Приложение N 11. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза

Приложение N 11
к приказу Минздрава РФ
от 21 марта 2003 г. N 109

Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза

I. Роль лабораторий при выявлении, диагностике и лечении больных туберкелезом

Выявление больных туберкулезом проводится при обращении за медицинской помощью и в группах риска по заболеванию туберкулезом.

Первичное обследование больных возложено на подразделения общей лечебной сети.

Целью лабораторного исследования является максимально возможное выявление наиболее эпидемически опасной категории пациентов среди лиц, обратившихся в медицинское учреждение с подозрительными в отношении туберкулеза клиническими и/или рентгенологическими симптомами.

Обследования с целью выявления случаев туберкулеза должны осуществляться всеми лечебно-профилактическими учреждениями здравоохранения и включать оценку следующих основных параметров:

- имеющие соответствующую симптоматику со стороны органов дыхания (наличие в течение 3-х и более недель продуктивного кашля с выделением слизистой, слизисто-гнойной мокроты или мокроты с прожилками крови);

- имеющие выявленные лучевыми методами изменения в легких, подозрительные на туберкулез;

- лица из контактов с больными туберкулезом, выделяющими микобактерии и/или имеющими соответствующие симптомы заболевания;

- лица, относящиеся к группам риска.

Под первичным микроскопическим обследованием подразумевается прямая бактериоскопия мазка нативной мокроты, окрашенного по методу Ziehi-Neelsen (световая микроскопия) или флюорохромными красителями (люминесцентная микроскопия). Исследование проводится трижды по определенной схеме (см. Приложение N 10 настоящего приказа).

При положительных или сомнительных результатах первичного бактериоскопического обследования, а также при отрицательных, но с наличием клинико-рентгенологических симптомов, пациент направляется в противотуберкулезное учреждение для заключительного микробиологического подтверждения и решения вопроса о взятии на диспансерный учет.

В вопросах диагностики и лечения бактериологические лаборатории противотуберкулезных учреждений должны обеспечить решение следующих задач:

- достоверно подтвердить туберкулезную природу заболевания;

- определить таксономическую принадлежность возбудителя;

- определить его лекарственную чувствительность;

- обеспечить качества лабораторных исследований (разработка и внедрение внутрилабораторного и участие во внешнем контроле качества исследований, непрерывное обучение персонала);

- обеспечить безопасность персонала лабораторий;

- исключить возможность внутрибольничной инфекции;

- осуществлять персонифицированный учет больных туберкулезом и мониторинг состояния микобактериальной популяции в процессе диагностики и лечения;

- осуществлять правильное и своевременное ведение учетно-отчетной документации, а также своевременное доведение результатов исследования до лечебных подразделений;

В основе осуществления всех перечисленных задач лежит использование микробиологических методов исследования.

Классическое микробиологическое исследование включает:

- микроскопическое исследование мазка осадка диагностического материала;

- культуральное исследование (посев);

- дифференциацию выделенной культуры кислотоустойчивых микобактерий;

- определение лекарственной чувствительности выделенного возбудителя.

Весьма важно, что с помощью культурального исследования можно обнаружить значительно меньшее, чем при микроскопии количество микобактерий туберкулеза. Это позволяет на 30-50% увеличить число выявляемых бактериовыделителей, повысить чувствительность критерия излечения за счет выявления олигобациллярных больных, продолжающих выделять малые количества микобактерий по окончании курса специфической терапии и признанных излеченными на основании отрицательных результатов микроскопии мазка мокроты.

В связи с изложенным культуральное исследование следует применять во всех случаях диагностики туберкулеза у следующих категорий пациентов:

- Диагностика заболевания у больных с клиническими и рентгенологическими симптомами, подозрительными на туберкулез, при повторно отрицательных результатах бактериоскопического исследования;

- Диагностика внелегочных форм туберкулеза у взрослых;

- Диагностика легочных и внелегочных форм туберкулеза у детей;

- Обследование контингентов групп повышенного риска, имеющих подозрительные на туберкулез симптомы, например, лабораторных работников или медицинских работников, осуществляющих уход за больными туберкулезом, больных с иммунодефицитами;

- Подтверждение абациллирования больного по окончании курса терапии;

Кроме того, выделение и оценка возбудителя особенно важна при:

- Наблюдении за больными туберкулезом с неудовлетворительными результатами стандартного курса химиотерапии, у которых возбудителями заболевания могут быть лекарственно-устойчивые штаммы микобактерий туберкулеза или нетуберкулезные микобактерий (возбудители микобактериозов);

- Эпидемиологическом надзоре за лекарственной устойчивостью микобактерий туберкулеза при оценке эффективности программы борьбы с туберкулезом;

- Выявлении внутрибольничной туберкулезной инфекции и путей ее трансмиссии.

В качестве методов, альтернативных классическому культуральному исследованию, возможно использование автоматизированных и полуавтоматизированных систем ускоренной культуральной диагностики, основанной на использовании жидких питательных сред и различных способах индикации роста микобактерий.

С целью быстрой идентификации микобактерий туберкулезного комплекса в качестве дополнительных допускается использование методов, основанных на амплификации фрагментов генома микобактерий (полимеразная цепная реакция - ПЦР), других молекулярно-биологических методов. ПЦР-анализ может быть применен для исследования материала от больного (мокроты, промывных вод бронхов, мочи и спинномозговой жидкости), а также культур микроорганизмов. Технология проведения ПЦР должна проводиться в строгом соответствии с описанием и инструкцией, прилагаемых к каждому конкретному диагностическому набору (тест-системе). Лаборатории, использующие такие методы, должны быть устроены соответствующим образом для исключения кросс-контаминации образцов.

II. Диагностический материал

2.1. Сбор диагностического материала

2.1.1. Режимы и кратность обследования больных

Кратность и сроки микробиологических исследований в ходе лечения и наблюдения различных групп пациентов определены в инструкции по химиотерапии больных туберкулезом и инструкции по организации диспансерного наблюдения и учету контингентов противотуберкулезных учреждений.

В микробиологических лабораториях противотуберкулезной службы используется схема, предусматривающая не менее чем 3-хкратное в течение 3 последовательных дней исследование мокроты или другого диагностического материала. У впервые выявленных больных (особенно с малыми клиническими формами процесса) желательно по возможности повысить кратность исследования до 4-5, так как подобная практика увеличивает число положительных результатов.

Эффективность бактериологических исследований непосредственно зависит от качества диагностического материала. В случаях, если в направлении на исследование указана мокрота, именно этот патологический материал должен быть доставлен и исследован в лаборатории. Материал в виде слюны не должен подменять мокроту.

Никакая хорошо работающая лаборатория не компенсирует плохого качества диагностического материала.

2.1.2. Флаконы для сбора материала

Материал для исследования на кислотоустойчивые микобактерии собирают в стерильные флаконы с удобными, плотно завинчивающимися крышками. Применение герметизированных флаконов преследует двоякую цель:

- предотвращение просачивания содержимого и загрязнения окружающей больного среды чрезвычайно стойкими к физическим воздействиям микобактериями и

- предохранение сохраняющегося во флаконе исследуемого материала от загрязнения широко распространенными вегетирующими в окружающей среде кислотоустойчивыми микобактериями.

В связи с этим флаконы для сбора качественного диагностического материала должны отвечать ряду обязательных требований:

- должны быть изготовлены из ударостойкого материала, не допускающего просачивания жидкости; желательно по возможности использовать флаконы одноразового применения, изготовленные из материала, легко поддающегося плавлению при автоклавировании или сжигании;

- должны иметь плотно завинчивающиеся или герметически закрывающиеся крышки;

- объем флаконов должен составлять 20-50 мл, что вполне достаточно для проведения всех видов исследований;

- флаконы должны иметь широкое отверстие для сбора мокроты (не менее 35 мм в диаметре), чтобы пациент мог легко сплевывать мокроту внутрь флакона, не подвергая загрязнению наружную поверхность;

- флаконы должны быть изготовлены из прозрачного материала чтобы можно было оценить количество и качество собранной пробы, не открывая крышку;

- материал, из которого изготовлены флаконы, должен легко подвергаться маркировке и надежно сохранять ее на всем протяжении периода хранения, транспортировки и проведения исследования.

При отсутствии одноразовых контейнеров можно применять толстостенные флаконы из стекла (карманные плевательницы).

При многоразовом использовании флаконы стерилизуют в автоклаве, удаляют остатки содержимого, тщательно моют, помещают в них стеклянные бусы для гомогенизации мокроты и повторно стерилизуют.

Примененяя флаконы многоразового пользования, во избежание лабораторного загрязнения диагностического материала лаборатория должна постоянно контролировать качество мытья и стерилизации флаконов.

2.1.3. Правила сбора диагностического материала

Для получения оптимальных результатов при исследовании диагностического материала необходимо соблюдать следующие условия:

- сбор материала необходимо производить до начала химиотерапии, так как даже несколько дней применения лекарственной терапии может убить значительное количество кислотоустойчивых микобактерий или снизить их жизнеспособность и исказить результаты исследования;

- материал для исследования должен собираться рано утром сразу после подъема пациента;

- при исследовании мокроты желательно собрать не менее 3 проб утренней мокроты в течение 3 последовательных дней. Это существенно повышает результативность исследования;

- собранный материал необходимо как можно быстрее доставить в лабораторию; в случае невозможности немедленной доставки материал сохраняется в холодильнике при 4-10°С;

- при перевозке материала необходимо особенно тщательно следить за сохранностью флаконов и правильностью их маркировки.

2.1.4. Виды диагностического материала

Так как наиболее частой формой туберкулезного поражения является туберкулез органов дыхания, основной материал исследования составляют мокрота и другие виды отделяемого трахеобронхиального дерева.

При легочных формах туберкулеза чаще всего исследуют следующие материалы: мокроту; отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозольных ингаляций; промывные воды бронхов; бронхоальвеолярные смывы; материал, получаемый при бронхоскопии, транстрахеальной и внутрилегочной биопсии; аспират из бронхов; ларингеальные мазки; экссудаты; мазки из торакальных ран; промывные воды желудка (преимущественно у детей).

Мокрота. У пациентов, выделяющих мокроту в достаточном количестве, для исследования собирают ее утреннюю порцию. Качественным материалом можно считать мокроту, имеющую слизистый или слизисто-гнойный характер, а также содержащую плотные белесоватые включения. Желтоватый, серый или бурый цвет мокроты позволяет предположить диагностическую ценность материала. Достаточный объем исследуемой порции мокроты составляет 3-5 мл, однако допустимо исследование и меньших по объему порций. Некоторые больные выделяют микобактерии нерегулярно, поэтому в целях повышения информативности практикуется повторное (до 3 раз) исследование мокроты. Такая тактика позволяет повысить число положительных находок.

Сбор мокроты для исследования на кислотоустойчивые микобактерии - весьма ответственный этап диагностической процедуры, от четкости проведения которого во многом зависит результат исследования.

При сборе мокроты необходимо иметь в виду, что в момент ее откашливания создается высокий риск воздушно-капельного распространения инфекции. В связи с этим желательно, чтобы сбор мокроты производился в специально выделенном для этих целей отдельном хорошо вентилируемом помещении, оснащенном бактерицидной лампой и средствами дезинфекции, или на открытом воздухе. В промежутках между посещениями отдельных пациентов помещение должно хорошо вентилироваться, чтобы избежать или значительно снизить риск нозокомиального инфицирования.

Сбор мокроты должен производиться в присутствии и при непосредственном участии медицинского работника. Лицам, ответственным за сбор мокроты, необходимо руководствоваться следующими правилами:

1. Лицам, ответственным за сбор мокроты, следует объяснить пациенту причины исследования и необходимость откашливать не слюну или носоглоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей, что достигается в результате продуктивного кашля, возникающего после нескольких глубоких вдохов.

2. Необходимо предупредить пациента, что он должен предварительно почистить зубы и прополоскать полость рта кипяченой водой, что позволяет механически удалить основную часть вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатки пищи, загрязняющие мокроту и затрудняющие ее обработку.

3. Участвующий в сборе мокроты медицинский работник в маске резиновых перчатках и резиновом фартуке должен находиться за спиной пациента, выбирая свое положение таким образом, чтобы направление движения воздуха было от него к пациенту. Медицинский работник должен открыть стерильный флакон для сбора мокроты снять с него крышку и передать его пациенту.

4. Стоя позади пациента, следует рекомендовать ему держать флакон как можно ближе к губам и сразу же сплевывать в него мокроту по мере ее откашливания. Выделение мокроты усиливается после одного или нескольких глубоких вдохов.

5. По завершении сбора мокроты медицинский работник должен закрыть флакон крышкой, оценить количество и качество собранного материала, занести эти данные в направление. Флакон с собранной порцией мокроты тщательно закрывают завинчивающейся крышкой, маркируют и помещают в специальный бикс или ящик для транспортировки в лабораторию.

Если же пациент не выделяет мокроту или выделяет ее только эпизодически и в скудном количестве, то накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты следует дать больному отхаркивающее средство или применить раздражающие ингаляции. Собранный таким образом материал не подлежит консервации и должен исследоваться в день сбора.

Для аэрозольных ингаляций пользуются портативными или стационарными аэрозольными ингаляторами. Для ингаляций рекомендуется раствор, в 1 л которого содержится 150 г хлорида натрия (NaCl) и 10 г двууглекислого натрия (Na2CO3). Для приготовления раствора используется стерильная дистиллированная вода. Для провокации мокроты необходимо вдохнуть на протяжении 10-15 минут от 30 до 60 мл подогретой до 42-45°С смеси. Так как вдыхаемый во время процедуры ингаляции раствор вызывает усиленную саливацию еще до появления кашля и отделения мокроты, в первые минуты после завершения процедуры ингаляции пациент должен сплюнуть слюну в специально приготовленный лоток с 5% раствором хлорамина (или другого дезинфицирующего средства) и только после этого собрать мокроту для исследования.

В связи с тем, что аэрозольная ингаляция вызывает выделение водянистого секрета, напоминающего по консистенции слюну, во избежание выбраковки материала в бланке направления и на флаконе с материалом должна быть обязательная маркировка, указывающая на то, что материал получен после аэрозольной ингаляции.

У большинства пациентов после аэрозольной ингаляции в течение нескольких часов наблюдается остаточная гиперсекреция бронхиального отделяемого, поэтому пациенту рекомендуется в течение суток после ингаляции собрать мокроту для второго исследования.

При отсутствии мокроты, невозможности проведения аэрозольной ингаляции или безуспешности этой процедуры для исследования на микобактерии берут промывные воды бронхов или желудка.

Промывные воды бронхов. Сбор промывных вод бронхов производится врачом-отоларингологом. Пациенту во время вдоха вводят шприцем в трахею 5-7 мл стерильного изотонического раствора, который вызывает кашлевой рефлекс. При этом вместе с изотоническим раствором откашливается секрет из глубоких отделов бронхиального дерева. Промывные воды бронхов собирают в стерильный флакон и немедленно направляют в лабораторию.

Пациентам с выраженным глоточным рефлексом указанную процедуру производят после предварительной анестезии надгортанника, гортани и задней стенки глотки.

При отсутствии мокроты или невозможности ее получения наиболее ценными диагностическими материалами являются получаемые при бронхологическом исследовании аспираты из трахеи и бронхов, бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛ), а также материалы прицельной катетер- и щеточной биопсии.

Промывные воды желудка исследуют преимущественно у детей младшего возраста, которые плохо откашливают мокроту и часто проглатывают ее. Во избежание смешивания проглоченной мокроты с пищей промывные воды желудка следует брать натощак. Последний прием пищи должен быть не менее чем за 12 часов до взятия промывных вод желудка. Перед сбором материала для нейтрализации желудочного содержимого больному дают выпить 100-150 мл раствора питьевой соды (1 чайная ложка соды на 1 стакан воды), приготовленного на стерильной дистиллированной воде для исключения возможности попадания в желудок кислотоустойчивых сапрофитов, которые могут содержаться в водопроводной воде. После этого вводят желудочный зонд и собирают содержимое желудка в стерильный флакон. Материал немедленно доставляют в лабораторию и подвергают обработке, чтобы исключить повреждающее влияние на возбудителя содержащихся в материале желудочных ферментов.

Особенно результативен метод получения промывных вод желудка в сочетании с предварительной аэрозольной ингаляцией. Промывные воды желудка следует собирать через 30 мин после аэрозольной ингаляции. Такая комбинация двух указанных методов дает значительно больший процент положительных результатов, чем каждый из них в отдельности. Этот метод получения диагностического материала может оказаться полезным также у пациентов с подавленным кашлевым рефлексом, у которых не удается получить материал даже при провоцирующих ингаляциях.

При внелегочных формах заболевания микобактерии могут поражать практически любой орган, поэтому для исследования пригоден самый разнообразный материал: спинномозговая, плевральная, перикардиальная, синовиальная и асцитическая жидкость, кровь, гной, пунктаты костного мозга, резецированные ткани, гнойно-некротические массы, соскобы синовиальных оболочек биопсийный материал лимфатическим узлов.

При внелегочных формах процесса можно выделить 2 группы диагностических материалов:

- асептически полученный материал, обычно свободный от загрязняющей сопутствующей микрофлоры, и

- заведомо загрязненный материал из открытых очагов поражения, в отношении которого заранее известно, что он контаминирован сопутствующей микробной флорой или собран без соблюдения правил асептики.

Все жидкие материалы подлежат обязательному центрифугированию.
Все последующие манипуляции выполняются с полученным осадком

Все жидкие материалы во избежание свертывания сразу же после их получения переносят в стерильный флакон и смешивают с равным объемом стерильного 3% раствора лимоннокислого натрия.

Кровь и другие жидкие материалы с большой примесью крови после добавления 3% раствора лимоннокислого натрия центрифугируют при 3000 g, и осадок 3 раза отмывают стерильной дистиллированной водой.

Если асептически собранный жидкий материал не может быть немедленно доставлен в лабораторию, к нему добавляют стерильный 10% раствор щавелевокислого калия из расчета 0,01-0,02 мл на 1 мл материала или гепарин из расчета 0,2 мг на 1 мл.

Асептически собранный тканевый материал чаше всего состоит из полученных при биопсиях или оперативных вмешательствах резецированной ткани того или иного органа, гнойно-некротических масс, грануляций, соскобов синовиальных оболочек, лимфатических узлов или пунктатов их содержимого. Материал помещается в стерильный флакон без консервантов и немедленно доставляется в лабораторию. Если материал не может быть немедленно доставлен в лабораторию, во избежание высыхания к нему добавляется небольшое количество стерильного изотонического раствора, и он помещается в холодильник при 4-10°С или во флакон с сухим льдом.

Асептически собранный материал засевается на питательные среды без предварительной деконтаминации.

В случаях, когда неизвестно, насколько при сборе материала соблюдались правила асептики, желательно перенести его в стерильную ступку со стерильным песком, тщательно измельчить стерильными ножницами, добавить 0,5-1,0 мл стерильного изотонического раствора и энергично растереть до получения гомогенной массы, постепенно доведя объем добавляемого изотонического раствора до 4-5 мл. Полученная масса отстаивается в течение 1-2 минут и затем отбирается надосадочная жидкость. Половину полученной жидкости без обработки засевают на питательные среды и используют для приготовления мазка. Вторую половину деконтаминируют по стандартному методу и также засевают на питательные среды.

Заведомо загрязненные материалы. К этой категории относится большинство ниже перечисленных материалов, а также основной и наиболее доступный при мочеполовом туберкулезе материал - моча.

Моча (средняя часть утренней порции или вся утренняя порция) собирается в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Анализ мочи на микобактерии должен предусматривать обязательное троекратное исследование. В лаборатории мочу центрифугируют, используя метод накопления осадка. Особенностью существования М.tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000 g всего материала а не его донной фракции, получаемой после отстаивания в естественных условиях.

Сбор суточной мочи для бактериологического исследования не практикуется. Это объясняется тем, что при накоплении мочи в течение суток невозможно сохранить ее стерильность. Хранение емкости с мочой в холодном месте может привести к выпадению солей, что неблагоприятно отражается на последующей обработке осадка. Кроме того, в моче содержатся бактерицидные продукты, которые могут не только угнетать жизнеспособность микобактерий, но в течение суток даже разрушать микробные клетки. В то же время при длительном хранении мочи невозможно избежать размножения в ней гнилостной и гноеродной микрофлоры. Установлено, что при хранении мочи более 1 часа после сбора число микробных клеток неспецифической гноеродной и гнилостной микрофлоры увеличивается в несколько раз. Ферменты жизнедеятельности этой флоры могут угнетать способность микобактерий к росту. И, наконец, при сборе мочи в течение длительного времени следует иметь в виду возможность попадания в нее кислотоустойчивых сапрофитов, что может привести к диагностическим ошибкам. В этом отношении особенно осторожно должны оцениваться результаты исследования мочи, полученной от мужчин, так как в ней могут обнаруживаться Mycobacterhim smegmatis и другие нетуберкулезные микобактерии, которые ошибочно могут быть приняты за микобактерии туберкулеза.

Менструальная кровь. Исследование менструальной крови требует особого методического подхода. Наличие в этом материале большого количества протеолитических, фибринолитических и других ферментов обусловливает необходимость незамедлительной доставки материала в лабораторию и тщательной его обработки, так как менструальная кровь, с одной стороны, является весьма подходящим материалом для развития гноеродной и гнилостной флоры, а с другой - благодаря обилию ферментов, неблагоприятно влияет на жизнеспособность микобактерий. Менструальную кровь следует собирать не тампоном, а вакуумным отсосом или колпачком Кафки. Исследуют ее так же, как кровь или другие материалы с примесью крови.

Каловые массы собирают в стерильную посуду. Для посева небольшое количество кала (1 г) измельчают в ступке с 3-5 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, центрифугируют и исследуют полученный осадок. Бактериологическое исследование кала производят редко, так как обычно положительный результат получить не удается.

Если у больного заподозрена внелегочная форма туберкулеза, помимо других видов диагностического материала желательно также исследовать и мокроту, так как это существенно повышает частоту выявления сочетанных легочных и внелегочных форм туберкулеза.

