkowska, J. Potempa // Biol. Chern. 2009. V. 390. P. 361 - 371.

27. Suzuki Y. Molecular epidemiological characterization of Staphylococcus aureus isolates originating from food poisoning outbreaks that occurred in Tokyo, Japan / Y. Suzuki, K. Omoe, D.L. Hu, Y. Sato'o, H.K. Ono, C. Monma, T. Arai, N. Konishi, R. Kato, A. Hirai, A. Nakama, A. Kai, Kamata Y. // Microbiol Immunol. 2014. V. 58. N 10. P. 570 - 580.

28. Tyurin Y.A., Effects of Staphylococcus aureus supernatants on human lymphocyte surface receptors / Y.A. Tyurin, I.G. Mustafin, R.S. Faskhanov // Bull Exp Biol Med. 2013. V. 154(6). P. 765 - 768.

29. Viana D. Adaptation of Staphylococcus aureus to ruminant and equine hosts involves SaPI-carried variants of von Willebrand factor-binding protein / D. Viana, J. Blanco, M.A. Tormo-Mas, L. Selva, C.M. Guinane, R. Baselga, J. Corpa, I. Lasa, R.P. Novick, J.R. Fitzgerald, J.R. Penades // Mol Microbiol. 2010. V. 77. N 6. P. 1583 - 94.

30. Vincents В. Down-regulation of human extracellular cysteine protease inhibitors by the secreted staphylococcal cysteine proteases, staphopain A and В / В. Vincents, P. Onnerfjord, M. Gruca, J. Potempa, M. Abrahamson // Biol Chern. 2007. V. 388. P. 437 - 446.

31. Wang Y. Site-specific cleavage of bacterial MucD by secreted proteases mediates antibacterial resistance in Arabidopsis / Y. Wang, R. Garrido-Oter, J. Wu, et al. // Nat Commun. 2019. V. 28, N 10(1). P. 2853.

32. Wolf M. Proteolytic processing of chemokines: implications in physiological and pathological conditions / M. Wolf, S. Albrecht, C. Marki // Int J Biochem Cell Biol. 2008. V. 40. P. 1185 - 1198.

33. Zheng Y. The tst gene associated Staphylococcus aureus pathogenicity island facilitates its pathogenesis by promoting the secretion of inflammatory cytokines and inducing immune suppression / Y Zheng, C Qin, X Zhang, et al. // Microb Pathog. 2020. V. 138. P. 103797.