Приложение 3. Методы работы с фиксированным вирусом бешенства на животных на примере штаммов "Москва 3253" и CVS

Приложение 3
к МУ 3.3.2.3972-23

Методы работы с фиксированным вирусом бешенства на животных на примере штаммов "Москва 3253" и CVS

1.1. Условия хранения и пассирования производственного штамма фиксированного вируса бешенства (штамм "Москва 3253") на кроликах.

Главный посевной материал (лиофилизированный штамм "Москва 3253") хранится в ампулах в виде 10 % суспензии ткани мозга кролика при температуре не выше минус 20 °C. После вскрытия ампулы вирус пассируется 2 - 3 раза через мозг кролика. После проведенных пассажей инкубационный период и клиническая картина являются типичными для лабораторного бешенства. После пассажей на кроликах штамм фиксированного вируса бешенства "Москва 3253" хранится в виде замороженного головного мозга кролика (для приготовления маточной культуры вируса и производственного рабического антигена) или в виде замороженной 10 % суспензии ткани мозга (рабочий посевной материал). Оптимальной температурой для хранения является температура не выше минус 70 °C. Для хранения используется низкотемпературный холодильник или криогенные сосуды с жидким азотом.

Штамм фиксированного вируса бешенства "Москва 3253" пассируется через головной мозг кролика не чаще 6 - 7 раз в год после третьего пассажа от исходного лиофилизированного. Для заражения рекомендуется использовать аутбредных кроликов породы "советская шиншилла", массой 1,5 - 2,0 кг, без различия пола.

Работу с животными проводят сотрудники, прошедшие инструктаж по мерам безопасности и имеющие навыки работы с животными. Перед заражением кроликов замороженную аликвоту с 10 % мозговой суспензией выдерживают при температуре плюс (6 2) °C в течение 18 - 20 ч для оттаивания и осаждения мозговой ткани, после чего осторожно пастеровской пипеткой отбирают среднюю фазу мозговой суспензии, содержащую максимальное количество вируса. Заражение животных производят с соблюдением правил хирургической асептики. Кроликов заражают в мозг или под твердую мозговую оболочку. Для внутримозгового заражения кролика его надежно фиксируют на станке или дают легкий наркоз внутримышечно за 20 - 30 мин до заражения. Затем аккуратно выстригают шерсть в зоне предполагаемого введения, обрабатывают 70 % этиловым спиртом и с помощью стерильного шприца однократного применения емкостью 2 мл вводят (0,25 0,05) мл суспензии фиксированного вируса бешенства. Прокол делают приблизительно на середине линии, условно соединяющей наружный угол глаза и ухо (с правой стороны или симметрично с левой стороны). Явные признаки паралича появляются у кроликов на 4 день после инокуляции; в редких случаях они развиваются до 7 дня. К числу первых симптомов экспериментального бешенства относятся: повышение температуры тела; пугливость животного; расширение зрачков. Затем появляются менингеальные явления, парезы, начинающиеся обычно с задних конечностей, быстро прогрессирующие параличи, захватывающие все конечности, шейную и затылочную мускулатуру.

Для приготовления вируссодержащего материала используются животные, заболевшие не ранее, чем через 80 ч и не позднее 144 ч после заражения. Извлечение мозга у животного производится после развития полной картины паралича, характерного для заражения фиксированным вирусом бешенства. Регламентные работы по декапитации больных кроликов проводят в боксированном помещении "заразной" зоны с соблюдением санитарно-эпидемиологических требований ⁵⁹. Больных кроликов с полной картиной паралича, но с еще сохранившимся дыханием, декапитируют; с помощью пинцета, скальпеля и ножниц отсепаровывают кожу головы. Обнаженную поверхность черепа дважды обрабатывают 70 % раствором этилового спирта, череп помещают в емкость с крышкой, которую передают в БМБ III класса для вскрытия черепной коробки и извлечения головного мозга. Перед вскрытием череп двукратно обрабатывают тампоном, смоченным в 70 % растворе этилового спирта. Череп кролика надежно фиксируют на станке и проводят трепанацию с помощью хрящевого реберного ножа и хирургического молотка. Делают четыре разруба, образующих прямоугольник в теменной области черепа, и обнажают головной мозг. С помощью пинцета и ножниц с загнутыми концами освобождают мозг от спаек, затем перерезают мозг на уровне спинного мозга и перекреста зрительных нервов. Головной мозг извлекают из черепной коробки, помещают в стерильную чашку Петри, взвешивают и используют для приготовления рабочего посевного вирусного материала для проведения пассажей на кроликах, а также для изготовления производственного рабического антигена для гипериммунизации животных-продуцентов.