Противотуберкулезные препараты или их активные метаболиты в ходе химиотерапии могут присутствовать в диагностическом материале и влиять на высеваемость микобактерий. Большинство противотуберкулезных препаратов выводится из организма с мочой, поэтому можно встретить рекомендации по отмене препаратов на 2-3 суток перед сбором материала для того, чтобы секретирующие клетки и мочевыводящие органы полностью очистились от лекарственных средств. Однако такая отмена должна быть рациональной, основанной на фармакокинетике препарата или его производных. Для исключения влияния химиопрепаратов в диагностическом материале на рост микобактерий рекомендуется использовать процедуру отмывки осадка материала дистиллированной водой или стерильным физиологическим раствором.

Исследование поверхностей различных материалов применяется для контроля качества дезинфекционных мероприятий, а также при обследовании очагов туберкулезной инфекции в эпидемиологических целях. Метод основан на определении загрязненности поверхностей различных предметов микобактериями путем взятия смывов стерильным тампоном из мелкопористой поролоновой губки размером 15 мм х 15 мм х 15 мм.

Наиболее опасными объектами, подлежащими обязательному исследованию на загрязненность микобактериями, являются поверхности, находящиеся в зоне дыхания больного в палатах, кабинетах и местах наибольшего скопления больных (туалетах, процедурных кабинетах), а также оборудование кабинетов для ингаляций, бактериологических лабораторий, кабинетов для сбора мокроты.

Перед проведением смывов необходимо определить, с каких предметов они будут взяты и в каком количестве. Площадь исследования поверхности материала зависит от вида этого материала (см. Таблицу 1).

Таблица 1

Параметры исследования поверхностей различных материалов

Группа	Материал	Минимальная площадь смыва	Необходимое кол-во смывов
I	Стекло, металл, эмаль, керамика	500 cм2	5
II	Поверхности, покрытые синтетическими лаками, масляной, водоэмульсионной и другими красками	1000 см2	10
III	Пластмасса, полистирол, плексиглас, линолеум, кожзаменитель	1500 см2	15
IV	Хлопчатобумажные и шерстяные ткани	2000 cм2	20

На однократное исследование требуется 45-50 тампонов. Одним тампоном берут смыв в одной точке площадью 100 см2 (например, с квадрата 10 см х 10 см). Для взятия смывов используют стерильные трафареты из алюминиевой или другой металлической проволоки размером 10 см х 10 см. Если площадь исследуемого объекта меньше 100 см2, то смыв берут одним тампоном с нескольких предметов, изготовленных из одного материала: с двух вентилей кранов, с трех дверных ручек и т.п. Для исследования предметов, имеющих изогнутую поверхность (раковина и т.п.), однократно используют гибкие бумажные трафареты.

При заборе материала стерильный поролоновый тампон берут стерильным пинцетом, погружают в пробирку с 5 мл 5% раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия, слегка отжимают о внутреннюю стенку пробирки и производят смыв с поверхности предмета, после чего тампон снова погружают в смачивающий раствор. Пинцет перед очередным смывом стерилизуют обжиганием над пламенем спиртовки. Пробирки маркируют и отправляют в лабораторию с сопроводительной документацией, где указывают дату проведения исследования, название учреждения и предметы, с которых взяты смывы.

2.2. Консервация и транспортировка диагностического материала

Собранный диагностический материал должен как можно быстрее централизованно доставляться в лабораторию. Доставка должна осуществляется 1 или 2 раза в неделю при условии обязательного сохранения материала в промежутках между доставками в холодильнике или с применением консервантов. Флаконы до момента отправки хранятся в отведенном для этих целей холодильнике или специальном контейнере, который по окончании каждого рабочего дня опечатывается и запирается.

2.2.1. Консервация

Диагностический материал, подлежащий в дальнейшем культуральному исследованию, не должен сохраняться в холодильнике (4-8°С) более 48-72 часов без применения консервирующих средств.

Наиболее приемлемые результаты достигаются при использовании одного из перечисленных ниже консервантов, которые добавляются к собранной мокроте в двукратном объеме:

 - 10% водный раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия    - 3-5

   (Na3PO4)                                                     суток;

 - 0,05-0,1% раствор хлоргексидина биглюконата (ХГГ)            - 3-5

                                                                суток;

 - 2-3% раствор борной кислоты                                  - до 3

                                                                суток;

При использовании перечисленных консервантов материал сохраняется при комнатной температуре. Однако для снижения их токсичности в отношении микобактерий пробы рекомендуется сохранять в холодильнике при температуре от 4 до 8°С.

В день поступления материала в лабораторию консервированный материал центрифугируют, не подвергая обычной процедуре предварительной обработки. Осадок при необходимости нейтрализуют и засевают на питательные среды, одновременно приготавливая мазки для световой или люминесцентной микроскопии.

2.2.2. Транспортировка

Во время транспортировки диагностический материал должен предохраняться от воздействия прямых солнечных лучей и тепла. В летний период (особенно в районах с теплым климатом) консервация необходима, если транспортировка занимает более 24 часов. В условиях Крайнего Севера диагностический материал при длительной транспортировке может подвергаться воздействию значительных колебаний температуры. При этом необходимо иметь в виду, что допускается пересылка материала в замороженном состоянии без консервации. Однако ни в коем случае нельзя допускать повторное замораживание после оттаивания материала, так как это способствует снижению жизнеспособности микобактерий.

Для транспортировки материала рекомендуется пользоваться биксами или специальными транспортировочными ящиками (контейнерами) с мягкими легко стерилизующимися прокладками на дне или с прокладками для флаконов или пробирок. Флаконы или пробирки (желательно пластиковые одноразового использования) с диагностическим материалом должны быть плотно закупорены или снабжены завинчивающимися крышками с прокладками.

Во избежание протечки жидких материалов и нарушения целости флаконов они должны быть закреплены в транспортировочных ящиках в вертикальном положении и снабжены прокладками, предохраняющими их от повреждения. Прокладки должны быть выполнены из материалов, обладающих высокой адсорбционной способностью с тем, чтобы в случае протечки они могли адсорбировать жидкость и ограничить участок загрязнения в пределах транспортировочного контейнера.

Мазки для микроскопического исследования транспортируются в специальных планшетах. Для предохранения от перекрестной контаминации они не должны соприкасаться друг с другом.

Каждая проба материала должна быть промаркирована и иметь индивидуальное направление, а вся партия - заполненный сопроводительный лист. Последний заполняется в 2-х экземплярах: один заполненный и подписанный сотрудником, ответственным за отправку материала, остается в лаборатории, второй экземпляр с подписью сотрудника, принявшего материал для исследования, возвращается в учреждение, направившее материал.

Во избежание инфицирования сопроводительного листа и бланков индивидуальных направлений желательно помещать их в чистый конверт или полиэтиленовый пакет и передавать непосредственно в руки водителю автотранспорта, а затем медицинскому работнику, принимающему материал.

Категорически запрещается заворачивать флакон с материалом в бланк направления, что необходимо объяснить больным и медицинскому персоналу, занятому сбором, подготовкой и транспортировкой проб

На всех этапах сбора, оформления сопроводительных документов, хранения и транспортировки материала сотрудники лаборатории должны проводить инструктаж лиц, непосредственно ответственных за сбор диагностического материала, контролировать его качество, правильность консервации и транспортировки и своевременность доставки в лабораторию.

При поступлении материала, не отвечающего вышеуказанным требованиям, а также при отсутствии направления или маркировки (этикетки) на флаконе с материалом он подлежит уничтожению с обязательным извещением об этом учреждения, направившего материал. Перечисленные вопросы находятся в компетенции руководителя лаборатории.

Обычно используют один из следующих принципов централизованной доставки диагностического материала:

- автотранспортом лаборатории "на себя" или

- автотранспортом обслуживаемого учреждения "от себя".

В обоих случаях должен быть составлен и согласован график транспортировки материала. Водитель машины должен быть обучен правилам обращения с инфекционным материалом, иметь флакон с дезинфицирующим средством и ватные тампоны на случай аварийной протечки материала.

График работы сотрудников лаборатории должен предусматривать прием, регистрацию и немедленную обработку доставленного машиной контейнера, а также выдачу взамен стерильной посуды и пр. Возможна передача ответов предыдущих анализов.

Перед отправлением транспортного средства, перевозящего материал, а также при приеме доставленного материала в лаборатории обязательна проверка следующих положений:

- число доставленных в лабораторию флаконов с материалом должно соответствовать их числу, указанному в сопроводительном листе;

- идентификационный номер пробы материала должен быть нанесен на этикетку или боковую поверхность контейнера с материалом; во избежание ошибок при последующих манипуляциях не допускается нанесение маркировки на крышку флакона;

- идентификационный номер маркировки каждого флакона с материалом должен точно соответствовать номеру, указанному в сопроводительном листе;

- каждая проба материала должна иметь заполненный бланк направления с указанием характера необходимого исследования;

- каждая партия материала должна иметь сопроводительный лист, в котором должны быть указаны необходимые данные каждого пациента (см. Приложение N 10 (приложение N 3) настоящего приказа):

- необходимые данные каждого пациента;

- отметки об удаленных и некачественных пробах;

- дата и время отправки материала;

- дата и время получения материала;

- подпись сотрудника, ответственного за отправку;

- подпись сотрудника, принявшего материал для исследования.

2.3. Хранение и транспортировка культурального материала

Выделенные из диагностического материала культуры микобактерий должны быть доставлены из бактериологических лабораторий 1-го уровня в лаборатории 2-го или 3-го уровня для дальнейшей дифференциации, видовой идентификации, определения лекарственной чувствительности.

Отобранные в пробирках культуры проверяют на кислотоустойчивость и по срокам роста. Пробирки с культурой проверяют на отсутствие сколов и трещин, маркируют дважды несмывающимся маркером. Плотно укупоренной герметичной пробкой сохраняют всю пробирку целиком с косяком среды и культурой. Хранение осуществляют в специально отведенном для этих целей холодильнике, снабженного замком и опечаткой, при 4-6°С. В таком виде культура микобактерий на косяке плотной питательной среды сохраняет свою жизнеспособность более месяца.

Каждая промаркированная пробирка с культурой должна сопровождаться специально разработанным бланком, на котором отмечены:

- данные учреждения-отправителя;

- индивидуальный лабораторный номер (маркировка);

- паспортные данные на пациента;

- регистрационный районный номер;

- цель исследования;

- режимы лечения название материала;

- дата посева и дата снятия материала;

- данные по кислотоустойчивой окраске выделенной культуры;

- скорость и массивность роста на каждой из использованных питательных сред;

- название питательной среды в передаваемой пробирке;

- окраска колоний.

Подлежащий пересылке собранный культуральный материал оформляют в виде партии отправки и сопровождают документом на всю партию подобно транспортировочному бланку на диагностический материал. Этот документ должен включать:

- данные учреждения-отправителя;

- данные учреждения-получателя;

- данные на больного и соответствие маркировок пробирок;

- дату выборки, после которой культура была направлена на хранение в холодильнике (дата снятия культуры).

- дата и время отправки материала;

- дата и время получения материала;

- подпись сотрудника, ответственного за отправку;

- подпись сотрудника, принявшего материал для исследования.

Партию культурального материала упаковывают согласно санитарным правилам (СП 1.2.036-95) Госкомсанэпиднадзора России. Транспортировочный контейнер маркируют знаком "Биологическая опасность". Для свободного перемещения необходимо оформить сопроводительное письмо на официальном бланке. Организация-отправитель должна сообщить срочной связью получателю дату и вид транспорта, которым отправлена посылка. При необходимости для исключения всех видов досмотра и контроля оформляют справку по специальной форме вышеуказанных санитарных правил.

При транспортировке культурального материала соблюдают температурный режим от +1° до +30°С, бережное обращение с грузом, вертикальное положение. Порядок транспортировки, инструктаж, оформление поступающей и отправляемой сопроводительной документации аналогичен транспортировке диагностического материала.

2.4. Правила работы с диагностическим материалом

2.4.1. Общие правила устройства лаборатории

При организации микробиологических исследований необходимо руководствоваться санитарными правилами Российской Федерации и помнить, что к работе с возбудителем туберкулеза допускаются учреждения, имеющие специальное разрешение на работу с микроорганизмами III-IV группы патогенности. Это связано с высоким риском заболевания среди сотрудников микробиологических подразделений. Устройство лаборатории, расположение и организация рабочих мест должны предотвращать как развитие внутрибольничной туберкулезной инфекции, так и контаминацию рабочих мест, а также обеспечивать необходимые меры безопасности при работе персонала с возбудителем туберкулеза.

Необходимые мероприятия должны включать:

а) административные меры, предотвращающие распространение инфекционных аэрозолей из загрязненных зон в неинфицированные помещения лаборатории и лечебного учреждения в целом;

б) инженерные (проектные и технические) мероприятия, направленные на снижение концентрации инфекционных аэрозолей в воздухе (принудительная вентиляция, использование специализированных устройств обеззараживания воздуха);

в) меры персональной защиты органов дыхания персонала (защитные маски, респираторы). Указанные меры приведены в последовательности убывания их эффективности. Например, персональная респираторная защита малоэффективна при отсутствии административных мер и мер, направленных на снижение концентрации инфекционных аэрозолей в воздухе рабочих помещений.

Административные меры включают:

- разделение лаборатории на заразную и чистую зоны; создание эпидемиологической цепочки последовательного движения исследуемых материалов в процессе приема, обработки и исследования;

- соответствующее назначение помещений лаборатории; соблюдение норм санитарно-гигиенических мероприятий и выбор адекватных дезинфицирующих средств, имеющих соответствующую документацию, регламентирующую методы применения средств в лабораториях противотуберкулезных учреждений;

- образовательную подготовку персонала, включающую представление о путях трансмиссии микобактерий туберкулеза и мерах профилактики;

- соблюдение правил сбора материала (в первую очередь, мокроты);

- выбор методик, сокращающих время работы с заразным материалом и повышающих безопасность лабораторных манипуляций.

Инженерные меры. По мере возрастания сложности инженерные мероприятия условно делятся на следующие группы:

1) удаление и обмен воздуха в помещениях путем естественной вентиляции, что допустимо лишь для неинфицированных помещений;

2) организация принудительной вентиляции воздуха в помещениях и на рабочих местах (общая и локальная вентиляция), исключающей попадание инфекционного аэрозоля в коридоры и другие смежные помещения;

3) удаление или обеззараживание инфекционного аэрозоля, находящегося в воздухе помещений, с использованием технических средств (фильтрация воздуха, воздействие на микроорганизмы, приводящее к их уничтожению и гибели).

Общая принудительная вентиляция (приточная, вытяжная или приточно-вытяжная) должна обеспечивать удаление загрязненного (инфицированного) воздуха из помещения и отсутствие в помещениях застойных зон.

Локальная вентиляция должна обеспечивать удаление инфицированного воздуха из зоны роботы с инфекционным материалом и поступление чистого (неинфицированного) воздуха. Она может осуществляться с помощью локальных вытяжных зонтов, колпаков, вытяжек и других технических устройств. При работе с инфекционным материалом локальные вытяжные установки должны быть оснащены бактерицидными фильтрами или другими устройствами, предотвращающими выброс инфекционного аэрозоля наружу.

Обеззараживание воздуха и системы рециркуляции воздуха внутри помещений. Системы обеззараживания воздуха должны обеспечивать снижение концентрации инфекционного аэрозоля в воздухе и поддержание ее на заданном нормативными документами уровне. Устройства обеззараживания воздуха могут использоваться как в системе общей вентиляции, так и в автономных устройствах рециркуляции воздуха в помещении. Их использование должно осуществляться в строгом соответствии с инструкциями. Например, эффективность работы ультрафиолетовых облучателей снижается во много раз при облучении загрязненных поверхностей, высокой влажности воздуха (после влажной уборки).

При использовании фильтрующих устройств необходимо контролировать состояние фильтров и осуществлять их своевременную замену и утилизацию. Кроме того, такие устройства должны гарантировать высокую эффективность фильтрации инфекционного аэрозоля и во избежание возможности вторичного попадания отфильтрованного инфекционного аэрозоля в воздух помещения должны работать непрерывно.

Устройства, инактивирующие микроорганизмы, должны обеспечивать разрушение микробных клеток в процессе обработки воздуха и не оказывать отрицательного влияния на воздушную среду, материалы, оборудование и человека.

В связи с этим такие установки должны иметь необходимые документы, разрешающие их использование в противотуберкулезных учреждениях, а также методическую документацию по правилам эксплуатации и рекомендации по их использованию в помещении. К числу таких систем относятся шкафы биологической защиты (ламинарные шкафы), фильтрующие или обеззараживающие устройства и/или приборы, сочетающие указанные функции.

Индивидуальная защита органов дыхания. Защитные персональные маски типа матерчатых или бумажных хирургических предотвращают распространение микроорганизмов, захватывая крупные жидкие частицы около рта или носа, но не обеспечивают защиту от вдыхания подсохших капельных ядер аэрозолей.

Респираторы - это специальные виды масок безопасности. Они плотно прилегают к лицу, предотвращая просачивание воздуха через боковые отверстия. Медицинским работникам противотуберкулезных учреждений и лабораторий рекомендуется использовать респираторы, обеспечивающие 95%-ную задержку аэрозольных частиц диаметром 0,3 мкм. Эффективность респираторов снижается при увлажнении и загрязнении, поэтому их хранят завернутыми в чистую ткань, а не в сохраняющих влагу пластиковых пакетах.

2.4.2. Правила приема диагностического материала

Поступающие для исследования пробы материала принимают на отдельном столе, соблюдая следующие правила:

- прием поступающих проб и их осмотр следует, по возможности, проводить в одноразовых перчатках и масках;

- перед тем, как открыть транспортировочный контейнер, необходимо протереть его наружную поверхность тампоном, смоченным соответствующим дезинфицирующим средством (например, 5% раствором хлорамина или гипохлорита);

- аккуратно открыть крышку контейнера и проверить, нет ли следов протечки материала на поверхности флаконов. Ни в коем случае не использовать поврежденные флаконы (разбитые или с трещинами) - уничтожить их (автоклавирование или кипячение) и запросить новый образец, отметив в сопроводительном бланке;

- проверить наличие идентификационных номеров на флаконах с материалом и сверить их с номерами в сопроводительных документах;

- продезинфицировать внутреннюю поверхность транспортировочного контейнера;

- после работы с флаконами уничтожить одноразовые перчатки и вымыть руки с мылом;

- выдать водителю обменную стерильную посуду;

- подписать сопроводительные документы;

- занести в регистрационный лабораторный журнал сведения о каждом пациенте и полученном от него материале.

Бланки направлений следует подвергнуть направлений стерилизации в сухожаровом шкафу в течение 30 минут при 85°С.

2.4.3. Оценка качества и количества мокроты

При исследовании мокроты пациентов с подозрением на туберкулез понятие "качественная мокрота" имеет конкретное определение. Качественной является свежевыделенная мокрота из глубоких отделов дыхательных путей с минимальными примесями слюны или носоглоточной слизи. Наилучшим для исследования считают образец мокроты, в котором имеются слизистые или слизисто-гнойные комочки, белесоватые включения. Сероватый, желтоватый или бурый цвет мокроты также может характеризовать качественный материал. Для исследования достаточно 3-5 мл мокроты, но хорошие результаты могут быть получены и при исследовании меньших объемов мокроты.

Индуцированная, т.е. полученная при аэрозольных ингаляциях или других манипуляциях, мокрота напоминает по внешнему виду и консистенции слюну. Важно, чтобы этот материал по ошибке не был удален как непригодный для исследования. Поэтому в сопроводительном документе необходимо отмечать, каким образом получен материал для анализа.

2.4.4. Техника безопасности при работе с диагностическим материалом

При работе с заразным материалом необходимо иметь в виду, что работа с диагностическим материалом является одним из самых опасных этапов микробиологического исследования. Туберкулез распространяется воздушно-капельным путем через содержащие возбудитель мельчайшие аэрозольные частицы, диаметр которых составляет 1-5 мкм. Именно эти мельчайшие частицы составляют ту фазу аэрозоля, которая способна при дыхании проникать в легочные альвеолы и оседать в них, формируя начало инфекционного процесса. В лабораторной работе усилия должны быть направлены на то, чтобы избежать или свести к минимуму опасность заражения во время тех манипуляций, при выполнении которых наблюдается наибольшая вероятность образования и рассеивания потенциально опасных инфекционных аэрозолей.

В лабораториях основными источниками образования инфекционных аэрозолей являются манипуляции, связанные с обработкой зараженного материала

Аэрозоли могут образовываться при выполнении следующих манипуляций:

- открывание флаконов с материалом; эта манипуляция особенно опасна, если между наружной стенкой горлышка флакона и внутренней поверхностью крышки находятся частицы высохшей мокроты или если непосредственно перед открыванием флакон подвергался встряхиванию во время транспортировки;

- приготовление мазков путем нанесения материала на предметное стекло и распределение его по поверхности стекла;

- прожигание над пламенем горелки неочищенных от остатков материала бактериологических петель;

- попытки фиксировать над горелкой невысохший влажный мазок, что приводит к вскипанию и разбрызгиванию частичек материала;

- работа с жидкими культурами или с надосадочной жидкостью;

- забор в пипетку суспензии микроорганизмов, особенно при использовании автоматических пипеток с фиксированным объемом жидкости;

- использование высокоскоростных встряхивателей и центрифуг;

- энергичная инокуляция микробных суспензий в пробирки или флаконы;

- повреждение пробирок при центрифугировании;

- использование ступок при растирании инфицированного материала;

- приготовление суспензий микобактерий для инокулирования (особенно опасно использование ступок для растирания культуры).

При выполнении всех этих манипуляций следует соблюдать особую осторожность, а некоторые желательно исключить из лабораторных технологий.

Для предупреждения случаев внутрилабораторного заражения необходимо свести к минимуму возможность образования аэрозолей. Для защиты лабораторных работников от инфекционных частиц необходимо проводить работу при включенной локальной вытяжной вентиляции (там, где это достаточно) или в специально оборудованных боксах или ламинарных шкафах.

