Приложение 4. Методы работы с фиксированным вирусом бешенства на первичных клеточных культурах на примере штамма "Внуково-32"

Приложение 4
к МУ 3.3.2.3972-23

Методы работы с фиксированным вирусом бешенства на первичных клеточных культурах на примере штамма "Внуково-32"

1.1. Работа с фиксированным вирусом бешенства (штамм "Внуково-32") на первичных клеточных культурах.

Штамм фиксированного вируса бешенства "Внуково-32" применяется в производстве вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной для профилактики бешенства у людей. Для изготовления антирабической вакцины используют главный посевной материал и рабочий посевной материал производственного штамма "Внуково-32" фиксированного вируса бешенства, полностью охарактеризованный в соответствии с положениями государственной фармакопеи Российской Федерации [2]. Количество пассажей полностью охарактеризованного главного посевного вирусного материала для получения рабочего посевного вирусного материала, используемого для производства антирабических препаратов, не превышает 5. Количество пассажей рабочего посевного вирусного материала, используемого для производства антирабических препаратов, рассчитывается в соответствии с инструкцией по применению ИЛП.

Для приготовления первично-трипсинизированной культуры клеток почек сирийских хомячков в качестве источника тканей используют здоровых животных, подвергнутых испытаниям на отсутствие трансмиссивных вирусных инфекций, из специализированных питомников с приложением ветеринарного свидетельства.

Перед изъятием органов и тканей животное умерщвляют, поверхность тела подвергают дезинфекции, затем в асептических условиях извлекают почки. Органы животных измельчают, промывают от крови и объединяют в пул, который подвергают воздействию трипсина при постоянном перемешивании. Для прекращения воздействия трипсина в пул добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота в конечной концентрации 10 %. Полученные клетки отмывают от трипсина центрифугированием при 500 g в течение 5 мин, по окончании центрифугирования клетки немедленно суспендируют и контролируют концентрацию клеток методом микроскопии с использованием камеры Горяева или счетчика клеток.

Заражение первичных клеток фиксированным вирусом бешенства возможно двумя вариантами: заражение вирусом сформированной монослойной культуры клеток или заражение суспензии клеток с последующим внесением зараженной суспензии в культуральный флакон для формирования монослоя.

Для формирования монослойной культуры используют питательную среду 199, содержащую гидролизат лактальбумина и сыворотку крови крупного рогатого скота.

Монослой клеточной культуры, предназначенный для заражения вирусом, закрывает 70 - 90 % рабочей поверхности культурального флакона. Контроль клеточной культуры осуществляют с помощью инвертированного микроскопа. Перед инокуляцией вируса бешенства в клеточный монослой из культурального флакона полностью удаляют питательную среду. Монослой однократно промывают раствором Дульбекко или питательной средой, которые затем удаляют. В культуральный флакон стерильной пипеткой вносят вируссодержащую жидкость. Объем вирусного материала определяют таким образом, чтобы он равномерно покрывал весь монослой, а доза заражения составила от 0,1 до 1 ИД ₅₀ на 1 клетку. Перекатывающими движениями равномерно распределяют вируссодержащую жидкость по монослою и инкубируют не менее 30 мин в СО ₂-инкубаторе при температуре 37 °C для адсорбции вируса. Рекомендуется через каждые 10 - 15 мин покачивать культуральные флаконы. После завершения адсорбции вируссодержащую жидкость с помощью пипетки или автоматического дозатора удаляют из флакона в емкость с дезсредством (3 % хлорамин Б или 3 % раствор перекиси водорода.

При инокуляции вируса в клеточную суспензию свежетрипсинизированные клетки заражают вирусом при множественности заражения от 0,1 до 1 ИД ₅₀ на 1 клетку.

Для наработки вирусного полуфабриката для производства вакцинного препарата в культуральный флакон после заражения вносят питательную среду 199, содержащую гидролизат лактальбумина, дополнительно обогащенный подходящим гидролизатом белков или ростовые протеины.

Культивирование вируса бешенства проводят при температуре плюс (32 - 37) °C в течение 3 - 4 недель с периодической сменой питательной среды 2 - 3 раза в неделю. Об окончании культивирования вируса бешенства судят по деградации монослоя после его истощения при исследовании методом микроскопии.

Собранную из культуральных флаконов вируссодержащую культуральную жидкость по окончании культивирования объединяют и подвергают концентрированию методом ультрафильтрации и очистке методом диафильтрации. Сконцентрированный и очищенный вирусный полуфабрикат подвергают инактивации под действием ультрафиолетового облучения в тонком слое вирусной суспензии при постоянной скорости протока суспензии через аппарат инактивации или внесением бета-пропиолактона, а далее используют для завершающих стадий очистки и приготовления антирабической вакцины [2].