------------------------------

⁵⁹Пункт 252 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

1.2. Для приготовления рабочего посевного вирусного материала для заражения кроликов ("маточной" культуры фиксированного вируса бешенства "Москва 3253") головной мозг кролика после оттаивания помещают в стерильную фарфоровую ступку, растирают стерильным фарфоровым пестиком, добавляют стерильную воду очищенную до конечной концентрации суспензии 10 %. Суспензию ткани мозга кролика аликвотируют по 10 мл и помещают на хранение. Работу проводят в БМБ III класса (см. п. 2.12 настоящих МУ).

1.3. Для приготовления производственного антигена для гипериммунизации животных-продуцентов к головному мозгу кролика после оттаивания и измельчения добавляют очищенную воду, содержащую 0,5 % фенола в количестве, необходимом для получения 5 и 10 % мозговой суспензии, в зависимости от этапа иммунизации продуцентов. Для удаления крупных остатков мозговой ткани суспензию мозга фильтруют через тройной слой стерильной марли. Для проведения контроля стерильности с помощью бактериологической петли проводят посев образца рабического антигена из ступки в пробирки с сахарным бульоном. Посевы выдерживают при температуре плюс (37 1) °C в течение 5 сут. Стерильный антиген, приготовленный на карболизированной воде, инактивируют при температуре плюс (37 1) °C в течение 1 сут или при температуре плюс (6 2) °C в течение 8 сут. Разрешается к использованию стерильный антиген, хранившийся при температуре плюс (6 2) °C не более 14 сут.

1.4. Условия хранения и пассирования контрольного штамма фиксированного вируса бешенства (штамм CVS) на белых мышах.

Главный посевной материал (лиофилизированный штамм CVS) хранят в ампулах в виде 20 % суспензии ткани мозга мыши при температуре не выше минус 20 °C. После вскрытия ампулы вирус пассируют 1 - 3 раза через мозг белой мыши. После проведенных пассажей инкубационный период и клиническая картина болезни соответствуют типичному лабораторному бешенству. После пассажей на белых мышах штамм фиксированного вируса бешенства CVS хранят в виде замороженного головного мозга мыши (для приготовления маточной культуры вируса) или в виде замороженной 20 % суспензии ткани мозга (материал для постановки контрольных реакций). Оптимальной температурой для хранения является температура не выше минус 70 °C. Для хранения используют низкотемпературный холодильник или криогенные сосуды с жидким азотом.

Перед заражением белых мышей штаммом CVS содержимое криопробирки с замороженной вирусной суспензией быстро оттаивают, после чего осаждают мозговую ткань центрифугированием в течение 5 мин при 500 g. Для заражения используют беспородных белых мышей или мышей любой инбредной линии в возрасте 6 - 8 недель и массой (11 1) г. Пол мышей принципиального значения не имеет. Мышь укладывают головой на подставку и надежно, но не сильно, чтобы не вызвать асфиксию, фиксируют пальцами. Заражение проводят с помощью инсулинового шприца объемом 0,3 - 1,0 мл (цена деления 0,01). Тампоном, смоченным 70 % раствором этилового спирта, тщательно обрабатывают место введения вируса. Иглой шприца в строго вертикальном положении прокалывают череп животного в точке, находящейся в вершине воображаемого угла, стороны которого ведут к правому глазу и правому уху животного (или симметрично с левой стороны). Иглу погружают на 0,1 - 0,2 см в ткань мозга и вводят 0,03 мл вирусной суспензии. После заражения шприц погружают в емкость с дезраствором, предварительно движением поршня заполнив его дезраствором.

На 5 - 6 день после заражения у мышей появляются симптомы заболевания: взъерошенная шерсть; тремор при поднятии животного за кончик хвоста; нарушение координации движений задних конечностей; паралич; прострация (терминальный синдром). Мышей с выраженными терминальными симптомами лабораторного бешенства, но еще живых, подвергают эвтаназии и далее проводят манипуляции по извлечению головного мозга.

Животное фиксируют животом вниз, прикрепив вытянутые конечности, хвост и конец морды. После обработки 70 % раствором этилового спирта кожу головы и шеи отсепаровывают с помощью стерильных ножниц и пинцета, открывая череп. Череп зажимают в глазницах хирургическим пинцетом, изогнутыми ножницами отделяют крышку черепа, обнажая мозг. С помощью тех же изогнутых ножниц извлекают мозг, помещают его в криопробирку, маркируют и помещают на хранение при температуре не выше минус 70 °C, в дальнейшем используя для приготовления 20 % мозговой суспензии. Одновременно проводят посев на стерильность в пробирки с сахарным бульоном, которые инкубируют при температуре плюс (37 1) °C в течение 5 сут. Для испытания на стерильность используется тиогликолевая среда, посевы инкубируются в течение 14 сут при двух температурных режимах: плюс (32,5 2,5) °C и (22,5 2,5) °C. Для получения посевного вирусного материала стерильную мозговую ткань в условиях БМБ III класса тщательно растирают в фарфоровой ступке стерильным пестиком и готовят 20 % суспензию, постепенно добавляя суспензионную среду (стерильную воду очищенную, содержащую сыворотку крови лошади инактивированную в конечной концентрации 2 %).