III. Микроскопические исследования для выявления кислотоустойчивых микобактерий

Присутствие кислотоустойчивых микобактерий в клиническом материале может быть установлено при микроскопическом и/или культуральном исследовании. Однако необходимо иметь в виду, что микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать микобактерий комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудителей туберкулеза) от нетуберкулезных ("атипичных") микобактерий - возбудителей микобактериозов.

На основании микроскопического исследования возможно сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микобактерий

Это объясняется тем, что в природе существует большое число нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих микобактериозы, а также кислотоустойчивых сапрофитов, не вызывающих заболевания человека. Микроскопически они неотличимы от Mycobacterium tuberculosis.

Несмотря на указанные недостатки, бактериоскопия остается одним из основных методов микробиологических исследований. Ее преимущество заключается в быстроте получения результата и относительной простоте исследования. Метод позволяет в короткие сроки (от одного часа) обнаружить наиболее эпидемически опасных больных туберкулезом и микобактериозами, выделяющих большие количества микобактерий, и остается актуальным микробиологическим методом при выявлении больных туберкулезом и микобактериозами на первичных этапах обследования больных, а также при динамическом наблюдении за состоянием микобактериальной популяции в процессе лечения. Кроме того, микроскопическое подтверждение тинкториальных свойств культуры остается обязательным исследованием при ее диагностике.

3.1. Подготовка материала для микроскопического исследования на кислотоустойчивые микобактерии

Чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза методами микроскопии, в 1 мл исследуемого материала должно содержаться не менее 10000 микробных клеток. В мокроте больных с туберкулезом органов дыхания (особенно при наличии у них полостей распада легочной ткани) обычно содержится значительное количество кислотоустойчивых бактерий, что позволяет выявить их при микроскопическом исследовании. Однако бактериовыделение не является регулярным процессом, и это требует определенной тактики сбора материала. Чувствительность этого метода можно повысить, если ввести кратность обследования пациента. Установлено, что при последовательных исследованиях результативность микроскопической диагностики туберкулеза органов дыхания повышается следующим образом: при однократном исследовании - 80-83%, двукратном - на 10-14% больше и при исследовании трех проб мокроты - еще на 5-8% больше. Таким образом, при подозрении на туберкулез органов дыхания рекомендуется исследовать не менее трех проб мокроты.

Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте пациента может содержаться меньше микобактерий, чем может выявить микроскопическое исследование

Эффективность бактериоскопии существенно возрастает, если контролируется качество собираемого материала. Нарушение технологий подготовки мазков может быть причиной отрицательного результата микроскопического исследования.

3.2. Приготовление мазков для микроскопических исследований

По способу подготовки материала методы микроскопического исследования условно делят на два вида:

- метод прямой микроскопии, когда мазок приготавливается непосредственно из нативного необработанного диагностического материала или осадка (при исследовании жидкого материала);

- метод микроскопии мазка из осадка материала подготовленного для культурального исследования путем обработки гомогенизирующими и обеззараживающими средствами и последующего центрифугирования.

При соблюдении условий методик, второй метод более информативен примерно на 20-30%, чем прямая микроскопия, так как при подготовке осадка происходит освобождения микробов из окружающей их слизи и обогащение диагностической квоты материала при центрифугировании.

В тех случаях, когда мазок подвергается окраске флюорохромными красителями и исследуется в люминесцентном микроскопе, необходимо иметь в виду, что качественная и эффективная окраска флюорохромными красителями требует обязательного соблюдения кислотности (рН) мазка, а также освобождения микобактерий от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению красителя в микробную клетку. Несоблюдение этих условий приводит к снижению эффективности люминесцентной микроскопии.

При культуральном исследовании мазок и посев производятся обязательно из одной и той же порции материала. Это основное требование правильного микробиологического исследования

3.2.1. Оборудование и реактивы для приготовления диагностических мазков

Перед началом работы оборудование, реактивы и материалы необходимо разместить так, чтобы было удобно работать и в дальнейшем стараться соблюдать этот привычный порядок.

Все манипуляции по приготовлению мазков из диагностического материала должны быть стандартизованными, а для максимальной безопасности все материалы и реагенты всегда должны находиться на одних и тех же постоянных местах и располагаться в одном и том же порядке.

Для приготовления мазков необходимы:

- Флаконы с поступившим в лабораторию исследуемым материалом;

- Деревянные палочки (аппликаторы) или бактериологические петли диаметром 3 мм для забора сгустков мокроты и распределения их на стекле;

- Одноразовые предметные стекла (обезжиренные, без царапин и сколов) ГОСТ 9284-75;

- Несмываемый при окраске маркировочный карандаш для нанесения идентификационного номера на стекло (алмазный карандаш);

- Пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

- Емкость (колба, эксикатор, стеклянная банка и т.д.) с отмытым речным песком, залитым техническим спиртом (70°), для очистки бактериологической петли от остатков материала перед очередной стерилизацией ее в пламени горелки;

- Спиртовка или газовая горелка Бунзена для прокаливания петли;

- Одноразовые или стерильные стеклянные чашки Петри для отбора гнойных комочков материала;

- Стерильные мерные пипетки на 10 мл и 5 мл для переноса мокроты в чашки Петри;

- Лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, для просушивания приготовленных мазков;

- Контейнеры для сбора и последующего автоклавирования инфицированного материала и загрязненной посуды;

- Емкость с дезинфицирующим раствором для обработки поверхности стола или других объектов по окончании работы и при случайном попадании на них диагностического материала;

- Ватные шарики для обработки загрязненных поверхностей дезинфицирующим раствором.

3.2.2. Подготовка предметных стекол

Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси Никифорова (96° этиловый спирт + диэтиловый эфир в соотношении 1:1) стекла без царапин и сколов. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения или обусловливают образование артефактов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов.

Стекла, на которых при микроскопическом исследовании были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, сохраняются в лаборатории в течение 1 года, а затем подлежат обязательному уничтожению и не должны использоваться повторно.

Новые предметные стекла кипятят в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем в проточной воде. Протирают насухо. Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96° этиловым спиртом. Стекла должны подвергаться обезжириванию не менее суток. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо.

3.2.3. Приготовление мазков из нативного материала и необработанного осадка жидких материалов

Если мазок будет окрашиваться по методу Ziehl-Neelsen и исследоваться в световом микроскопе, рН мазка не корригируется.

В случае окраски флюорохромными красителями для исследования в люминесцентном микроскопе перед нанесением материала на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения рН (6,8-7,0). Уровень рН осадка определяют с помощью бумажной индикаторной полоски.

Перед приготовлением мазка на один конец стекла (или его матовую часть) наносят полный номер пробы исследуемого материала, под которым он зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале при приеме материала. Номер наносят с помощью алмазного карандаша или несмываемого маркера с таким расчетом, чтобы в процессе окраски этот номер сохранился.

Не следует касаться чистой поверхности стекла руками или перчатками!

Приготовление мазков для прямой микроскопии из нативной мокроты.

Если материал поступил в емкости, в которой невозможно обнаружить и выбрать частицы для приготовления мазка, его переносят в чашку Петри, под дно которой подложена черная бумага. При этом проявляют известную осторожность, чтобы избежать образования аэрозолей.

Так как в необработанной нативной мокроте микобактерии наиболее часто располагаются в плотных комочках распада тканей, следует иметь в виду, что результат микроскопического исследования в значительной степени зависит от правильности выбора этих гнойных комочков.

При приготовлении мазков наиболее удобно пользоваться деревянной палочкой, которую перед работой разламывают пополам. Затем из разных участков образца мокроты выбирают 2-3 наиболее плотных гнойных небольших комочка, переносят их на стекло, при необходимости разминают и равномерно распределяют тонким слоем в центре стекла на поверхности приблизительно размером 1х2 см в виде овала. Забор комочков производят с помощью сломанных концов палочки, что обеспечивает более надежную фиксацию материала к палочке и облегчает последующее его нанесение на поверхность предметного стекла и приготовление мазка посредством растирания. На одно предметное стекло следует наносить только один мазок.

Использованные для приготовления мазка палочки удаляют в банку с дезинфицирующим раствором или в контейнер с отработанным заразным материалом. Для каждой порции мокроты используется новая чистая палочка!

Практикуется также приготовление мазков с помощью бактериологических петель или препаровальных игл. Удобно пользоваться двумя петлями или иглами. В случае, когда мазок готовят с помощью бактериологической петли, она может быть использована повторно после очистки от остатков мокроты путем 2-3х кратного погружения ее в банку с песком, залитым спиртом, и последующего прожигания в пламени горелки до появления красного цвета. После прокаливания петлю следует охладить, оставив ее на 1-2 минуты в штативе-петледержателе.

Песок для очистки петель может использоваться длительное время при условии периодического обновления раствора спирта с таким расчетом, чтобы его уровень превышал уровень песка не менее чем на 3 см.

Приготовление мазка из осадка необработанного нативного материала.

Такие мазки приготавливают из полученного после центрифугирования осадка любого жидкого диагностического материала (бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка, моча, пунктаты из закрытых полостей, экссудаты). Осадок представляет собой обогащенную фракцию диагностического материала и значительно чаще позволяет получить положительные результаты. Особенностью существования М.tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000 g (см. раздел по культуральным исследованиям данной Инструкции).

Для приготовления мазка, надосадочную жидкость аккуратно удаляют, полученный в пробирке осадок перемешивают и с помощью пипетки наносят на стекло 1-2 капли осадка, распределяя его тонким слоем в центре стекла на площади не менее 1 см х 2 см.

Необходимо иметь в виду, что мазки из осадка жидких материалов (моча, промывные воды бронхов, экссудаты и пр.) легко смываются в процессе окраски. Поэтому мазки из осадка жидких материалов желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным белком.

Для этого белок куриного яйца в течение 30-40 минут взбивают с чистыми стерильными стеклянными бусами в стерильной посуде и оставляют на 1-1,5 часа при комнатной температуре. Затем жидкую часть взбитой смеси отбирают пипеткой, переносят ее в другую посуду и, смачивая в ней ватный тампон, аккуратно наносят ее на чистые обезжиренные предметные стекла, равномерно распределяя по 2/3 их поверхности. 1/3 предметного стекла оставляется необработанной белком для последующего нанесения на нее номера пробы. Обработанные белком стекла раскладывают на чистой фильтровальной бумаге и высушивают при комнатной температуре.

Другим способом закрепления осадка жидкого материала является использование сыворотки крови. На чистом стекле каплю сыворотки смешивают с 1-2 каплями осадка материала и распределяют смесь по стеклу.

3.2.4. Приготовление мазков из осадка диагностического материала, подготовленного для культурального исследования

Культуральное исследование любого диагностического материала обязательно включает параллельное микроскопическое исследование осадка этого материала, полученного после обработки детергентами с последующим отмыванием либо нейтрализацией и центрифугированием.

Все мазки из осадка приготавливают после выполнения процедуры посева!

При этом чаще всего используется та же пипетка, которой производился посев. С помощью этой пипетки на стекло наносят 1-2 капли осадка, который распределяют тонким слоем в центре стекла на площади 1 см х 2 см.

Процедура приготовления мазка из осадка обработанного материала:

1. Оставшийся после посева осадок встряхивают, забирают в пипетку.

2. 1-2 капли осадка наносят на предметное стекло, формируя мазок размером ~ 1 х 2 см.

3. Мазок из осадка жидких материалов (моча, промывные воды и др.) во избежание смывания материала при окраске желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным белком.

При приготовлении мазка для микроскопического исследования необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат.

Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании.

Не рекомендуется готовить мазки способом "растяжки" материала между двух предметных стекол. Такой способ сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля.

Через правильно приготовленный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5-10 см.

Ограниченная площадь мазка (~ 1 см х 2 см в центре стекла) значительно повышает безопасность манипуляции и последующей микроскопии, так как периферические части и ребра предметного стекла остаются незагрязненными инфекционным материалом.

3.2.5. Фиксация мазков

Приготовленные вышеуказанным способом мазки помещают на 15-30 минут на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу или при отсутствии такового - на столе, в специально отведенном месте.

Ни в коем случае не допускается фиксация сырых мазков над пламенем горелки!

При окраске по Ziehl-Neelsen стекла с высохшими мазками пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на который нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать 3-5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку ("рельсы") для окрашивания.

При окраске мазков флюорохромными красителями рекомендуется фиксация в сухожаровом шкафу при 85°С в течение 45 минут. Однако при отсутствии такой возможности допускается фиксация над пламенем горелки.

В плане охраны труда оптимальным является метод, предложенный A.Hain. Этот метод фиксации мазков используется как при окраске по Ziehl-Neelsen, так и люминесцентными красителями. Согласно этому методу, предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при 37°С. Затем температуру повышают до 105°С и, спустя 10 минут, шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105°С, чтобы не изменить тинкториальные свойства микобактерий.

Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться. Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставляться открытыми на ночь, так как это увеличивает опасность распространения.

Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток (поднос), по окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки ежедневно выстилаются чистой бумагой.

3.3. Методы окраски диагностических мазков

Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии) и из осадка обработанного для культурального исследования, используются методы, позволяющие выявлять кислотоустойчивые микроорганизмы:

- окраска по методу Ziehl-Neelsen для исследования в световом микроскопе;

- окраска флюорохромными красителями для исследования в люминесцентном микроскопе.

Люминесцентную микроскопию рекомендуется использовать при большом количестве исследуемых ежедневно мазков (более 30 мазков в день).

3.3.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl-Neelsen

Метод окраски по Ziehl-Neelsen является наиболее распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных методических приемов:

- окраска фуксином (с подогреванием) - при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки. состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий, и последние не окрашиваются;

- обесцвечивание (3 мин.) - последующая обработка мазка 25% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостъю). Только кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы стойко удерживают краситель и остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет;

- контрастирующая окраска (1 мин.) - обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности препарату.

3.3.1.1. Оборудование и реактивы для окраски по методу Zieh-Neelsen

Для окраски мазков по методу Ziehl-Neelsen необходимы:

- Раковина или специальный вместительный лоток для проведения окраски;

- Специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на предметных стеклах;

- Пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

- Газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата (если мазки не фиксированы в сушильном шкафу) и подогревания его при окрашивании карболовым фуксином; или

- Металлический стержень с ватным тампоном, который используется вместо горелки для подогревания препарата при окрашивании карболовым фуксином;

- Фильтровальная бумага размером ~ 4 х 1,5 см. для окраски мазков карболовым фуксином;

- Раствор карболового фуксина;

- 25% раствор серной кислоты или

- 3% раствор солянокислого спирта;

- Дистиллированная вода для промывания мазков;

- 0,3% раствор хлорида метиленового синего;

- Штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

Реактивы:

- Спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

- Кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

- Кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;

- Фенол кристаллический, ГОСТ 6417-72;

- Фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;

- Метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

- Глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;

- Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

3.3.3. Приготовление растворов:

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

- растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2-3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96° этилового спирта.

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор):

- расплавить 5 г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола - 41°С). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100 мл.

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:

- в 90 мл раствора 2 добавить 10 мл раствора 1.

Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:

а) Раствор серной кислоты

К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется.

Никогда не добавляйте воду в кислоту!

б) Раствор солянокислого спирта

Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно использовать 3% солянокислый спирт:

Этиловый спирт 96°                                                  97 мл

Концентрированная соляная кислота                                    3 мл

К 97 мл спирта осторожно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот!

Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:

- растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Хранение растворов. Все приготовленные растворы должны быть профильтрованы через бумажный фильтр и помещены в герметически закрытые емкости из темного стекла. На каждой емкости должна быть надпись с названием содержащегося в ней раствора, датой его приготовления, сроком годности и указанием фамилии специалиста, готовившего раствор. Растворы хранят при комнатной температуре, в темном месте.

Рабочий раствор карболового фуксина может храниться не более 2-х недель, так как после этого срока фуксин начинает выпадать в осадок, что изменяет заданные свойства раствора.

Другие рабочие растворы значительно более стойки при хранении. Однако рекомендуется готовить их одновременно с раствором карболового фуксина, т.е. через каждые 2 недели. Это позволит быть уверенным в качестве используемых красителей.

3.3.1.2. Процедура окраски

- убедитесь, что подготовленные мазки фиксированы и промаркированы;

- препараты помещают на подставку ("рельсы") так, чтобы они не касались друг друга, и расстояние между ними составляло порядка 1 см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону. Максимально на стандартные "рельсы" помещают не более 12 стекол;

- на каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые микобактерии;

- наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку микобактерий и окрасил ее;

- пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу;

- осторожно (!) смывают остатки краски слабой струей дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски. При промывании мазков следует использовать холодную воду или воду комнатной температуры.

- перед тем, как нанести на стекло следующий раствор, щипцами иди пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют, чтобы с него стекла вода; это предотвращает разбавление следующего реактива;

- мазок обесцвечивают 3 минуты одним из обесцвечивающих растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка;

- мазок тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение до 1 минуты (не превышать экспозицию!) 0,3% раствором метиленового синего;

- вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода;

- высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

Не следует промокать препарат!

В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы - в голубой.

При использовании 0,3% раствора метиленового синего для окраски фона препарата (контрастирующая окраска) следует иметь в виду, что при толстом мазке или превышении времени окраски этот краситель может как бы "скрыть" кислотоустойчивые микобактерии.

Если в процессе окраски произошло загрязнение краской нижней свободной от мазка поверхности предметного стекла, перед микроскопией следует аккуратно протереть ее тампоном, смоченным солянокислым спиртом.

Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе.

3.3.2. Окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, значительно большая площадь поля зрения.

Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты (бактериальные клетки), окрашенные специальными красителями (флюорохромами), под действием облучения их ультрафиолетом испускают излучение в видимом спектре света. В случае, когда объект не окрашен специальными красителями, ультрафиолетовый свет, проходя через объектив и попадая на препарат, поглощается молекулярными структурами объекта и остается невидимым или почти невидимым для человеческого глаза. Если же какие-либо объекты окрашены специальным красителем, то молекулы красителя под действием ультрафиолета возбуждаются и начинают испускать кванты света в длинноволновой области, иначе говоря - светиться. В этом случае клетка становится источником света определенного спектра и хорошо видна на общем темном контрастном фоне препарата.

Источник света должен содержать в своем спектре длину волны возбуждающую молекулы красителя, а светофильтры подбираются таким образом, чтобы добиться хорошего расхождения между длинами волн возбуждающего ультрафиолетового света и излучения, испускаемого возбужденными объектами.

При люминесцентной микроскопии используют специальный микроскоп. Источником света в нем служит кварц-галогеновая или ртутная лампа. Для красителей системы аурамин/родамин используют подборку из следующих фильтров (на примере микроскопа РП08 ЛОМО):

- возбуждающий фильтр ФС 1-4,

- запирающий фильтр СЗС 21-2 и

- нейтральный фильтр БС 8-3.

Светофильтры возбуждения служат для выделения из потока излучения источника света тех лучей, которые обеспечивают возбуждение и свечение объекта; эти фильтры устанавливаются в ветви осветителя.

Запирающий светофильтр служит для ограничения (срезания) света возбуждения и пропускания только света люминесценции; этот фильтр устанавливается в наблюдательной ветви.

Наблюдательные (сменные) фильтры имеют разное назначение: фильтры для защиты глаз от попадания красных и инфракрасных лучей; теплозащитные фильтры и др. В отечественных микроскопах применяются фильтры из стекла БС8 для предохранения объектов микроскопии от выцветания.

Люминесцентные красители (аурамин ОО, родамин С и др.) связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При облучении окрашенных клеток возбуждающим светом они начинают светиться оранжевым или ярко-желтым светом на черном или темно-зеленом фоне.

За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря которому видимые размеры светящейся клетки превышают ее физические размеры. В связи с этим окрашенные флюорохромными красителями препараты обычно исследуются при увеличении 250х - 450х, тогда как окрашенные фуксином - при увеличении 800х - 1000х. Разница в увеличении позволяет микроскописту видеть одновременно в 4-10 раз большее поле зрения, что существенно сокращает время, необходимое для просмотра мазка. Подсчитано, что если микроскопическое исследование необходимой площади мазка при окраске по Ziehl-Neelsen продолжается приблизительно 10 минут, то для исследования той же площади мазка методом люминесцентной микроскопии потребуется только 2-3 минуты.

Наряду с этим при люминесцентной микроскопии отмечается значительно большая резкость и контрастность микроскопической картины, что повышает комфортность микроскопического исследования. Для глаза исследователя значительно легче обнаружить флюоресцирующие оранжевые или ярко желтые микобактерии на темном (при гашении фона метиленовым синим или перманганатом калия) или темно красном (при гашении фона акридиновым оранжевым) фоне, чем выявить красные микобактерии на голубом фоне клеточного детрита при окраске по Ziehl-Neelsen. Это делает метод люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании олигобациллярного материала.

Указанные преимущества наиболее выражены при использовании люминесцентной микроскопии в лабораториях, выполняющих ежедневно большое число исследований (порядка 30 и более).

Мазки для люминесцентной микроскопии предпочтительно готовить из осадка после обработки материала детергентом с последующим отмыванием и центрифугированием. Перед нанесением материала осадка на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения рН (6,8-7,0). С этой целью осадок нейтрализуют несколькими каплями 6% раствора соляной кислоты или 6% едкого натра (в зависимости от метода обработки материала), тщательно встряхивают и с помощью бумажной индикаторной полоски определяют уровень рН (оптимально 6,8) осадка.

Во всех сомнительных случаях микроскопической картины для контроля следует использовать микроскопию мазка, повторно окрашенного по методу Ziehl-Neelsen.

3.3.2.1. Оборудование и реактивы для окраски флюорохромными красителями

- Раковина или специальный вместительный лоток для проведения окраски;

- Специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на предметных стеклах;

- Пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;

- Газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу; или металлический стержень с ватным тампоном, используемого вместо горелки для фиксации препарата, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;

- Раствор флюоресцентных красителей;

- Раствор для обесцвечивания мазков;

- Раствор для гашения фона обесцвеченного мазка;

- Емкость с дистиллированной водой для промывания мазков;

- Штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

При окраске флюорохромными красителями ни в коем случае нельзя подогревать мазки и пользоваться накладками из фильтровальной бумаги!

Промывание мазков в процессе окраски следует производить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.

В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.

При окраске мазков необходимо:

- избегать неполного обесцвечивания;

- не делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.

Мазки, которые использовались для флюоресцентной микроскопии, в случае сомнений в истинности феномена кислотоустойчивости можно повторно окрасить по методу Ziehl-Neelsen.

В нашей стране наибольшее распространение получили следующие методы окраски микобактерий люминесцентными красителями:

3.3.2.2. Метод окраски аурамином ОО и родамином С

Реактивы:

- Спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

- Кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

- Метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;

- Аурамин ОО, (аурамин О - Sigma);

- Родамин С, ТУ-6-09-2463-77 (родамин В-Sigma);

- Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Раствор аурамина - родамина:

Аурамин ОО                                                          1,0 г

Родамин С                                                           0,1 г

Вода дистиллированная                                            1000 мл

Каждый краситель растворяют отдельно в 150-200 мл дистиллированной воды и помещают в термостат при 37°С на 18-24 часа. Затем растворы сливают в одну емкость и доводят общий объем до 1000 мл.

Приготовленный раствор красителей хранят в емкости из темного стекла в прохладном, защищенном от света месте.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора

Раствор 2. Обесцвечивающий раствор:

Концентрированная соляная кислота                                    3 мл

Этиловый спирт 96°                                                  97 мл

Аккуратно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты к 97 мл этилового спирта.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот!

Раствор 3. Гаситель фона:

Метиленовый синий хлорид                                            25 мг

Вода дистиллированная                                              100 мл

В 100 мл дистиллированной воды растворить 25 мг метиленового синего хлорида.

Хранение растворов. Написать на этикетке название раствора, концентрацию, дату приготовления и срок хранения. Растворы желательно хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Перед использованием растворов их просматривают для исключения преципитата. Если последний обнаружен, раствор можно профильтровать.

Процедура окраски:

1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг друга.

2. Мазки заливают раствором 7 на 1 час.

Не нагревать мазки и не использовать полоски фильтровальной бумаги!

3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой.

4. Обесцвечивают раствором 2 (солянокислый спирт) в течение 3 мин.

5. Промывают дистиллированной водой.

6. Гашение фона осуществляют раствором 3 в течение 60 сек. Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой.

7. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

3.3.2.3. Метод окраски аурамином О

(Hagemann P. К., 1938; CDC 1985; WHO, 1998)

Реактивы:

- Спирт этиловый 96°марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;

- Кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;

- Фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;

- Аурамин О, Sigma (2465-27-2);

- Акридиновый оранжевый, С.I.46005; ИЛИ

Перманганат калия, ГОСТ 10163-76;

- Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

- Безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:

Аурамин                                                             0,1 г

Этиловый спирт                                                     10 мл

Растворить аурамин в спирте.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора.

Раствор 2. Раствор фенола:

Фенол кристаллический                                               3,0 г

Дистиллированная вода                                              87 мл

Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41°С) и растворить в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на водяной бане. Довести общий объем до 90 мл.

Раствор аурамина О. Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо хранить в прохладном затемненном месте. На этикетке обозначить название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество окрашивания.

Раствор 3. Обесцвечивающий раствор:

Концентрированная соляная кислота                                  0,5 мл

Технический 70° этиловый спирт                                   100 мл

Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к спирту.

Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот!

Напишите на этикетке название раствора, его концентрацию, дату приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

Растворы 4. Гасители фона:

Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого.

а) Раствор перманганата калия:

Перманганат калия (КМnО4)                                           0,5 г

Дистиллированная вода                                             100 мл

Растворить перманганат калия в дистиллированной воде и перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На этикетке обозначить название раствора, концентрацию, дату приготовления и срок годности.

Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

б) Раствор акридинового оранжевого:

Безводный двузамещенный фосфат натрия (Na2HPО4)                    0,01 г

Дистиллированная вода                                            100 мл

Акридиновый оранжевый                                              0,01 г

Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить акридиновый оранжевый.

Хранение реактивов. Хранят приготовленные растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение 3 месяцев.

Процедура окраски:

1. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы "рельсы" для окраски так, чтобы они не касались друг друга.

2. Мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут.

Не нагревать мазки и не использовать полоски фильтровальной бумаги!

3. Тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой.

4. Обесцвечивают раствором 3 (0,5% раствор солянокислого спирта) в течение 2 минут.

5. Промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются остатки краски.

6. Гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого в течение 2 минут.

При использовании перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2 минуты. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при передержке интенсивность флюоресценции микобактерий может уменьшаться.

7. Мазки промывают дистиллированной водой.

8. Мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

3.3.2.4. Хранение приготовленных мазков

Приготовленные мазки хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Используют специальные коробки. Стекла не должны соприкасаться друг с другом для исключения повреждения целостности мазка. Положительные мазки хранят 1 год и более, если больной находится это время в стационаре. Окрашенные флюоресцентными красителями мазки чувствительны к дневному и ультрафиолетовому свету. Во время процесса микроскопирования они способны обесцветиться за несколько секунд. Для исключения этого мазки просматривают достаточно быстро, а при необходимости сделать паузу, перекрывают поток света от лампы шторкой. Обесцветившиеся мазки можно повторно окрасить, однако это не всегда приводит к полному восстановлению препарата.

3.4. Техника микроскопического исследования препарата

3.4.1. Оборудование и реактивы для проведения микроскопического исследования препаратов, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen

Для проведения микроскопического исследования при окраске по методу Ziehl-Neelsen необходимы:

- Бинокулярный микроскоп;

- Иммерсионное масло;

- Капельница для нанесения масла на препарат;

- Штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны быть расположены в порядке номеров регистрации;

- Емкость с ксилолом, спирто-эфирной смесью или 70°спиртом;

- Фильтровальная бумага для удаления иммерсионного масла с поверхности просмотренного препарата;

- Коробки для хранения просмотренных мазков;

- Мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или марлевые тампоны для протирания линз микроскопа;

- Бумага и ручка для записи результатов микроскопического исследования;

- Емкость с дезинфицирующим средством.

Для исследования мазков, окрашенных по Ziehl-Neelsen, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом 90х или 100х и окулярами 7х или 10х.

3.4.2. Настройка микроскопа для исследования в проходящем свете

Новое поколение отечественных и зарубежных микроскопов оснащено самоцентрирующимися галогенными лампами, и настройка (фокусировка) нити лампы в апертурной диафрагме конденсора производится на заводе-изготовителе. Это существенно облегчает настройку освещения микроскопа по Келеру, которая в этих марках микроскопов сводится к ряду приемов, позволяющих совместить оптическую ось изображения и ось подсветки.

- Перед началом работы убедиться, что электрическое напряжение в лаборатории соответствует допустимому при работе с микроскопом. В случае необходимости воспользоваться стабилизатором напряжения.

- Осмотреть, нет ли в микроскопе поврежденных или сломанных деталей.

- Включить освещение микроскопа, отрегулировав его на малое напряжение, которое используется при работе с малым увеличением.

- Проверить правильность регулировки и фокусировку (направленность) источника света.

- Убедиться, что конденсор с открытой диафрагмой занимает верхнее положение, а матовое стекло отсутствует в тракте подсветки (под конденсором);

Настройку освещения микроскопов рекомендуется производить следующим образом.

- Установить в ход лучей объектив 40х и сфокусировать его на резкое изображение поверхности препарата.

- Установить препарат таким образом, чтобы в поле зрения микроскопа попал наиболее прозрачный участок.

- Вращая кольцо полевой диафрагмы, расположенное на основании микроскопа, закрыть полевую диафрагму.

- С помощью расположенной на конденсоре специальной рукоятки закрыть апертурную диафрагму.

- Перемещая конденсор путем вращения винта вертикального перемещения конденсора, добиться резкого изображения краев прикрытой полевой диафрагмы в поле зрения микроскопа.

- С помощью фронтально от конденсора расположенных центровочных винтов добиться перемещения изображения краев прикрытой диафрагмы в центр поля зрения.

- Вращая кольцо полевой диафрагмы, раскрыть ее до размеров поля зрения.

- С помощью рукоятки конденсора раскрыть апертурную диафрагму приблизительно на 1/3 хода, добиваясь четкого появления окраски объектов изображения в препарате и достаточной глубины резкости.

- Заменить окуляр в правом окулярном тубусе на точечную диафрагму (из комплекта микроскопа) или на дополнительный микроскоп МИР-4, который предварительно настроить на изображение. В первом случае будет видна яркая нить накала лампы. Уменьшая силу света, необходимо добиться изображения нити. Она должна иметь сфокусированное изображение. В случае использования дополнительного окуляра при правильно настроенном микроскопе будет наблюдаться следующая картина: темный диск, заполняющий поле зрения, и тонкая полоска света по диаметру выходного зрачка микрообъектива (должно быть перекрыто ~ 9/10 диаметра выходного зрачка).

- Заменить точечную диафрагму или дополнительный микроскоп на рабочий окуляр и приступить к наблюдению препарата в светлом поле. Для большего комфорта можно вставить матовое стекло в тракт прохождения света, добавив света реостатом лампы.

- Этой манипуляцией завершается настройка микроскопа.

Многие современные микроскопы оснащены центрированными и неподвижными конденсорами, что облегчает процедуру настройки. Регулировка осуществляется только с помощью открытия апертуры, ирисовой диафрагмы до 70-80%, что обеспечивает равномерное освещение поля зрения

3.4.3. Морфологические характеристики кислотоустойчивых микобактерий при окраске по методу Ziehl-Neelsen

Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза имеют в длину примерно 1-10 мкм, в ширину - 0,2-0,6 мкм. Обычно они видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты.

При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул. Микроорганизмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко в нативных препаратах бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры "V".

Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки более интенсивного окрашивания, в результате чего они похожи на "бусы", а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде "полос".

В препарате могут выявляться также измененные коккоподобные кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или мицелиеподобные структуры. Однако в случае обнаружения измененных форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтвержден дополнительными методами исследования.

Клетки, выращенные на питательной среде, отличаются внешне от видимых в нативном препарате. Как правило, в первом случае микобактерии чуть толще и короче, окраска их ярче Клетки могут быть агломерированы или сплетаться в колонии с образованием кос или сплетений.

Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к М.tuberculosis, могут иметь различные формы - от длинных палочек до кокковидных форм с различной интенсивностью окрашивания.

Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не только у микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут быть Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora.

Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени кислотоустойчивой окраски - при частичной потере кислотоустойчивой окраски они приобретают фиолетово-малиновый цвет.

3.4.4. Оборудование и реактивы для проведения микроскопического исследования препаратов, окрашенных флюорохромными красителями

Для проведения микроскопического исследования при окраске флюорохромами необходимы:

- Люминесцентный микроскоп;

- Штатив с окрашенными и высушенными мазками, которые должны располагаться в порядке номеров регистрации;

- Коробки для хранения просмотренных мазков;

- Мягкая хлопчатобумажная ткань, бумажные салфетки или тампоны для протирания линз микроскопа;

- Бумага и ручка для записи результатов микроскопического исследования.

- Емкость с дезинфицирующим средством.

Для исследования мазков, окрашенных флюорохромными красителями, используют люминесцентный микроскоп с набором объективов и окуляров, позволяющих получить увеличение объекта наблюдения в пределах 250х - 630х. Необходимо использовать объективы, предназначенные для люминесцентной микроскопии.

3.4.5. Осветительные системы и настройка люминесцентного микроскопа

Освещение объектов на предметном стекле осуществляется сверху через коллектор, систему светофильтров, светоделительную пластину и объектив микроскопа.

Подготовка к работе и настройка освещения (на примере РПО-8 ЛОМО)

1. Присоединить фонарь ртутной лампы к источнику питания.

2. Закрыть шторку микроскопа.

3. Включить источник питания и зажечь лампу, руководствуясь описанием источника питания, изложенным в паспорте микроскопа.

Нельзя выключать ртутную лампу ранее чем через 15 минут после ее зажигания. Повторное включение ртутной лампы допускается только через 10 минут после ее выключения (после ее полного охлаждения)

4. Дать прогреться фонарю не менее 10 минут после зажигания ртутной лампы.

5. Установить переключатель, расположенный слева на тубусе микроскопа, в положение СП установить в тубус направляющую с пластиной СП.

6. Установить в гнездо тубуса теплозащитную кювету или теплозащитный светофильтр СЗС 24 в прямоугольной оправе.

7. Установить в гнездо тубуса нейтральный светофильтр НСЗ-2 в прямоугольной оправе.

8. Установить в правую окулярную трубку бинокулярной насадки точечную диафрагму.

9. Поворотом револьверной головки ввести в ход лучей свободное от объектива отверстие.

10. Открыть шторку (полевую диафрагму), расположенную в осветительной ветви осветителя.

11. Поместить на предметный столик лист белой бумаги.

12. Отцентрировать изображение светящейся дуги лампы относительно свободного отверстия, для чего с помощью центрировочных винтов при лампе переместить изображение нити лампы в центр светящегося круга от отверстия.

13. Прикрыть полевую диафрагму.

14. Добиться резкого изображения дуги на бумаге, для чего с помощью рукоятки переместить коллектор в осветительной части микроскопа вдоль оптической оси.

15. Проверить окончательную центрировку электродов лампы наблюдая изображение электродов и светящейся дуги лампы через точечную диафрагму.

От правильной настройки (центрировки) люминесцентного осветителя зависит интенсивность и равномерность свечения объектов в поле зрения.

Настройка микроскопа для наблюдения объектов в свете люминесценции

1. Вставить в пазы корпуса осветителя выбранные для работы возбуждающий (ФС 1-4) и запирающий (СЗС 21-2) светофильтры или направляющую с пластиной.

2. Установить в гнездо светофильтр БС 8-3 вместо светофильтра НС3-2.

3. Вставить окуляры в окулярные трубки бинокулярной насадки.

4. Установить в револьверное устройство полный набор объективов.

5. Ввести в ход лучей выбранный рабочий объектив.

6. Установить на предметном столике микроскопа препарат и закрепить его с помощью препаратоводителя.

7. Открыть полевую диафрагму до размеров поля зрения в окуляре.

8. Раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений, видимых правым и левым глазом исследователя.

9. С помощью механизмов грубой и точной фокусировки (макро- и микровинт) добиться оптимальной резкости изображения. Если объект наблюдения недостаточно контрастный, сфокусировать прибор можно, ориентируясь на маркировку, нанесенную на препарат.

10. Проверить равномерность освещения поля зрения, перемещая рукоятку коллектора.

Микроскоп готов к работе.

Для предохранения препаратов от выцветания в перерывах между наблюдениями необходимо закрывать шторку лампы, находящуюся в осветительном тракте ртутной лампы.

3.4.6. Порядок проведения микроскопического исследования

Современные микроскопы являются сложными техническими устройствами, чувствительными к настройке и правилам эксплуатации. Перед началом работы они должны быть настроены и адаптированы под зрение микроскописта. Это лучше поручить инженерной службе, но можно провести самостоятельно, руководствуясь инструкцией к микроскопу и вышеприведенным описанием. Несоблюдение правил настройки может привести к существенному снижению эффективности микроскопических исследований и даже невозможности их проведения.

Исследование мазков, окрашенных по методу Ziehl-Neelsen, производится в проходящем свете с помощью светового микроскопа. Рекомендуется это делать с помощью бинокулярного микроскопа.

При исследовании мазков, окрашенных флюоресцентными красителями, используется люминесцентный микроскоп. При этом одной из важных особенностей работы в этом случае является то, что окрашенные флюорохромными красителями мазки не подлежат длительному хранению при дневном свете или длительному просмотру, так как интенсивность люминесценции окрашенного объекта при этом быстро снижается.

Работу начинают с определения положительных мазков предыдущего дня или просмотра. Это позволит относительно быстро оценить состояние настройки и готовности микроскопа к работе.

Перед началом микроскопического исследования в световом микроскопе необходимо:

- проверить наличие на столе для микроскопии необходимого для проведения микроскопического исследования оборудования и дополнительных материалов;

- снять чехол, которым накрыт микроскоп;

- осмотреть микроскоп и протереть сухой салфеткой механические части микроскопа;

- убедиться в целости оптической системы;

- включить осветительную систему и убедиться в достаточности освещения, ее настройки;

- с помощью бумажной салфетки или ватного тампона, смоченного спирто-эфирной смесью, протереть линзы микроскопа;

- убедиться в том, что подготовленные для микроскопии окрашенные препараты достаточно хорошо высушены;

- вращая винт грубой фокусировки (макровинт), опустить предметный столик, максимально отдалив его от объектива;

- поворотом револьверного устройства установить объектив с малым увеличением (10х) точно над конденсором;

- поместить на столик предметное стекло таким образом, чтобы мазок находился прямо под объективом; при этом обязательно убедится, что мазок находится в верхней плоскости предметного стекла, а не снизу;

- закрепить препарат на столике с помощью клемм препаратоводителя;

- с помощью винтов препаратоводителя выбрать участок мазка для просмотра;

- раздвинуть окуляры до полного совмещения изображений видимых правым и левым глазом исследователя;

- глядя сбоку, внимательно контролировать расстояние между стеклом и линзой объектива. Медленно вращая винт грубой фокусировки (макровинт), поднять предметный столик с препаратом к объективу, но не допускать соприкосновения предметного стекла с линзой объектива.

- глядя через окуляр, отрегулировать интенсивность светового потока так, чтобы свет был ярким, но комфортным. Для этого лучше всего использовать регулятор накала лампы, использовать темные или матовые фильтры и в крайнем случае изменить степень открытия диафрагмы.

Положение конденсора изменять не рекомендуется!

- продолжая смотреть через окуляр, медленно повернуть макровинт, чтобы предметный столик отошел от линзы объектива. Обычно достаточно нескольких поворотов винта;

- затем, гладя в окуляр, медленно вращать микровинт до тех пор, пока не появится изображение мазка. Небольшими поворотами микровинта настроить изображение до получения достаточной резкости.

Никогда не поднимайте столик микроскопа, глядя в окуляр. Это может привести к соприкосновению фронтальной линзы объектива с предметным стеклом, повреждению линзы или к порче препарата

- глядя правым глазом в правый окуляр, сфокусировать изображение;

- глядя левым глазом в левый объектив, сфокусировать изображение путем поворота дополнительного фокусировочного кольца, расположенного на левом окуляре.

3.4.7. Исследование объекта с большим увеличением с помощью "сухой" оптической системы

Порядок работы

- После работы с препаратом под малым или средним увеличением, не меняя фокусировки, выбрать объектив с более сильным увеличением.

- Убедиться, что этот объектив не касается предметного стекла, и поворотом револьверного устройства поместить выбранный объектив непосредственно над препаратом. При этом мазок должен оставаться почти в фокусе объектива.

- С помощью микровинта сфокусировать резкость изображения. Правильная настройка света также может улучшить качество изображения.

Все манипуляции по настройке проводятся при сфокусированном на объект микроскопе. При настройке объект должен быть выведен из поля зрения, иными словами, после получения резкого изображения объекта предметное стекло смещается, чтобы поле зрения под объективом было прозрачным.

3.4.8. Работа с объективом масляной иммерсии

Порядок работы:

- Добиться четкого изображения объекта в поле зрения с помощью сухого объектива малого увеличения и определить наиболее подходящий для исследования участок препарата.

- Поворотом револьвера вывести сухой объектив из хода лучей и сместить объективы так, чтобы стал свободным доступ к препарату.

- Нанести на выбранный участок препарата одну каплю иммерсионного масла. Капля должна свободно упасть на стекло (при этом желательно немного смазать иммерсионным маслом фронтальную линзу объектива).

Пипетка капельницы масла ни в коем случае не должна соприкоснуться с мазком!

В противном случае это может привести к переносу микобактерий с одного мазка на другой, к загрязнению иммерсионного масла и получению ложноположительного результата микроскопического исследования.

- Поворотом головки револьверного устройства установить объектив с сильным увеличением (90х - 100х) непосредственно над препаратом.

- Под визуальным контролем (глядя сбоку) медленно вращают макровинт грубой фокусировки и поднимают столик микроскопа до появления мениска в момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с поверхностью капли масла.

Никогда не касайтесь линзой предметного стекла. Это может повредить линзу или разбить препарат

- Глядя в окуляр, с помощью винтов грубой и точной регулировки произвести настройку на резкость. Во время выполнения этой манипуляции будьте особенно внимательны и смещайте винты на небольшой ход, не допуская бесконтрольно полного оборота винтов.

В случае появления в поле зрения пузырьков воздуха операцию настройки (момент соприкосновения фронтальной линзы объектива с иммерсией) необходимо повторить, протерев объектив салфеткой со спиртом.

Микроскоп готов к работе.

При микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по Ziehl-Neelsen, следует просматривать не менее 100 полей зрения. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для необходимо просмотреть еще 200 полей зрения.

При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по одной и той же схеме:

- либо 3 параллельных прохода по длине препарата,

- либо 9 параллельных проходов по ширине.

Микроскопировать начинают с левого верхнего выбранного в мазке поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной оси препарата до конца мазка, либо смещаясь вниз и затем вновь поднимаясь вверх и т.д., проходя все поля зрения до границы мазка.

При увеличении микроскопа 1000х, т.е. 100х для масляно-иммерсионного объектива и 10х для окуляра при исследовании одной длины мазка (приблизительно равно 20 мм) за один продольный проход просматривается около 100-120 полей зрения (диаметр поля зрения - 0,16-0,2 мм).

При люминесцентной микроскопии с использованием объектива 25х и окуляра 10х площадь поля зрения примерно в 10 раз больше, поэтому просматривается меньшее число полей зрения. Однако при отрицательном результате или малом количестве выявляемых микобактерий следует просматривать не менее 100 полей зрения.

При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20-50 полей зрения как при окраске по Ziehl-Neelsen, так и при люминесцентной микроскопии (см. Таблицу 3).

По окончании микроскопического исследования каждого препарата следует:

- освободить препарат от держателей - клемм препаратоводителя;

- снять препарат с предметного столика микроскопа;

- сверить идентификационный номер и записать результат микроскопии на специальном листе бумаги, на котором перед началом микроскопии написать в столбик порядковые номера препаратов, подлежащих исследованию;

- затем, удерживая препарат за ребра стекла в участке, где нанесен порядковый номер, положить препарат на покрытый фильтровальной бумагой поднос (лоток) в вытяжной шкаф;

- для удаления иммерсионного масла накрыть препарат полоской фильтровальной бумаги;

- смочить ее несколькими каплями ксилола, спирто-эфирной смесью или спиртом;

- через 2-3 минуты фильтровальную бумагу удалить;

- очищенный от иммерсионного масла препарат поместить в коробку для просмотренных стекол.

При большом количестве исследуемых препаратов рекомендуется заранее подготовить 2 выстланных фильтровальной бумагой подноса (лотка) - для положительных и отрицательных препаратов - и удаление иммерсионного масла производить по окончании микроскопического исследования одновременно со всех просмотренных препаратов или части их.

В зависимости от результатов микроскопического исследования просмотренный препарат поместить в коробку для положительных или для отрицательных препаратов.

Перед тем, как взять для исследования следующий препарат, необходимо протереть иммерсионную линзу кусочком специальной ткани или марлевым тампоном с рекомендованным растворителем.

По окончании микроскопического исследования всей партии мазков выполнить следующие процедуры:

- с помощью бумажной или марлевой салфетки протереть линзы микроскопа спирто-эфирной смесью или спиртом;

- опустить предметный столик микроскопа, отдалив его от объективов;

- уменьшить интенсивность освещения и выключить источник освещения микроскопа;

- накрыть микроскоп полиэтиленовым или пластиковым пакетом;

- расставить все необходимое для микроскопии оборудование и дополнительные материалы в установленном порядке;

- снять и удалить одноразовые перчатки;

- вымыть руки с мылом;

- перенести результаты микроскопического исследования в лабораторный регистрационный журнал и на бланки ответов.

3.5. Причины ошибок при микроскопических исследованиях

3.5.1. Ложноположительные результаты

Они могут быть обусловлены следующими причинами:

- плохая обработка многоразовых флаконов для сбора материала в которых могут оставаться микобактерии;

- повторное использование предметных стекол после положительного предыдущего мазка;

- использование для приготовления мазка загрязненных бациллярным материалом бактериологических петель, пипеток или деревянных палочек;

- применение предметных стекол с царапинами и другими дефектами, в результате чего появляются артефакты, иногда ошибочно принимаемые за микобактерии; красная краска может иногда задерживаться на царапинах и создавать ошибочное представление о том, что видно кислотоустойчивую микобактерию. Такие царапины нередко образуют параллельные ряды. Обычно они более грубые и больше по размерам, чем микобактерии. Их несложно определить, так как они находятся на стекле в более глубокой плоскости (под мазком), и исчезают, если установить фокус на клетки (лейкоциты, эпителиальные клетки);

- использование плохо профильтрованного или длительно хранившегося раствора фуксина с начавшейся кристаллизацией;

- наличие микобактерий в иммерсионном масле, если иммерсионные линзы не были очищены после положительных препаратов или иммерсионное масло загрязнено микобактериями, если пипетка, которой оно наносится на мазок, случайно соприкасалась с положительным мазком;

- недостаточное обесцвечивание мазка, что может привести к сохранению красной окраски на некоторых некислотоустойчивых бактериях;

- волокна шерсти, хлопка, фильтровальной бумаги; обычно они встречаются как единичные находки, чаще всего в одном поле зрения;

- пыльца некоторых видов сосны, которая может обнаруживаться в виде редко встречающихся в препарате коротких кокковидных палочек.

3.5.2. Ложноотрицательные результаты

Они могут быть обусловлены следующими причинами:

- плохим качеством или недостаточным количеством исследуемого материала;

- исследованием слюны вместо мокроты;

- нарушением условий хранения, транспортировки, консервации материала (высокая температура и низкая влажность, а также воздействие на материал прямого солнечного света или ультрафиолетового излучения, под влиянием которых содержащиеся в материале микобактерии могут утратить присущую им кислотоустойчивость);

- неудачным выбором частиц мокроты для приготовления мазка;

- приготовлением слишком тонкого или толстого мазка, плохой его фиксацией над пламенем горелки или несоблюдением режимов окрашивания (неправильная экспозиция при окраске);

- нарушением методики просмотра мазка (малое число просмотренных полей зрения);

- плохим качеством красителей и реагентов;

- хранение предназначенных для исследования окрашенных мазков в месте, доступном прямым солнечным лучам или ультрафиолетовому свету, парам кислот:

- при повторном просмотре мазков (реанализ) ложноотрицательный результат может быть обусловлен тем, что после первичного просмотра с препарата не было удалено иммерсионное масло (при длительном воздействии оно обесцвечивает окраску) или препарат тщательно протирали при удалении иммерсионного масла, что вызвало повреждение мазка.

3.5.3. Операторские ошибки (ложноположительные или ложноотрицательные):

- неправильная маркировка флаконов с диагностическим материалом;

- отсутствие маркировки на стекле или повреждение ее в процессе окраски или обесцвечивания;

- неправильная регистрация результатов.

Таблица 2

Возможные причины неисправностей при микроскопии и способы их устранения

Неисправность	Возможная причина	Способ устранения
Тусклое поле зрения	Низкое положение конденсора. Закрытая диафрагма конденсора.	Поднять конденсор. Открыть диафрагму.
Темные объекты в поле зрения, смещающиеся при повороте окуляра	Грязный окуляр. Линзы микроскопа контаминированы грибами. На линзах окуляра имеются царапины.	Протереть окуляр. Необходим ремонт окуляра. Заменить окуляр.
Недостаточно четкое изображение	Перевернут препарат (мазок находится снизу стекла). Пузырек воздуха в масле. Плохое качество масла. Загрязнены линзы.	Перевернуть предметное стекло. Передвинуть 100х объектив. Заменить масло. Протереть линзы.
Нечеткое изображение при малом увеличении	Поверхности линз загрязнены маслом или грязью. Повреждение линз.	Очистить линзы. Заменить поврежденные линзы.

Учет результатов микроскопического исследования

3.3. Учет результатов микроскопического исследования при окраске по методу Ziehl-Neelsen

Количество кислотоустойчивых микобактерий (КУМ), обнаруживаемых при микроскопическом исследовании, является очень важным информационным показателем, так как оно характеризует степень эпидемической опасности больного и тяжесть заболевания. Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только качественным, но и количественным. При использовании объектива 90х или 100х и окуляра 7х - 10х (общее увеличение - 630 - 1000х) целесообразна следующая градация результатов световой иммерсионной микроскопии (см. Таблицу 3).

Результаты микроскопического исследования отражаются в двух документах: в лабораторном регистрационном журнале учета микроскопических исследований и на бланках, на которых результаты исследования сообщаются в направившее материал лечебное учреждение.

Таблица 3

Градация результатов микроскопического исследования при окраске по методу Ziehl-Neelsen

Результат исследования	Минимальное число полей зрения (п/з), обязательных для просмотра	Форма записи результата	Интерпретация результата исследования
КУМ не обнаружены в 300 п/з	300	ОТР	Отрицательный
1-2 КУМ в 300 п/з	300	Рекомендуется повторить исследование	Результат не оценивается
1-9 КУМ в 100 п/з	100	"___" КУМ в 100 п/з*	Положительный
10-99 КУМ в 100 п/з	100	1+**	Положительный
1-10 КУМ в 1 п/з	50	2+**	Положительный
Более 10 КУМ в 1 п/з	20	3+**	Положительный

------------------------------

* Указать точное число найденных КУМ

** Соответствие градаций:

Точное число     -  Единичные КУМ в препарате

       1+        -  Единичные КУМ в поле зрения

       2+        -  Умеренное количество КУМ

       3+        -  Значительное количество КУМ.

3.6. Учет результатов микроскопического исследования при окраске флюорохромными красителями

Мазки, окрашенные флюорохромными красителями, просматривают под значительно меньшим увеличением (обычно 250х - 630х), чем увеличение, используемое для просмотра мазков, окрашенных карболовым фуксином (1000х). В силу этого поле зрения, просматриваемое под люминесцентным микроскопом, имеет значительно большую площадь, чем поле зрения светового микроскопа. Таким образом, в ответе о результатах исследования мазка, окрашенного флюорохромами, при увеличении в 250 раз будет содержаться значительно больше бактерий, чем при исследовании этого же препарата, окрашенного по Ziehl-Neelsen и просмотренного при увеличении в 1000 раз. Чтобы уменьшить погрешность в ответах при использовании разных увеличений, предложено при исследовании и количественной оценке мазков, окрашенных флюорохромами количество выявленных кислотоустойчивых бактерий делить на "фактор увеличения". Такой пересчет позволяет получить примерное количество микроорганизмов, которое можно увидеть в том же мазке при увеличении в 1000 раз с окраской по Ziehl-Neelsen (см. Таблицу 4).

Пересчет результатов микроскопического исследования с использованием "фактора увеличения" позволяет получать сравнимые в различных лабораториях результаты, независимо от используемого метода окраски или степени увеличения:

Таблица 4

Соотношение результатов микроскопического исследования в зависимости от метода окраски и кратности увеличения

Число КУМ при окраске по Ziehl-Neeisen и увеличении 1000х	Ответ	Число КУМ при окраске флюоросцентными красителями
		Увеличение люминесцентного микроскопа
		250х	450х	630х
0	КУМ не обнаружены	0	0	0
1-9 в 100 полях зрения	Указать точное число	Разделить результат на 10	Разделить результат на 4	Разделить результат на 2
10-99 в 100 полях зрения	1+
1-10 в 1 поле зрения	2+
>10 в 1 поле зрения	3+

Пример: Предположим, что при увеличении в 450 раз было выявлено 20 КУМ в 1 поле зрения. Если, в соответствии с таблицей, это число разделить на "фактор увеличения" 4, соответствующее число микобактерий, которое можно увидеть при увеличении в 1000 раз, будет 5 микобактерий в 1 поле зрения. Поэтому при выдаче результата "'дует указать "2+", а не "3+", как можно было бы оценить по первой колонке при выявлении 20 КУМ в 1 поле зрения.

Результаты исследования всех мазков должны регистрироваться в лабораторном журнале, который должен содержать следующую информацию:

- порядковый лабораторный номер;

- фамилия больного;

- пол;

- возраст;

- адрес больного;

- районный регистрационный номер больного;

- название медицинского учреждения, направившего материал на исследование;

- номер истории болезни;

- основание для проведения исследования (диагностика или мониторинг результатов химиотерапии);

- результат микроскопического исследования.

Положительные результаты исследования рекомендуется вписывать в журнал красными чернилами.

Затем на основании записей в лабораторном журнале необходимо подготовить индивидуальные ответы для каждого больного, используя специальные бланки ответов.

Ответ с результатами микроскопического исследования следует выдавать как можно быстрее, желательно - не позже, чем через 24 часа после получения проб.

В бланке ответа на микроскопическое исследование должны содержаться следующие сведения:

- паспортные данные пациента;

- наименование учреждения исполнителя;

- наименование учреждения отправителя;

- материал;

- использованный метод окраски и микроскопии;

- среднее количество кислотоустойчивых микобактерий в мазке;

- выявление больших скоплений микроорганизмов, что может свидетельствовать о гораздо большем количестве бактерий, чем указано в заключении;

- дата исследования и фамилия сотрудника, проводившего анализ.

Результат следует отправлять в медицинское учреждение, приславшее пробы.

Никогда не ограничивайтесь выдачей результата пациенту!

3.8. Контроль качества микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий

Целью введения контроля качества является обеспечение условий проведения исследований, при которых достигается чувствительность и специфичность метода, заложенные в его характеристику.

Контроль качества лабораторных исследований осуществляется в нескольких формах:

- внутрилабораторный контроль качества выполняемых исследований;

- внешний контроль качества микроскопических и культуральных лабораторных исследований, включающий:

- заочную оценку качества с использованием аттестованных контрольных образцов;

- повторный анализ клинических образцов и препаратов в лабораториях более высокого уровня;

- инспекционный контроль, осуществляемый в рамках лицензирования и аккредитации, в том числе кураторские визиты.

3.8.1. Внутрилабораторное обеспечение качества микроскопических исследований

Важным элементом обеспечения качества выполняемых исследований является регулярное осуществление внутрилабораторного контроля качества микроскопических исследований, который позволяет осуществлять эффективное и систематическое наблюдение за проводимой в лаборатории работой.

Контроль качества осуществляется на всех технологических этапах микроскопического исследования:

- оценки качества поступающих проб;

- контроля за соблюдением рецептуры и методики приготовления реагентов и красителей;

- правил и сроков хранения реагентов и красителей;

- наблюдения за неукоснительным соблюдением методических приемов при:

- приготовлении мазков (включая качество предметных стекол);

- окраске мазков;

- проведении микроскопического исследования;

- регулярного контроля качества используемых химических реактивов и сроков хранения, исправности оборудования;

- периодического контроля результатов бактериоскопии;

- проверки правильности учета и регистрации результатов.

Кроме того, элементами внутрилабораторного контроля качества является проверка правильности:

- организации рабочих мест (приема и регистрации материала, приготовления и окраски мазков, микроскопирования);

- настройки оборудования;

- микроскопирования положительных и отрицательных контрольных образцов;

- своевременности и точности передачи результатов в учреждение, направившее материал для исследования.

Успех применения контроля качества обеспечивается:

- регулярным его применением в лабораторном подразделении;

- правильно обученными, заинтересованными и ответственными работниками;

- рациональным применением регламентированных методов;

- анализом допущенных ошибок и немедленным их исправлением.

Одной из форм обеспечения качества бактериоскопических исследований является использование в ряду клинических мазков двух дополнительных не окрашенных контрольных мазков, один из которых заведомо является положительным, а второй - отрицательным мазком. Просмотр мазков начинают с контрольных, затем просматривают клинические мазки.

Необходимо еженедельно и ежемесячно обобщать и анализировать полученные данные для определения процента положительных результатов и, по возможности, определять причины любых резких отклонений от средних показателей. При получении в процессе микроскопии подряд нескольких положительных результатов необходимо внимательно проанализировать причины этого.

За обеспечение качества исследований несут ответственность все сотрудники лаборатории

3.8.2. Внешняя оценка качества микроскопических исследований с использованием контрольных образцов

На территории Российской Федерации функционирует Федеральная система внешней оценки качества (ФСВОК) клинических лабораторных исследований, которая контролирует клинико-диагностические и бактериологические лаборатории путем заочной оценки качества с использованием контрольных образцов совместно с Федеральной и региональными референс-лабораториями противотуберкулезной службы МЗ РФ.

Деятельность системы основана на регулярной проверке правильности выполняемых лабораторией исследований и предоставлении информации о результатах оценки их качества. Участие в ФСВОК является одним из основных и обязательных видов деятельности клинико-диагностических и бактериологических лабораторий по обеспечению требуемого качества выполняемых исследований.

Внешняя оценка качества клинических лабораторных исследований позволяет своевременно выявить недостатки в работе клинико-диагностических подразделений, оказать организационно-методическую и консультативную помощь участвующим в ФСВОК лабораториям, выработать адекватные рекомендации по устранению обнаруживаемых ошибок и совершенствованию используемых методик.

Внешнюю оценку качества микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий осуществляют совместно с Центром внешнего контроля качества клинических лабораторных исследований МЗ РФ Федеральная и региональные референс-лаборатории противотуберкулезной службы.

3.8.3. Повторный анализ клинических образцов и препаратов в лабораториях более высокого уровня

Определенная доля исследованных и сохраненных мазков подвергается повторному анализу в курирующих лабораториях по установленным правилам.

Лаборатория должна соблюдать правильность хранение препаратов, обеспечивая их целостность и исходное качество, при котором получен результат. Препараты должны сопровождаться соответствующими документами. Обычно реанализу подвергают все положительные мазки и каждый десятый отрицательный.

3.8.4. Инспекционный контроль качества микроскопических исследований

Инспекционный контроль (кураторские визиты) осуществляется с целью проведения текущей оценки основных показателей работы лабораторий и проверки достоверности получаемых в ней результатов микроскопических исследований путем очной проверки деятельности лабораторий при их посещении представителями лицензирующего органа и курирующей лаборатории.

Кураторские визиты являются наиболее эффективными методами оперативного контроля качества лабораторной диагностики. План проведения кураторских визитов и основные разделы работы лаборатории, подлежащие проверке, определяются заранее.

3.9. Организация и управление работой лаборатории. Общие правила безопасности при организации исследований

В связи с высокой трансмиссивностью микобактерий туберкулеза и, как следствие, с высоким риском заболевания среди сотрудников микробиологических подразделений устройство лаборатории, расположение и организация рабочих мест должны предотвращать как развитие внутрибольничной туберкулезной инфекции, так и контаминацию рабочих мест, а также обеспечивать необходимые меры биологической безопасности при работе персонала с возбудителем туберкулеза, исключения физических и химических рисков при работе в лаборатории.

Необходимые мероприятия должны включать (см. Раздел 3 настоящей Инструкции):

а) административные меры, предотвращающие распространение инфекционных аэрозолей из загрязненных зон в неинфицированные помещения лаборатории и лечебного учреждения в целом;

б) инженерные (проектные и технические) мероприятия, направленные на снижение концентрации инфекционных аэрозолей в воздухе (принудительная вентиляция, использование специализированных устройств обеззараживания воздуха);

в) меры персональной защиты персонала (защитные маски, респираторы, одежда, перчатки).

Во время работы двери в лабораторию должны быть закрыты. Расположение рабочих зон, оборудования и реагентов должно быть постоянным и логичным - в соответствии с последовательностью выполнения работы и соблюдением эпидемиологической цепочки. Рабочие помещения должны содержаться в чистоте и обеззараживаться бактерицидными лампами (не менее 40 минут перед началом работы и в конце рабочего дня). Столы должны протираться раствором соответствующего дезинфицирующего средства (например, 5% раствором хлорамина)* два раза в день - перед началом работы и после ее окончания. Эффективность ультрафиолетовых облучателей зависит от влажности и степени загрязненности воздуха и рабочих поверхностей, что необходимо учитывать при проведении санитарных гигиенических мероприятий в лаборатории.

Помещения лаборатории должны быть удобными в расположении, не иметь порогов и функционально пригодными для предназначенных работ.

У каждого рабочего места должны быть вывешены методические инструкции по проведению выполняемых на этом месте рабочих процедур. Все манипуляции на каждом рабочем месте должны выполняться в строгом соответствии с инструкцией. Любые изменения вносятся в эти документы только по указанию заведующего лабораторией и должны быть завизированы его подписью с указанием даты изменения методики.

Все документы должны храниться в течение 2 лет.

В работе должны использоваться методы лабораторных исследований, которые регламентированы в нормативных документах и зарегистрированы в реестре Минздрава РФ.

Лабораторное оборудование

Оборудование должно полностью удовлетворять стандартным требованиям и спецификациям.

Технические паспорта всего оборудования и инструкции по применению оборудования и уходу за ним необходимо хранить в специальной папке.

Для обеспечения точности и правильности работы оборудование должно регулярно проверяться специалистом соответствующего профиля.

Для регистрации профилактических осмотров всего оборудования следует иметь отдельный журнал.

В случае возникновения неисправности в работе того или иного прибора работа на нем немедленно прекращается. И прибор консервируется до прихода специалиста по ремонту и эксплуатации данного прибора.

Правила хранения и эксплуатации микроскопов

Срок службы микроскопа рассчитан на 10 лет с учетом естественного старения. Микроскоп является точным и дорогостоящим прибором, поэтому требует очень бережного обращения как с механической его частью, так и с оптикой. При этом вовсе не обязательно знать устройство и работу микроскопа в деталях - этим должны заниматься профессионалы. Однако иметь представление о правилах настройки и работы с микроскопом, и хранении необходимо работникам лаборатории.

Технические правила эксплуатации прилагаются к микроскопу.

- Если микроскоп временно не используется, его следует хранить в футляре или накрывать пластиковым чехлом.

- Повышенная влажность воздуха помещения может способствовать размножению на линзах плесневых грибов и появлению ржавчины на металлических частях прибора. Для снижения влажности воздуха в футляр микроскопа следует поместить чашку Петри с цветным силикагелем (имеет голубой цвет). Когда силикагель насытится влагой, его цвет изменится с голубого на розовый. В таком случае силикагель можно заменить новым или дегидратировать его в сухожаровом шкафу. После восстановления первоначального цвета силикагель можно использовать повторно.

- Для удаления налета плесневых грибов с линз объектива используется тампон, смоченный в растворе противогрибкового препарата. При необходимости такую обработку можно повторить, а затем насухо протереть линзы специальной мягкой тканью. Линзы окуляров не протирают растворителями.

- Нельзя хранить микроскоп поблизости от химических реактивов и кислот, а также в помещениях или местах с высокой влажностью.

- При переноске микроскопа следует держать его двумя руками - за штатив и за основание. Нельзя переносить микроскоп, держа его только одной рукой. Следует избегать необоснованно частых передвижений микроскопа.

- Микроскоп следует устанавливать на прочной ровной поверхности. В непосредственной близости от него нельзя устанавливать оборудование, вызывающее вибрацию (например, центрифуги).

- Если микроскоп используется каждый день, желательно держать его на одном постоянном месте, накрывая после работы полиэтиленовым или пластиковым чехлом.

- На линзах микроскопа от грязи или песчинок могут появиться царапины. Объективы и окуляры протираются только специальной мягкой тканью для линз или безворсовыми салфеткой или тампоном.

- Не следует допускать попадания иммерсионного масла на предметный столик микроскопа. Во избежание контаминации мазков в процессе микроскопического исследования и получения ложноположительных результатов после просмотра каждого очередного препарата следует тщательно вытирать объектив от иммерсионного масла.

- Необходимо следить, чтобы иммерсионное масло не попадало на неиспользуемые объективы, находящиеся в револьвере микроскопа. При случайном загрязнении необходимо сразу же тщательно их вытереть.

- Нельзя разбирать микроскоп; в случае появления какой-либо неисправности ремонт должен производиться только специалистом.

Для сохранения микроскопа в рабочем состоянии необходимо соблюдать следующие правила:

После использования в течение рабочего дня необходимо:

- проверить фиксацию объективов в револьверном устройстве;

- удалить с помощью ксилола, спирто-эфирной смеси или 70°спирта масло с объектива, конденсора и предметного столика;

- несколько приподнять предметный столик, не допуская соприкосновения с ним объективов, но в то же время и не оставляя их на длительное время в верхнем положении;

- установить регулятор напряжения на минимальное значение;

- выключить источник света;

- накрыть микроскоп чехлом.

Так как основными загрязнителями оптической системы микроскопов и наиболее частой причиной их выхода из строя являются пыль и грибы, во внерабочем состоянии микроскоп всегда должен быть накрыт чехлом и храниться в сухом помещении.

Для сохранности иммерсионных объективов следует обратить особое внимание на правильное выполнение их очистки от остатков иммерсионного масла. Очистку объектива рекомендуется производить следующим образом:

- вывинтить объектив из револьверного устройства или установить его в положение, удобное для чистки;

- сухой салфеткой одним движением руки снять иммерсионное масло с передней линзы объектива;

- смочить другую салфетку в смеси спирта и эфира с таким расчетом, чтобы она была слегка увлажненной;

- аккуратно протереть линзу объектива; при сильном загрязнении операцию можно повторить, используя чистый вновь смоченный тампон;

- по окончании очистки линзу протирают сухим тампоном.

Операции очистки следует проводить очень аккуратно и осторожно; необходимо следить за степенью увлажненности салфетки; она должна быть слегка увлажнена растворителем.

Ежемесячно необходимо:

- удалить пыль с корпуса микроскопа специальной щеткой с подачей воздуха (простое устройство может быть сделано из пастеровской пипетки и прикрепленной к ней резиновой груши);

- очистить объективы, окуляры и конденсоры тампоном или кусочком специальной ткани, смоченной ксилолом, спирто-эфирной смесью или спиртом;

- снять с предметного столика препаратоводитель предметных стекол и очистить его;

- протереть влажной тканью отверстие источника света в основании микроскопа.

Через каждые 6 месяцев микроскоп должен подвергаться профилактическому осмотру, чистке и смазке, которые проводятся специалистом.

Исследуемый материал и бланки исследований

- Микроскопическое исследование производится только при наличии письменного направления на исследование от уполномоченных лиц.

- По устной просьбе, не подтвержденной получением соответствующих документов, исследования не проводятся.

- Бланки направлений на исследование хранятся отдельно от полученного материала. Загрязненные бланки перед регистрацией в лабораторном журнале стерилизуются в сухожаровом шкафу или (при отсутствии шкафа) проглаживаются горячим утюгом.

- Бланки направлений должны быть правильно оформлены, а каждая полученная проба диагностического материала правильно промаркирована. Не следует производить исследование безымянных проб или проб с неправильно оформленными направлениями.

- При регистрации необходимо оценить качество пробы, чтобы отобрать и отделить пробы, содержащие слюну. Ответ может быть сформулирован следующим образом: "Поступившая проба похожа на слюну. Рекомендуется повторить сбор мокроты". Диагностический материал в виде слюны может быть исследован только при прямом назначении врача в исключительных случаях, когда другой диагностический материал не может быть собран.

- Для сокращения затрат времени на оформление ответов можно использовать резиновые штампы со стандартными формулировками.

- Протекшие или поврежденные флаконы с материалом следует немедленно удалить, подвергнуть автоклавированию и запросить новую (повторную) пробу.

- На бланке направления на исследование необходимо отметить время доставки материала в лабораторию и фиксировать любые задержки в поступлении проб, что имеет особое значение при отрицательных результатах.

- Следует указывать примерный объем полученной для исследования пробы мокроты.

Реактивы и красители

- Все флаконы с реактивами и красителями заводского производства должны иметь отметку о дате получения и вскрытия заводской упаковки.Любые некачественные материалы следует специально помечать и немедленно удалять из лаборатории.

- В лаборатории или на складе следует иметь запас реактивов и расходных материалов на 6 месяцев работы.

- Необходимо регулярно контролировать сроки годности препаратов и реактивов и обновлять запасы, чтобы не было материалов с истекшим сроком хранения.

Окрашивание и исследование мазка

- При окраске мазков не следует помещать на штатив ("рельсы") и окрашивать одновременно более 12 стекол. Соприкосновение стекол боковыми краями может привести к переносу краски и микобактерий с одного стекла на соседние.

- В процессе окраски мазков при их промывании проточной водой не следует пользоваться резиновыми трубками или наконечниками для направления струи воды на препарат. В окружающей среде и водопроводной воде содержится значительное количество кислотоустойчивых сапрофитов, которые легко размножаются на резиновых поверхностях в условиях повышенной влажности. Во время промывания мазков при прохождении струи воды через загрязненные микобактериями резиновые трубки или наконечники микобактерии могут попасть на препарат и обусловить ложноположительный результат анализа.

- В число исследуемых мазков, подлежащих окрашиванию необходимо ежедневно включать контрольные неокрашенные положительный и отрицательный препараты. Вначале микроскопируют контрольные мазки, а затем - мазки от больных.

Окрашенные для исследования мазки не пригодны, если

При окраске карболовым фуксином

- в положительном контрольном мазке микобактерии не окрашены в красный цвет;

- в отрицательном контрольном мазке после обесцвечивания видны красные клетки;

- не произошло достаточного обесцвечивания фона.

При окраске флюорохромными красителями:

- отрицательные контрольные мазки дают флюоресцирующее свечение;

- в положительных контрольных мазках не обнаруживаются светящиеся микобактерии или они дают тусклую флюоресценцию;

- фон недостаточно обесцветился или имеет флюоресцентное свечение.

По окончании микроскопического исследования необходимо:

- с помощью ксилола, спирто-эфирной смеси или спирта удалить с препарата иммерсионное масло и поместить препараты в отдельные коробки, где они сохраняются для последующего проведения внешнего контроля качества или перепроверки результата микроскопии.

- не следует очищать стекло слишком энергично, чтобы не повредить препарат и не удалить с него краску;

- все положительные и отрицательные мазки необходимо укладывать в отдельные коробки для сохранения в том порядке, в котором проводилось исследование, чтобы в дальнейшем можно было провести внешний контроль качества в соответствии с установленным порядком.

Выдача ответов и администрирование

- Результаты микроскопического исследования следует передавать в медицинское учреждение или непосредственно врачу, направившему материал на исследование.

- Результаты бактериоскопии следует отсылать как можно быстрее - желательно в течение 24 часов с момента получения проб мокроты.

- Необходимо еженедельно и ежемесячно обобщать и анализировать полученные данные для ведения статистики исследований.

IV. Культуральные методы исследования микобактерий комплекса М.tuberculosis

Поступивший в лабораторию материал перед обработкой и посевом должен быть зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале. Каждой пробе материала необходимо присвоить порядковый регистрационный лабораторный номер, который должен использоваться при всех последующих лабораторных исследованиях.

4.1. Принципы предпосевной обработки диагностического материала

Обычные микробиологические методики для выделения чистых культур возбудителей, не могут быть использованы при проведении бактериологических исследований на туберкулез. Это объясняется тем, что микобактерии туберкулеза очень требовательны к составу питательной среды. Их рост происходит очень медленно и зависит от соблюдения ряда условий. Колонии микобактерий, видимые невооруженным глазом, появляются через 3-6 недель. В связи с этим во избежание высыхания питательной среды для посевов обычно применяют бактериологические пробирки с герметичными пробками (резиновые, силиконовые) или производят парафинирование ватно-марлевых пробок.

Большинство проб клинического материала, поступающего в микробиологическую лабораторию для культурального исследования на туберкулез, в различной степени загрязнены быстрорастущими бактериями, бурный рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию (обеззараживание), то есть гибель гноеродной и гнилостной микрофлоры.

Микобактерии туберкулеза, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизистых веществ, затрудняющих их выделение. В связи с этим мокроту и другие сходные материалы перед посевом подвергают разжижению и гомогенизации.

Все препараты, используемые в настоящее время для разжижения и деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий. Чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущие гноеродные и гнилостные микроорганизмы, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий.

Частота контаминации посевов в лабораториях, проводящих исследование свежесобранных проб, при культивировании мокроты на плотных яичных средах обычно составляет 2-3%. Если клинический материал до поступления в лабораторию хранится в течение нескольких дней в нерегламентированных условиях, частота контаминации может достигать 5% и более, что недопустимо. Контаминация менее 2% свидетельствует о нарушениях режима обработки материала. Для унификации результатов исследования необходимо, чтобы микробиологические лаборатории использовали для гомогенизации и деконтаминации диагностического материала один из стандартных методов, изложенных ниже.

4.1.1. Стандартные методы разжижения и деконтаминации

Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать и освободить от сопутствующей гноеродной и гнилостной микрофлоры. Для этого мокроту, экссудаты и другой негомогенный материал собирают в стерильные флаконы со стеклянными бусами или битым стеклом, добавляют щелочь или кислоту и подвергают встряхиванию.

Все процедуры по переносу материала из одной посуды в другую при обработке и посеве производятся только стерильными пипетками. Запрещается перенос материала путем переливания его через край флаконов, пробирок и пр.

Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке, подвергают только осадок

Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки диагностических материалов, должны иметь степень очистки не менее категории "химически чистый" (ХЧ). Могут использоваться как отечественные, так и импортные реактивы, имеющие степень очистки не менее, чем "химически чистый".

Для предпосевной обработки диагностического материала рекомендуется использовать следующие методы и детергенты.

4.1.1.1. Обработка материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2-3-х-дневном хранении материала при +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6-8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и поместить на 10 мин во встряхиватель.

2. Флакон с материалом поместить на 18 - 20 часов в термостат при 37°С.

3. После этого материал стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести в пробирки, уравновесить их и центрифугировать при 3000хg** в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

4. Надосадочную жидкость отобрать стерильной пипеткой на 10-5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в каждой пробирке 1,2-1,5 мл осадка.

5. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.

6. К осадку стерильно добавить несколько капель 6% соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

7. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить ее в штатив в порядке регистрационных номеров материала.

8. Для снижения токсичного воздействия на микобактерии различных остатков веществ (в том числе возможных химиопрепаратов) вводят еще одну процедуру отмывки 10-15 мл дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8-1,0 мл готовят к инокулированию и приготовлению мазка.

Далее см. разделы 2.1 Процедура посева и 2.2. Инкубация и др.

Реактивы.

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4)         -  ГОСТ 4274-76;

Кислота соляная (HCl) концентрированная               -  ГОСТ 3118-77;

Бумага индикаторная универсальная                     -  ТУ 6-09-1181-76.

Приготовление растворов.

1. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л.

2. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 94 мл дистиллированной воды.

Никогда не добавлять воду в кислоту!

4.1.1.2 Обработка материала 3% серной кислотой

Общее время обработки кислотой не должно превышать 20 мин!

Несмотря на то, что микобактерии туберкулеза не теряют жизнеспособности в сильно закисленной среде, необходимо помнить что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерии. Поэтому раствором серной кислоты производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры. Этот метод рекомендован для обработки мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр.

При обработке 3% раствором серной кислоты рекомендуется следующий порядок манипуляций:

1. Для работы правильно собранный материал (60-100 мл) используют целиком для получения осадка, так как микобактерии имея удельный вес близкий к 1,0, могут подолгу не оседать, находясь во взвешенном состоянии.

2. Из этого материала методом наслоения поэтапным центрифугированием получить осадок. Для этого перенести в 1-2 центрифужные пробирки приблизительно по 15-20 мл материала.

3. Уравновесить пробирки и центрифугировать материал при 3000 x g в течение 15 мин.

4. Надосадочную жидкость отобрать пипеткой на 10-5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в каждой пробирке 0,8-1,2 мл осадка.

5. Полученные в разных пробирках осадки одного и того же материала с помощью той же стерильной пипетки перенести в одну пробирку, плотно закрыть ее пробкой и встряхнуть.

6. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.

7. К полученному осадку добавить равный объем 3% раствора серной кислоты.

8. Выдержать полученную с кислотой смесь 10 мин при комнатной температуре (не превышать время экспозиции!).

9. Центрифугировать смесь при 3000 g в течение 10 мин (не превышать время экспозиции!).

10. Стерильной пипеткой на 5-10 мл отобрать надосадочную жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив приблизительно 0,8-1,2 мл осадка.

11. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного 0,9% раствора хлористого натрия.

12. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

13. Стерильной пипеткой на 5-10 мл отобрать надосадочную жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив приблизительно 1,5 мл осадка.

14. Добавить в пробирку 1-2 капли 4% едкого натра до получения центрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

15. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить в штатив, расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Далее см. разделы 2.1 Процедура посева и 2.2. Инкубация и др.

Реактивы:

     1. Серная кислота (H2SO4) концентрированная          - ГОСТ 4204-77;

     2. Едкий натр (NaOH)                                 - ГОСТ 4328-77;

Приготовление растворов

1. 3% раствор серной кислоты. К 97 мл дистиллированной воды добавляют 3 мл концентрированной серной кислоты, осторожно наслаивая ее по стенкам сосуда.

Внимание! Кислоту следует добавлять в воду, а не наоборот!

Не пипетируйте концентрированную серную кислоту ртом!

2. 4% раствор едкого натра. 40 г NaOH заливают дистиллированной водой до объема 1 литр.

Обработка материала 4% раствором едкого натра (модифицированный метод Петрова)

Общее время обработки материала щелочью не должно превышать 40 мин!

Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала. Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов.

Гидроокись натрия токсична по отношению как к загрязняющим микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза.

Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6-8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить двойным объемом 4% раствора едкого натра и поместить на 10 мин во встряхиватель.

2. Выдержать полученную со щелочью смесь 15 мин при комнатной температуре с периодическим ручным встряхиванием (не превышать время экспозиции!).

3. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести обработанный материал в пробирки.

4. Пробирки уравновесить и центрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

4. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором оставив в пробирке 0,8-1,2 мл осадка.

5. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного 09% раствора хлористого натрия.

6. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать материал при 3000 g в течение 15 мин.

7. Стерильной пипеткой объемом 5-10 мл перенести надосадочную жидкость в емкость с дезинфицирующим раствором оставив в пробирке 1,2-1,5 мл осадка.

8. К осадку добавить 1-2 капли 10% раствора соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

9. Закрыть пробирку и встряхнуть ее содержимое.

10. Пробирку с осадком поместить в штатив, расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Реактивы.

1. Едкий натр (NaOH)                                     -  ГОСТ-4328-77;

2. Кислота соляная (НСl) концентрированная               -  ГОСТ 3118-77;

Приготовление растворов.

1. 4% раствор едкого натра. 40 г едкого натра заливают дистиллированной водой до объема 1 литр.

2. 10% раствор соляной кислоты. 10 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 90 мл дистиллированной воды. Растворы стерилизуют 20 мин при 1 атмосфере.

4.1.2. Альтернативные методы обработки материала

В регионах с достаточными материальными ресурсами могут применяться более дорогие и трудоемкие методы гомогенизации и деконтаминации (Kent P.T., Kubica G.P. Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, USA, 1985). К ним относятся следующие методы:

4.1.2.1 Метод с использованием N-ацетил-l-цистеина и гидроокиси натрия (NALC-NaOH)*

Применение муколитического препарата NALC, используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1%. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина. Этот метод дает больший выход высеваемости микобактерий, однако требует больше затрат времени и средств.

4.1.2.2 Метод с использованием 5% щавелевой кислоты или 4% серной кислоты

Иногда лабораторным работникам приходится сталкиваться с чрезмерно высокой контаминацией некоторых проб. Это создает большие сложности в работе. В таких случаях можно применить более жесткие методы деконтаминации с использованием 5% щавелевой кислоты или 4-6% серной кислоты.

Эти методы нередко дают хорошие результаты в тех случаях, когда пробы мокроты оказываются массивно загрязненными Pseudomonas sp. и другими грамотрицательными микроорганизмами.

Процедура обработки соответствует обработке 3% раствором серной кислоты (см. выше).

4.2. Материалы, не нуждающиеся в деконтаминации

Следующие биологические жидкости и ткани не нуждаются в деконтаминации, если они были взяты в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики:

- спинномозговая, синовиальная и другие жидкости из закрытых полостей;

- костный мозг;

- гной из "холодных" абсцессов;

- резецированные ткани (за исключением материала аутопсии);

- пунктаты печени и лимфатических узлов, а также материалы биопсий (при отсутствии свища).

Если возникают сомнения в контаминации образцов, можно провести посев части пробы без какой-либо предварительной обработки на неселективную питательную среду (например, на простой питательный агар или сахарный бульон) и инкубировать в течение 24 часов для того, чтобы проконтролировать наличие в образце сопутствующих гноеродных или гнилостных бактерий (не микобактерий). Остальную часть пробы хранят без какой-либо обработки в холодильнике до тех пор, пока не будет подтверждено отсутствие контаминирующих бактерий. Если при этом будет установлен факт контаминации, оставшуюся часть пробы можно деконтаминировать одним из описанных выше методов.

4.3. Техника посева и инкубации, оценка и учет результатов

Достоверная клиническая интерпретация результатов микробиологического обследования достигается при обязательном соблюдении следующего правила:

Микроскопическое и культуральное исследования должны производиться параллельно только из одной и той же пробы диагностического материала.

4.3.1. Процедура посева

Рабочее место микробиолога организуется таким образом, чтобы исключить операторские ошибки.

Перед процедурой посева необходимо подготовить пробирки с питательными средами, пронумеровать их, согласно нумерации анализов, и последовательно расположить в вертикальном штативе. Аналогичным образом подготовить и пронумеровать предметные стекла для приготовления мазков.

Перед началом забора посевного материала пипеткой убедиться в том, что номер пробирки с посевным материалом соответствует номерам пробирок с питательной средой и номеру предметного стекла для приготовления мазка.

Проверяют соответствие расположения пробирок с готовым осадком и предметных стекол в порядке их регистрационных номеров;

- набрать стерильной мерной или пастеровской пипеткой 1,0-1,2 мл полученного после обработки и нейтрализации осадка, оставив приблизительно 0,2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии;

- соблюдая условия стерильности, внести равные объемы набранного материала (примерно по 0,5-0,6 мл) в 2 пробирки с разными плотными питательными средами;

- пробирки с питательной средой при посеве должны находиться в наклонном положении (под углом 40-45°);

- посевной материал нанести на верхнюю треть косяка питательной среды;

- засеянные пробирки закрыть ватно-марлевыми и поместить в наклонном положении в штатив таким образом, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей поверхности косяка питательной среды; можно использовать дренированные (с продетым льняным или хлопчатобумажным шнуром) силиконовые пробки соответствующего диаметра;

- остаток осадка забрать той же пипеткой и нанести на подготовленное и пронумерованное предметное стекло 1-2 капли осадка для получения мазка;

- использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором;

- по завершении посева всех проб засеянные пробирки переместить в горизонтальные штативы - "диваны" и поместить в термостат при температуре 37°С; при этом поверхность косяка питательной среды должна находиться в горизонтальной плоскости, а наклон штатива должен исключить смачивание пробки материалом засева. Подготовленные мазки оставляют сушиться на воздухе.

4.3.2. Инкубация

Инкубация микобактерий туберкулеза имеет свои особенности. Они заключаются в том, что микобактерий размножаются чрезвычайно медленно - время деления микробной клетки составляет 18-24 часа. Это требует длительного срока инкубации для получения видимого роста колоний. Длительный срок инкубации диктует необходимость соблюдения ряда правил для сохранения жизнеспособности клеток и ростовых свойств питательной среды. Кроме того, микобактерий туберкулеза требовательны к составу питательных сред, составу газовой среды и чувствительны к различным токсическим агентам, которые могут поступать в пробирку или вместе с воздухом или из некачественной среды, сопровождать процедуры получения осадка. Оптимальная температура инкубации - 37°С. При снижении температуры скорость размножения микобактерий туберкулеза быстро снижается.

При первичном посеве микроскопически отрицательного материала средняя продолжительность роста микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах может составить 20-46 дней. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и даже 90 дней. Это обусловливает необходимость при отсутствии роста микобактерий для выдачи отрицательного результата выдерживать посевы в термостате до 12 недель.

В процессе инкубации посевов необходимо соблюдать следующее:

- по истечении первых 2-3 суток инкубации ватно-марлевые или дренированные силиконовые пробки заменяют герметичными резиновыми или силиконовыми;

- после этого засеянные пробирки переводят в вертикальное положение;

- инкубацию проводят в течение 12 недель при обязательном еженедельном просмотре;

- во время еженедельных просмотров регистрируют следующие параметры для каждой питательной среды:

- "появление роста" - срок появления роста, начиная со дня посева;

- "интенсивность роста" - суммарное число колониеобразующих единиц (КОЕ) на всех пробирках, засеянных данным материалом, если материал засевается на пробирки с одинаковыми средами (этот показатель имеет большое диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике наблюдения за больным в процессе химиотерапии); Если инокулируются разные питательные среды, результат отмечается для каждой из них.

- "загрязнение посева" неспецифической гноеродной микрофлорой или грибами;

- "отсутствие роста".

Все указанные параметры регистрируются в протоколе каждого анализа.

4.4. Питательные среды

Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить 3 основные группы:

- плотные питательные среды на яичной основе;

- плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе;

- жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды.

Каждая из этих сред имеет положительные и отрицательные особенности.

В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев диагностического материала одновременно на 2-3 питательные среды разного состава.

В России культуральные исследования диагностического материала традиционно осуществляются на плотных яичных средах. Существует большое количество плотных питательных сред, и разные лаборатории используют различные среды: Левенштейна-Йенсена, Петраньяни, Гельберга, Финна, Мордовского (среда "Новая"), Аникина (А-6 и А-9), Попеску и др.

В результате многочисленных сравнительных испытаний установлено, что для культуральной диагностики туберкулеза следует использовать как минимум две разные по составу питательные среды. Наиболее широкое распространение получил набор из 2 яичных сред - Левенштейна-Йенсена и Финна-II.

4.4.1. Среда Левенштейна-Йенсена

Среда Левенштейна-Йенсена применяется во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Эта среда рекомендуется для использования всеми микробиологическими лабораториями противотуберкулезной службы Российской Федерации для получения сравнимых результатов. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерий туберкулеза получают на 15-25-й день после посева микроскопически положительного материала. В состав этой питательной среды входит глицерин, который способствует росту М.tuberculosis. Для культивирования М. bovis среду Левенштейна-Йенсена обогащают 0,5% пируватом натрия, исключив из солевого раствора глицерин. С этой целью в состав солевого раствора вместо глицерина добавляют 8,0 г пирувата натрия. Применение этой модификации среды рекомендуется в тех территориях, где возможно распространение М. bovis.

Реактивы:

Калий однозамещенный фосфорнокислый KH2PО4          -  ТУ-6-09-5324-87;

Магний лимоннокислый Mg3(C6H5O7)2 х 14H2O           -  ТУ-6-09-1770-77;

Магний сернокислый MgSO4 х 7Н2O                     -  ГОСТ 4523 - 77;

L-аспарагин C4H8N2O3 х Н2О                          -  импортный реактив;

Глицерин С3Н8О3                                     -  ГОСТ 6259-75;

Малахитовый зеленый С52H54О12N4                     -  ТУ-6-09-1557-77;

Вода дистиллированная                               -  ГОСТ 6709-77

Состав среды:

Раствор минеральных солей

Калий однозамещенный фосфорнокислый                            -  2,4 г

Магний сернокислый                                             -  0,24 г

Магний лимоннокислый                                           -  0,6 г

L-аспарагин                                                    -  3,6 г

Глицерин                                                       -  12,0 мл

Вода дистиллированная                                          - 600 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Затем стерилизуют в автоклаве 30 минут при 1 атм. (121°С). Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

Раствор малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый                                            -     2 г

Стерильная дистиллированная вода                                -  100 мл

Растворить в стерильной дистиллированной воде малахитовый зеленый, поместив раствор в термостат на 1-2 часа. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению и при появлении осадка или изменении окраски его следует заменить свежим раствором. Стерилизовать при 1 атм. 30 мин.

Яичная масса:

Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70° этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20-25 яиц в зависимости от их величины). Тщательно взбивают стерильным венчиком или в стерильном миксере.

Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила стерильности, помещают следующие растворы:

Раствор минеральных солей                                      -   600 мл

Гомогенизированная яичная масса                                -  1000 мл

Тщательно перемешивают и фильтруют через 4-хслойный стерильный марлевый фильтр.

Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 минут разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем чтобы в растворе не сформировался осадок.

Свертывание среды.

Для свертывания среды используются специальные аппараты-свертыватели типа "АСИС". Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования косяка среды. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85°С в течение 45 минут. Приготовление питательной среды проводится в условиях соблюдения стерильности так как свертывание является не стерилизующей, а лишь коагулирующей процедурой.

Качество приготовленной яичной среды зависит от соблюдения температурного и временного режимов коагуляции. Обесцвечивание среды, наличие пузырьков или углублений на ее поверхности свидетельствует о нарушении режима свертывания. Повторное свертывание также ухудшает качество среды. Среды с нарушенным режимом свертывания подлежат удалению.

Проверка на стерильность.

После свертывания каждая вновь приготовленная партия среды подвергается контролю на стерильность. Для этого она помещается в термостат и выдерживается в нем 2-3 суток при 37°С.

Хранение.

Приготовленная партия среды должна иметь дату изготовления и сохраняться в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели.

4.4.2. Среда Финн-II

Среда Финн-II рекомендована в нашей стране как вторая стандартная среда для выделения микобактерий. Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо L-аспарагина в ней используется глутамат натрия и подбор солей рассчитан таким образом, что конечная кислотность среды (рH = 6,3 - 6,8) имеет более низкое значение и большую стабильность по сравнению со средой Левенштейна-Йенсена. Эти свойства обусловливают более высокую эффективность среды при засеве материала, обработанного щелочными детергентами.

Рост микобактерий появляется на этой среде на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена, а выделение культур на 6-8% выше.

Реактивы:

Магний сернокислый MgSO4 х 7Н2О                       -  ГОСТ 4523-77;

Натрий лимоннокислый C6H5O7Na3 х 5,5Н2О               -  ГОСТ 22280-86;

Квасцы железоаммонийные Fe(NH4) х (SO4)2 х 12H2O      -  ГОСТ 4205-77;

Калий однозамещенный фосфорнокислый KH2PO4            -  ТУ-6-09-5324-87;

Аммоний лимоннокислый однозамещенный C8H11O7N         -  ГОСТ 7234-79;

Натрий     глутаминовокислый      однозамещенный      -  ТУ 6-09-337-70;

C5H8NnaO4 х Н2O

Глицерин С3Н8О3                                       -  ГОСТ 6259-75;

Малахитовый зеленый - С52Н54О12N4                     -  ТУ-6-09-1557-77;

Вода дистиллированная                                 -  ГОСТ 6709-77.

Состав среды:

Раствор минеральных солей:

Магний сернокислый                                          -  0,5 г

Натрий лимоннокислый                                        -  0,1 г

Квасцы железоаммонийные                                     -  0,05 г

Калий однозамещенный фосфорнокислый                         -  20 г

Аммоний лимоннокислый однозамещенный                        -  5 г

Натрий глутаминовокислый однозамещенный                     -  10 г

Глицерин                                                    -  20 мл

Вода дистиллированная                                       -  до 1000 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Кислотность не корригируют. Стерилизуют в автоклаве 30 минут при 1 атм. (121°С). Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

Раствор малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый                                            -  2 г

Стерильная дистиллированная вода                               -  100 мл.

Растворить в стерильной дистиллированной воде малахитовый зеленый, поместив раствор в термостат на 1-2 часа. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению и при появлении осадка или при изменении окраски его следует заменить свежим раствором. Стерилизовать при 1 атм. (121°С) 30 мин.

Яичная масса.

Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20-25 яиц в зависимости от их величины). Тщательно взбивают стерильным венчиком или в стерильном миксере.

Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила стерильности помещают следующие растворы:

Раствор минеральных солей                                     -   600 мл

Гомогенизированная яичная масса                               -  1000 мл.

Тщательно перемешивают и фильтруют через 4-х слойный стерильный марлевый фильтр.

Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 минут разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем чтобы в растворе не сформировался осадок.

Свертывание среды.

Для свертывания среды используются специальные аппараты-свертыватели типа "АСИС". Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования косяка среды. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85°С в течение 45 минут. Так как приготовление питательной среды проводится в условиях соблюдения стерильности, свертывание является не стерилизующей, а лишь коагулирующей процедурой.

Качество приготовленной яичной среды зависит от соблюдения температурного и временного режимов коагуляции. Обесцвечивание среды, наличие пузырьков или углублений на поверхности среды свидетельствует о нарушении режима свертывания. Повторное свертывание также ухудшает качество среды. Среды с нарушенным режимом свертывания подлежат удалению.

Проверка на стерильность.

После свертывания каждая вновь приготовленная партия среды подвергается контролю на стерильность. Для этого она помещается в термостат и выдерживается в нем 2-3 суток при 37°С.

Хранение.

Приготовленная партия среды должна иметь дату изготовления и сохраняться в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недель.

4.4.3. Среда Школьниковой

В повседневной работе микробиологической лаборатории наряду с плотными питательными средами используются и жидкие, например, для нейтрализации рН посевного материала, при изучении лекарственной чувствительности микобактерий и т.д. Наиболее широко распространенной и хорошо зарекомендовавшей себя в России жидкой питательной средой является среда Школьниковой.

Реактивы:

Калий однозамещенный фосфорнокислый КН2РО4            -  ТУ 6-09-5324-87;

Натрий двузамещенный фосфорнокислый Nа2НРО4           -  ГОСТ 4172-76;

Магний сернокислый MgSO4 х 7H2O                       -  ГОСТ 4523-77;

Натрий лимоннокислый С6H5О7Na3 х 5,5H2O               -  ГОСТ 22280-86;

Лимоннокислое аммиачное железо FeNH4C6H5O7            -  ТУ 6-09-1114-76;

L-аспарагин С4H8N2О3 х Н2О                            -  импортный;

Глицерин С3Н8О3                                       -  ГОСТ 6259-75;

Вода дистиллированная                                 -  ГОСТ 6709-77.

Состав среды:

Калий однозамещенный фосфорнокислый                         -  1,5 г

Натрий двузамещенный фосфорнокислый                         -  2,5 г

Магний сернокислый                                          -  0,5 г

Натрий лимоннокислый                                        -  1,5 г

Лимоннокислое аммиачное железо                              -  0,05 г

L-аспарагин                                                 -  1,0 г

Глицерин                                                    -  30 мл

Вода дистиллированная                                       -  до 1000 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Среду фильтруют через бумажный фильтр и разливают в колбы. Кислотность среды не корригируют, так как она содержит буферную смесь солей с рН среды 7,0-7,2.

Стерилизуют в автоклаве 30 минут при 1 атмосфере (121°С). Срок хранения среды составляет 2-3 месяца при комнатной температуре.

4.5. Оценка и учет результатов посева диагностического материала

4.5.1. Оценка результатов посева

При оценке результатов культурального исследования диагностического материала необходимо соблюдать следующие правила.

1) Посевы, выполненные в течение одного дня, помещать в отдельные ящики или штативы с указанием даты посева и размещать их в термостате в порядке номеров регистрации в хронологическом порядке, не нарушая его при еженедельных просмотрах;

2) Наблюдение за посевами и просмотр засеянных пробирок проводить еженедельно;

3) При оценке результатов регистрировать следующие параметры:

- появление роста - срок появления, начиная со дня посева;

- интенсивность роста - число колоний;

- загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами;

- отсутствие роста.

Соблюдение этих правил позволяет, во-первых, своевременно выявлять макроскопически видимый рост микобактерий или загрязняющей микрофлоры, а, во-вторых, на основании регистрации сроков появления роста и его особенностей осуществлять первичную идентификацию микобактерий. При этом необходимо иметь в виду:

- появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7-10 дней культивирования на плотных питательных средах может свидетельствовать либо о выделении быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий, к которым комплекс М.tuberculosis не относится, либо о массивном обсеменении материала М.tuberculosis; перед выдачей ответа такие культуры должны подвергнуться первичной идентификации.

- появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3-4 недель культивирования свидетельствует о выделении М.tuberculosis, а также других медленнорастущих микобактерий, которые могут относиться к потенциально патогенным нетуберкулезным микобактериям или к безвредным кислотоустойчивым сапрофитам;

- прежде, чем дать отрицательный ответ после 12 недель культивирования, необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленнорастущих микобактерий, в числе которых могут быть и М.tuberculosis.

При оценке результатов необходимо помнить, что используемые для посева питательные среды представляют собой обогащенный субстрат, который легко утилизируется другими микроорганизмами. Это обуславливает высокий риск загрязнения посевов различными бактериями и грибами, колонии которых визуально трудно отличить от микобактерий.

Во время еженедельных просмотров посевов при подозрении на загрязнение посева гноеродной или гнилостной микрофлорой необходимо, прежде всего, удалить и уничтожить (автоклавирование, сжигание) те посевы, в которых отмечается загрязнение всей поверхности питательной среды или изменение самой питательной среды (разжижение или обесцвечивание).

В ряде случаев некоторые загрязняющие посевы микроорганизмы обладают способностью разлагать составные ингредиенты среды с образованием кислоты; это приводит к снижению рН среды, высвобождению малахитового зеленого от его связей с компонентами яичной основы и изменению цвета среды на темно-зеленый. На такой среде микобактерий не растут, и такие посевы подлежат удалению.

Посевы с частичным загрязнением желательно выдержать до окончания срока инкубации или до развития хотя бы нескольких колоний микобактерий, так как позднее появление загрязнения не исключает роста М.tuberculosis. В таких случаях необходимо сделать мазок культуры, окрасить его по Ziehl-Neelsen и при наличии кислотоустойчивых микобактерий попытаться обработать выросшую культуру 3-4% раствором серной кислоты, а после отмывания ее изотоническим раствором хлорида натрия вновь засеять осадок на питательные среды.

Во всех случаях получения роста во избежание неверного результата и загрязнения необходимо контролировать чистоту выросшей культуры с помощью микроскопии мазка по Ziehl-Neelsen.

4.5.2. Характеристика колоний М.tuberculosis

Обычно культуры микобактерий туберкулеза от впервые выявленных больных растут на плотных питательных средах в виде R-колоний (от английского слова rough - грубый, шершавый) различной величины и вида, имеют желтоватый (не желтый!) или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту. Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или некоторых нетуберкулезных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме (от английского слова smooth-гладкий). Следует отметить, что на среде Финна колонии часто выглядят более влажными, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы).

При культуральном исследовании ответ о выделении кислотоустойчивых микобактерий дается только после микроскопии окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из выросших колоний.

При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулеза проявляют свои физико-химические особенности: они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию. Это обусловлено наличием в составе их клеточной стенки большого количества гидрофобных жиро-восковых субстанций.

При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Ziehl-Neelsen, обнаруживаются яркие малиново-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами, образующие скопления или переплетения в виде "войлока" или "кос". Микобактерии туберкулеза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1-10 (чаще 1-4) мкм, шириной 0,2-0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами. Часто в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно окрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерий отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких почти кокковидных форм.

Если морфология колоний или микобактерий вызывает сомнения в их принадлежности к роду Mycobacterium или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом 40-45 минут. Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут сравнительно легко обесцвечиваться спиртом, так как они обладают слабой кислотоустойчивостью. В таких случаях культуры следует выдержать в термостате еще 5-10 дней и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их тинкториальных свойствах.

Нетуберкулезные и авирулентные сапрофитные микобактерии могут варьировать по форме колоний и морфологии клеток. Некоторые из них грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены и редко образуют жгутообразные скопления. Однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в виде характерной для микобактерий туберкулеза R-форме. Многие нетуберкулезные и сапрофитные микобактерии имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные по морфологии с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.

4.5.3. Учет результатов посева диагностического материала

При выделении культуры кислотоустойчивых микобактерий, отвечающих вышеперечисленным характеристикам, а именно:

- появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее 3-4 недель инкубации;

- наличие колоний характерной морфологии и окраски;

- микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по Ziehl-Neelsen;

следует произвести количественную оценку интенсивности роста.

Интенсивность роста обозначают по 3-х балльной системе:

(1+) - 1- 20 КОЕ - "скудное" бактериовыделение;

(2+) - 21-100 КОЕ -"умеренное" бактериовыделение;

(3+) - >100 КОЕ - "обильное" бактериовыделение.

Регистрируют число КОЕ, выросших на каждой из пробирок с разными питательными средами.

Величина КОЕ (число колониеобразующих единиц) высчитывается как среднее по результатам подсчета числа колоний, выросших на всех пробирках.

Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в компьютерную базу данных полицевого учета.

V. Дифференциация микобактерий комплекса Mycobaterium tuberculosis

5.1. Предварительная идентификация комплекса mycobateriiim tuberculosis

Первичная идентификация микобактерий комплекса М.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам:

- скорость роста на плотных питательных средах;

- пигментообразование;

- морфология колоний;

- наличие кислотоустойчивости;

- температура роста.

Таблица 5

Культуральные признаки комплекса М.Tuberculosis

Культуральные признаки	Комплекс М.tuberculosis
Скорость роста	Медленнорастущие >3 недель
Пигментообразование	Цвет слоновой кости
Морфология колоний	R или S формы
Наличие кислотоустойчивости	Выраженная кислотоустойчивая окраска
Температура роста	Оптимальный рост при 35-37°С

Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении микобактерий туберкулеза может быть сделано опытным бактериологом на основании вышеперечисленных характерных признаков, подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерий к комплексу М.tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов является обязательным.

5.2. Основные биохимические тесты идентификации М.tuberculosis

К сожалению, не существует какого-либо одного лабораторного метода, позволяющего с достоверностью отличить микобактерии комплекса М.tuberculosis от других кислотоустойчивых микобактерий. Тем не менее, сочетание вышеописанных признаков с результатами ряда приводимых ниже биохимических тестов позволяет провести идентификацию микобактерий комплекса М.tuberculosis с точностью до 95% (см. Таблицу 6).

Для дифференциации микобактерий комплекса М.tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий; М.tuberculosis, М.bovis., М.africanum, М.microti - от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий необходимо применять следующие основные биохимические тесты:

- тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);

- тест на наличие нитратредуктазной активности;

- тест на наличие термостабильной каталазы;

- тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).

В качестве дополнительных можно использовать также следующие тесты:

- рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты;

- рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия.

Для дифференциации М.tuberculosis и М.bovis следует учитывать результаты следующих проб:

- ниациновый тест;

- тест на наличие нитратредуктазы;

- тест на наличие пиразинамидазы;

- рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (ТСН).

Таблица 6

Тесты для дифференциации микобактерий комплекса М.Tuberculosis

Дифференциальные тесты	Микобактерии
	М.tuberculos is	Нетуберку- лезные медленнора- стущие
Основные биохимические тесты на наличие:
Никотиновой кислоты	+	-*(1)
Нитратредуктазы	+	+-
Термостабильной каталазы	-	+
Рост на среде с натрием салициловокислым (1000 мкг/мл)	-	+/+-
Дополнительные тесты: рост на средах, содержащих:
Паранитробензойную кислоту (500 мкг/мл)	-	+*(2)
Натрия хлорид 5%	-	+*(3)

------------------------------

*(1) 3а исключением М.simae

*(2) 3а исключением М.gasfri

*(3) 3а исключением М.marinum, М.terrae

Таблица 7

Тесты для дифференциации отдельных видов микобактерий комплекса М.tuberculosis

Дифференциальные тесты	Виды микобактерий комплекса М. tuberculosis
	М.tubercu losis	М.bovis	М.africanu m	М.microti
Основные биохимические тесты на наличие
Никотиновой кислоты	+	-	+/-	+/-
Нитратредуктазы	+	-	-	-
Термостабильной Каталазы	-	-	-	-/+
Рост на среде с натрием салициловокислым (1000 мкг/мл)	-	-	-	-
Дополнительные тесты рост на средах, содержащих:
Пиразинамид	+	-	+	+
Мочевина	+/-	+/-	+	+/-
Гидролиз твина в течение 10 дней	-/+	-/+	-	-/+
ТСН (1 мкг/мл)	+	-	+/-	+/-

5.2.1. Ниациновый тест

Ниацин (производное никотиновой кислоты) играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерии, однако исследования показали, что у М.tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Ниацинотрицательные штаммы М.tuberculosis встречаются чрезвычайно редко. В то же время ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации М.tuberculosis, так как отдельные штаммы М.bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (М.simiae, М.chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию. Это указывает на необходимость при дифференциации выделенных микобактерий не ограничиваться только ниациновой пробой, а использовать весь рекомендованный выше комплекс реакций.

Принцип метода. Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, поэтому именно эта среда используется для проведения ниациновой пробы. Подлежащая дифференциации культура микобактерий должна быть выращена на среде Левенштейна-Йенсена в течение не менее 3-4 недель и должна иметь достаточно массивный (не менее 50 колоний) рост.

При отрицательном результате реакции следует повторить ее после 6 или более недель инкубации посева, так как возможно, что молодая культура микобактерий не выделила достаточное для реакции количество никотиновой кислоты.

При постановке ниациновой пробы необходимо иметь в виду, что М.tuberculosis выделяют продуцируемую ими никотиновую кислоту в питательную среду, на которой они выращиваются. В связи с этим при наличии на поверхности косяка с питательной средой сливного роста микобактерий возможен ложноотрицательный результат реакции, так как экстрагирующий ниацин реактив не всегда может проникнуть в глубь питательной среды. Для облегчения проникновения экстрагирующего реактива в питательную среду необходимо при наличии на ее поверхности сливного роста микобактерий либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность культуры.

Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку.

Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками.

Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичны при ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Пробу следует проводить только в вытяжном шкафу! Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов.

В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия - вещества более безопасного и доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3-4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.

Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными.

Реактивы для пропитывания бумажных полосок:

Раствор 1. 20% раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты)

В пробирку с 1,75 мл 96° этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК.

Смесь подогревают на водяной бане при 56°С в течение 5-10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.

Раствор 2. 60% раствор роданистого калия Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты

(200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).

Раствор 3. 50% раствор хлорамина "Б" 3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56-60°С при периодическом встряхивании.

Индикаторные бумажные полоски размером 60 х 80 мм готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке:

- 20% раствор ПАСК - на отмеченный карандашом конец полоски;

- 60% раствор роданистого калия - на середину полоски;

- 50% горячий раствор хлорамина "Б" - на свободный конец 1 полоски.

- Между каплями должны оставаться сухие промежутки.

Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, затем помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.

Процедура исследования

- Добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий 1-1,5 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии сливного роста проткнуть поверхность среды в нескольких местах пипеткой для облегчения доступа раствора к питательной среде;

- поместить пробирку в термостат на 2-3 часа в полугоризонтальном положении с тем, чтобы жидкость покрывала всю поверхность среды;

- вынуть пробирку из термостата и перевести ее в вертикальное положение, позволив жидкости стечь на дно в течение 5-6 минут;

- в чистую стерильную пробирку перенести пипеткой 0,5-0,6 мл экстракта;

- индикаторную полоску помеченным карандашом концом на который нанесена ПАСК, опустить с помощью пинцета в пробирку с экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью средней части полоски, на которую был нанесен роданистый калий;

- немедленно закрыть пробирку резиновой пробкой;

- оставить при комнатной температуре на 15-30 минут; допустимо осторожно покачивать пробирку, пока вся полоска не пропитается экстрактом;

- наблюдать за окрашиванием жидкости на дне пробирки на белом фоне.

При положительном ниациновом тесте экстракт окрашивается в желтый цвет разной интенсивности. Любая окраска индикаторной полоски не принимается во внимание, так как это может происходить вследствие окисления реактивов в верхней части полоски. Для дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10% раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым щелочным дезинфицирующим средством.

5.2.2. Тест на наличие нитратредуктазы

При дифференциации микобактерий туберкулеза применяется также реакция восстановления нитратов в нитриты. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых нетуберкулезных микобактерий, у которых этот фермент отсутствует. Из всех микобактерий нитратредуктазная активность наиболее выражена у М.tuberculosis. Это позволяет использовать данный тест в сочетании с ниациновым тестом для дифференциальной диагностики М.tuberculosis и микобактерий других видов.

Для определения способности микобактерий редуцировать нитраты используют 4-х недельные культуры с обильным ростом, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена.

Принцип метода заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного нитрита из нитрата, что сопровождается цветной реакцией с парадиметиламинобензальдегидом.

5.2.2.1. Классический метод

Приготовление реактивов:

Раствор 1. Нитрат натрия в фосфатном буфере.

0,01 М раствор нитрата натрия в 0,022 М фосфатном буферном растворе (pH= 7,0) готовится следующим образом:

А. 3,02 г КН2РО4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды;

Б. 3,16 г Na2HPO4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды;

В. 611 мл раствора Б добавить к 389 мл раствора А, хорошо смешать (величина рН раствора должна составлять 7,0).

В 1000 мл полученного буферного раствора (В) растворить 0,85 г NaNO3.

Разлить полученный раствор 1 в емкости по 100 мл. Стерилизовать в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. При необходимости этот раствор можно переносить по 2 мл в пробирки с завинчивающимися крышками.

Раствор 2. Раствор соляной кислоты

Концентрированная соляная кислота                                   10 мл

Дистиллированная вода                                               10 мл

Медленно влить концентрированную соляную кислоту в дистиллированную воду, чтобы получить разведение 1:1.

Никогда не вливайте воду в кислоту!

Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Раствор 3. Раствор сульфаниламида (0,2%).

Сульфаниламид                                                       0,2 г

Дистиллированная вода                                             100 мл

Растворить сульфаниламид в дистиллированной воде. Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Раствор 4. Раствор N-нафтилэтилендиамина (0,1%).

N-нафтилэтилендиамин                                                0,1 г

Дистиллированная вода                                             100 мл

Растворить нафтилэтилендиамин в дистиллированной воде. Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Контроль реактивов

Перед выполнением теста необходимо проконтролировать пригодность реактивов:

отрицательный контроль - тест с экстрактом из пробирки с незасеянной средой;

положительный контроль - тест с экстрактом референс-штамма M.tuberculosis H37Rv.

Процедура выполнения классического теста

Внести 0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в пробирку с завинчивающейся крышкой;

С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендировать в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий (использовать две лопатки биомассы бактерий);

Добавить 2 мл раствора 1 (раствор нитрата натрия в буфере);

Хорошо встряхнуть и оставить на 3 часа в водяной бане при температуре 37°С;

Добавить в следующем порядке: 1 каплю разведенной соляной кислоты (раствор 2), хорошо встряхнуть пробирку; 2 капли 0,2% раствора сульфаниламида (раствор 3); 2 капли 0,1% раствора N-нафтилэтилендиамина (раствор 4);

Немедленно проконтролировать появление розового или красного окрашивания, сравнив его интенсивность с цветовым стандартом.

Результаты и их интерпретация

Отрицательный результат - окрашивания нет. Если раствор остается бесцветным, это означает, что результат теста отрицательный или что процесс восстановления прошел слишком быстро, при этом нитриты восстановились до нитридов. Для того, чтобы убедиться в истинности результата, необходимо добавить в пробирку немного порошка цинка (небольшой объем порошка цинка перенесите из флакона на кончике слегка увлажненного аппликатора).

а) Если в растворе остался нитрат, цинк катализирует реакцию и появится красное окрашивание, что свидетельствует об истинно отрицательном результате теста.

б) Если после добавления порошка цинка красного окрашивания раствора не произошло, это означает, что результат теста положителен, но процесс восстановления прошел стадию нитрита.

Повторить тест, чтобы подтвердить его результат.

Градации интенсивности окраски:

Бледно розовая                                             =          +/-

Розовая                                                    =          1+

Темно розовая                                              =          2+

Красная                                                    =          3+

Темно красная                                              =          4+

Пурпурно красная                                           =          5+

Положительным результат считают только в тех случаях, когда интенсивность окраски составляет от 3+ до 5+.

5.2.2.2. Модифицированный метод с использованием бумажных полосок

Для определения способности бактерий редуцировать нитраты можно использовать коммерческие бумажные полоски. При использовании данной модификации нитратредуктазного теста надежные результаты получаются в тех случаях, когда микобактерии интенсивно редуцируют нитраты (например, М.tuberculosis). Поэтому при идентификации микобактерий туберкулеза этот метод дает вполне приемлемые результаты и позволяет сократить трудозатраты, хотя стоимость бумажных полосок значительно выше.

Процедура выполнения теста

Внести 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в пробирку с завинчивающейся крышкой;

С помощью бактериологической лопатки суспендировать в этом изотоническом растворе четырехнедельную культуру микобактерий в объеме 2-х лопаток;

С помощью стерильного пинцета аккуратно внести в пробирку бумажную полоску для нитратредуктазного теста; при этом не допускается увлажнение полоски каплями жидкости на стенках пробирки;

Тщательно закрыть крышку и оставить пробирку в вертикальном положении на 2 часа при температуре 37°С; После первого часа инкубации осторожно встряхнуть пробирку, не наклоняя ее и не переворачивая;

После двух часов инкубации пробирку шестикратно наклонить, чтобы индикаторная полоска омочилась полностью;

Оставить пробирку на 10 минут в наклонном положении, чтобы жидкость покрывала всю полоску;

Появление красного окрашивания в верхней части полоски означает положительный результат теста.

Результаты и их интерпретация

- Отрицательный результат - отсутствие окрашивания.

- Положительный результат - верхняя часть полоски приобретает красный цвет (оттенок от розового до темно-красного).

Предосторожности

- Перед проведением теста убедиться, что срок годности коммерческих тест-полосок не истек.

- Полоски чувствительны к солнечному свету, а также к повышенной температуре и влажности, поэтому их следует хранить в оригинальной упаковке в непрозрачном контейнере с крышкой при температуре 2-8°С.

- Не следует использовать обесцвеченные полоски. Если полоски обесцветились, они подлежат уничтожению, так как произошло снижение активности реагента.

- Результаты следует расценивать как сомнительные, если в положительном контроле получены слабоположительные или отрицательные результаты.

Стандарты интенсивности окраски, характеризующие активность нитратредуктазы

Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по выявлению способности микобактерий восстанавливать нитраты. рекомендуется использовать заранее приготовленную серию стандартов, соответствующих различной активности нитратредуктазы. Активность этой ферментной системы выражается в интенсивности окраски - от "+/-" до "5+" (См. выше). Эти стандарты можно хранить неопределенно долго и использовать при каждой постановке нитратредуктазного теста.

Реагенты

Растворы:

1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г безводного Na2HPO4 на 1000 мл воды)

2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г KH2О4 на 1000 мл воды)

3. 0,067 М раствор фосфата натрия трехзамещенного (25,47 г Na3PО4 х 12Н2О на 1000 мл воды)

4. 1% спиртовой раствор фенолфталеина (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)

5. 1% спиртовой раствор бромтимолового синего (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)

6. 0,01% раствор бромтимолового синего: внести 1,0 мл 1% раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Рабочий буферный раствор:

Смешать 35 мл раствора N 1, 5 мл раствора N 2 и 100 мл раствора N 3.

7. К 10 мл рабочего буферного раствора добавить 0,1 мл раствора N 4 и 0,2 мл раствора N 6.

Процедура

- Поставить в штатив 8 чистых пробирок (пробирки NN 1-8).

- Внести 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с N 2 до N 8)

- Внести 2 мл раствора N 7 в пробирку N 1. Это - цветовой стандарт, соответствующий реакции максимальной интенсивности ("5+").

- В пробирку N 2 внести 2 мл раствора N 7. Хорошо перемешать и перенести 2 мл в следующую пробирку (N 3). Продолжить серию двукратных разведении вплоть до пробирки N 8, из которой вылить 2 мл смеси.

- В результате будут получены следующие цветовые стандарты:

пробирка N 1                                             =           5+

пробирка N 2                                             =           4+

пробирка N 3                                             =           3+

пробирка N 5                                             =           2+

пробирка N 6                                             =           1+

пробирка N 8                                             =            +/-

- Автоклавировать пробирки, закрыть их герметично и хранить при 5°С.

5.2.3. Каталазный тест

Каталаза - это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е. обеспечивать следующую химическую реакцию: 2Н2О2 = 2Н2О + О2. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды микобактерий обладают каталазной активностью, за исключением М.bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов М.tuberculosis.

В клетках микобактерий присутствует ряд изоферментов каталазы, отличающихся по термостабильности. Необходимо отметить, что нетуберкулезные микобактерии и некоторые сапрофиты синтезируют термостабильную каталазу.

При изучении каталазной активности микобактерий используют как качественные, так и количественные тесты:

- качественный (капельный) тест, указывающий на наличие каталазы (выполняется при комнатной температуре);

- полуколичественный тест, указывающий на уровень каталазной активности (измеряется высотой столбика пузырьков в пробирке);

- тест на термостабильность каталазы - тест определения наличия каталазы при 68°С и рН = 7,0.

Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы М.tuberculosis продуцируют каталазу, активность которой определяют капельным методом. При постановке полуколичественного теста столбик пузырьков газа не превышает 45 мм.

После прогревания бактерий при 68°С и рН=7,0 в течение 20 минут микобактерии комплекса М.tuberculosis, дают отрицательный результат

Для постановки этих тестов следует использовать двухнедельные культуры, дорощенные на среде Левенштейна-Йенсена при 35-37°С. Для выполнения указанных тестов пробирки с питательной средой помещают в свертыватель для коагуляции в вертикальном положении. При инкубации в стандартных условиях пробирки должны быть закрыты пробками, обеспечивающими газообмен и влажность. Продолжительность инкубации - 14 дней.

Реактивы

0,067 М фосфатный буферный раствор, рН =7,0

Раствор 1

Na2HPО4 безводный                                                  9,47 г

Дистиллированная вода                                           1000 мл

Растворить навеску Na2HPO4 дистиллированной воде, чтобы получить 0,067 М раствор.

Раствор 2

KH2PО4                                                             9,07 г

Дистиллированная вода                                           1000 мл

Растворить навеску КН2РО4 в дистиллированной воде, чтобы получить 0,067 М раствор.

Для получения 0,067 М фосфатного буфера смешать 611 мл раствора 1 и 389 мл раствора 2.

Раствор 3. Перекись водорода, 30%

30% раствор перекиси водорода (Н2О2) хранят в холодильнике.

- Проверить, чтобы при постановке теста был использован 30% раствор перекиси водорода, а не 3% раствор, который обычно получают из аптек.

- При работе с 30% раствором перекиси водорода используют резиновые перчатки и защитный щиток для глаз.

Раствор 4. 10% теин 80

Твин 80                                                             10 мл

Дистиллированная вода                                               90 мл

Смешать твин 80 с дистиллированной водой и автоклавировать при 121°С в течение 10 минут. В процессе автоклавирования твин 80 может образовать осадок, который можно растворить при покачивании флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения. Готовый раствор хранить в холодильнике.

Готовый каталазный реагент (смесь твина с перекисью водорода)

Непосредственно перед постановкой теста смешать равные объемы 10% раствора твина 80 и 30% раствора перекиси водорода. Для исследования каждого штамма требуется 1,0 мл каталазного реагента.

Контроли для тестов:

Капельный метод

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом М.tuberculosis H37Rv, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

Полуколичественный метод и тест на термостабильность каталазы при 68°С

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом М.terrae, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

Процедура исследования:

Капельный метод

Для постановки теста использовать двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий добавить 1-2 капли свежеприготовленной смеси твина 80 с перекисью водорода (готовый каталазный реагент). Наблюдать в течение 5 минут, происходит ли образование пузырьков газа.

Результаты и их интерпретация:

Отрицательный	Пузырьки газа не образуются
Положительный (медленный)	Несколько медленно образующихся пузырьков (1-3 мин)
Положительный (быстрый)	Немедленное бурное образование пузырьков

Полуколичественный метод

Для постановки теста использовать двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий добавить 1 мл свежеприготовленной смеси твина-80 с перекисью водорода, плотно закрыть пробирку и оставить на 5 минут при комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены.

Измерить высоту этого столбика от уровня жидкости в пробирке до верхнего края пены

Результаты и их интерпретация:

Каталазная  активность  слабая  или  Высота столбика пены менее 31 мм

отсутствует

Неопределенный результат             Высота столбика пены от 31 мм до  45

                                     мм

Высокая каталазная активность        Высота столбика пены более 45 мм

Тест на термостабильность каталазы при 68°С и рН = 7,0

Процедура исследования

С помощью стерильной пипетки внести с соблюдением правил асептики 0,5 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора (рН = 7,0) в пробирку размерами 16 х 125 мм с завинчивающейся крышкой;

С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендировать в этом растворе исследуемую культуру микобактерий (использовать несколько петель биомассы);

Поставить пробирки с бактериальными суспензиями в предварительно нагретую водяную баню на 2 часа при температуре 68°С; Температура и продолжительность инкубации имеют чрезвычайно важное значение;

Вынуть пробирки из водяной бани и оставить при комнатной температуре до полного остывания;

Внести в каждую пробирку 0,5 мл свежеприготовленной смеси твина 80 с перекисью водорода и плотно закрыть пробки;

Наблюдать за образованием пузырьков, появляющихся на поверхности жидкости. Не встряхивать пробирку, так как при этом твин 80 может спонтанно образовывать пузырьки, что станет причиной ложноположительного результата;

Пробирки с отрицательными результатами не выбрасывать раньше, чем через 20 минут.

Результаты и их интерпретация:

Положительный результат	+	Образуются пузырьки газа
Отрицательный результат	-	Пузырьков газа нет

В редких случаях может наблюдаться небольшое количество пузырьков, поднимающихся от осадка бактериальных клеток; при этом пена в пробирке не образуется. В таких случаях результаты каталазного теста также считают положительными.

5.2.4. Тест с салициловокислым натрием (салициловый тест)

Микобактерии комплекса М.tuberculosis не обладают способностью утилизировать салициловокислый натрий, который оказывает на рост микобактерий туберкулеза угнетающее воздействие. Это свойство салицилата натрия используется как один из основных биохимических методов дифференциации М.tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий.

Для проведения этого теста готовят среду Левенштейна-Йенсена, в состав которой до свертывания вводят салицилат натрия в количестве, позволяющем получить концентрацию препарата, равную 1000 мкг/мл. В качестве контрольной используют пробирку со стандартной средой Левенштейна-Йенсена.

Указанный тест чаще всего ставят одновременно с постановкой опыта по определению лекарственной устойчивости, добавляя к набору пробирок 1 пробирку с 1000 мкг/мл салициловокислого натрия. Посев суспензии исследуемой культуры микобактерий и учет результатов теста производят одновременно с посевом на среды, содержащие противотуберкулезные препараты и учетом лекарственной устойчивости.

Микобактерии комплекса М.tuberculosis не дают роста на среде с салициловокислым натрием.

При наличии лекарственной устойчивости ко всем основным противотуберкулезным препаратам необходимо убедиться, что исследуемая культура не принадлежит к нетуберкулезным микобактериям, для которых этот феномен является характерным. При этом следует иметь в виду, что видимый рост на среде с салициловокислым натрием появляется значительно позже срока, установленного для учета лекарственной устойчивости. Поэтому в таких случаях после учета результатов определения лекарственной устойчивости контрольную пробирку и пробирку с салициловокислым натрием следует сбрасывать не сразу, а лишь после окончания всех дифференцирующих тестов.

5.3. Дополнительные биохимические тесты

Для принципиального отличия микобактерий комплекса М.tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий применяются выше перечисленные в Таблице 6 дополнительные биохимические тесты. Все химические вещества, используемые в этих тестах, обладают способностью подавлять рост микобактерий комплекса М.tuberculosis. Во всех тестах применяется специально приготовленная среда Левенштейна-Йенсена, содержащая соответственно: 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты или 5% натрия хлорида. В качестве контроля в каждом из тестов используется пробирка со стандартной средой Левенштейна-Йенсена.

5.3.1. Тест с паранитробензойной кислотой (PNB-тест)

В лабораториях, в которых оборудование и/или отсутствие реагентов не позволяют производить постановку ниацинового и нитратредуктазного тестов, для идентификации микобактерий туберкулеза может быть использована комбинация одного или нескольких описанных выше каталазных тестов, а также определение способности к росту при 37°С на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту (PNB-тест).

Приготовление среды с парацитробензойной кислотой

50 мг паранитробензойной кислоты (ПНБ) хорошо растирают в ступке, добавляют 5 мл дистиллированной воды и примерно 20 капель (1,0 мл) 4% едкого натра до pH=8. После полного растворения ПНБ добавляют 2-3 капли 6% соляной кислоты, доводя рН до 7,0. Полученный раствор добавляют к 95 мл предварительно профильтрованной яичной среды, получая таким образом конечную концентрацию паранитробензойной кислоты в среде, равную 500 мкг/мл. Свертывание среды производят в обычном порядке.

Процедура исследования

- Перед проведением теста необходимо приготовить пробирки с питательной средой Левенштейна-Йенсена, содержащей паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/мл. В качестве контроля используются пробирки со стандартной средой Левенштейна-Йенсена.

- Произвести посев в две пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, одна из которых содержит паранитробензойную кислоту в концентрации 500 мкг/л, другая - контрольная без паранитробензойной кислоты.

В процессе инкубации при 37°С пробирки исследуются на 3-й, 7-й, 14-й и 21-й день.

5.3.2. Тест с 5% хлоридом натрия

Данный тест используется для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis и выполняется аналогично тесту с паранитробензойной кислотой на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 5% хлорида натрия. Метод основан на способности ряда видов нетуберкулезных микобактерий расти на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Микобактерии комплекса М.tuberculosis на этой среде не растут.

5.3.3. Пиразинамидазный тест

Тест применяется как дополнительный для дифференциации М.tuberculosis от М.bovis. Тест основан на способности М.tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие пиразинамидазы. М. bovis не проявляет пиразинамидазной активности даже после 7 дней инкубации.

5.3.4. Тест с гидразидом тиофен-2-карбоксиловой кислоты (ТСН)

Тест используется для дифференциации М.bovis от М.tuberculosis и других медленнорастущих микобактерий. Только М.bovis чувствительны к низким концентрациям ТСН (от 1 до 5 мкг/мл). М.tuberculosis и другие микобактерии обычно устойчивы к действию этого химического соединения.

Микобактерии комплекса М.tuberculosis характеризует следующая совокупность признаков:

- Медленная скорость роста (более 3-х недель).

- Температура роста в пределах 35-37°С.

- Отсутствие пигментообразования (цвет слоновой кости).

- Выраженная кислотоустойчивая окраска.

- Положительный ниациновый тест.

- Положительный нитратредуктазный тест.

- Отсутствие термостабильной каталазы (68°С).

- Отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей:

- 1000 мкг/мл натрия салициловокислого;

- 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты;

- 5% хлорида натрия.

- Рост в присутствии 1-5 мкг/мл ТСН

VI. Определение лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам

Определение спектра и степени устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий в пределах отдельной территории, страны и мирового сообщества. Степень лекарственной устойчивости микобактерий определяется в соответствии с установленными критериями, которые зависят как от противотуберкулезной активности лекарственного препарата, так и его концентрации в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы, фармакокинетики препарата и многих других факторов.

В настоящее время для определения лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам в международной практике используются следующие методы:

- метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука 7Н10,

- метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена,

- метод коэффициента резистентности;

- радиометрический метод Bactec r 460.

Выбор того или иного метода определяется традиционно сложившимися методическими подходами, используемыми в данной стране. Однако необходимо иметь в виду, что обязательным условием эффективного мониторинга, обеспечения эпидемиологического надзора за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением лекарствнно-устойчивых штаммов возбудителя, а также сопоставления результатов исследований и эффективности лечения в масштабах страны должен использоваться только один из предложенных унифицированных методов.

В нашей стране получило распространение определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена.

При всех методах определения лекарственной устойчивости необходимым звеном в деятельности лаборатории является обеспечение контроля качества исследований.

6.1. Виды лекарственной устойчивости

Чувствительность микобактерий к противотуберкулезным препаратам определяется неспособностью штамма расти на среде, содержащий препарат, при стандартных условиях постановки опыта. Чувствительными к данному препарату считаются те штаммы микобактерий, на которые этот препарат в критической концентрации оказывает бактерицидное или бактериостатическое действие в соответствии с принятым критерием устойчивости.

Устойчивость (резистентность) определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации.

Наряду с понятиями "чувствительность" и "устойчивость" к противотуберкулезным препаратам в настоящее время используются также термины, определяющие различные аспекты лекарственной устойчивости. Так, в случае наличия лекарственной устойчивости к двум или более лекарственным препаратам данный штамм микобактерий определяется как полирезистентный.

Особое место среди полирезистентных занимают микобактерий, у которых обнаруживается лекарственная устойчивость к двум основным противотуберкулезным препаратам (изониазиду и рифампицину) - штаммы, обладающие лекарственной устойчивостью одновременно к изониазиду и рифампицину, независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, обозначаются как штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (или штаммы с МЛУ).

Этим штаммам уделяется особое внимание, так как лечение пациентов, у которых процесс вызван такими штаммами, представляет большие трудности. Оно является длительным, дорогостоящим и требует использования препаратов резервного ряда, многие из которых дорогостоящие и могут вызывать тяжелые побочные реакции. Кроме того, некоторые штаммы с множественной лекарственной устойчивостью обладают повышенной способностью к распространению (трансмиссивностью) и вызывают тяжелые прогрессирующие формы заболевания, нередко приводящие к неблагоприятным исходам.

Наряду с перечисленными определениями различных видов спектра лекарственной устойчивости микобактерий, в международной практике принято различать первичную и приобретенную лекарственную устойчивость.

Первичная лекарственная устойчивость определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента, никогда не принимавшего противотуберкулезные препараты или получавшего такое лечение менее одного месяца. В данном случае подразумевается, что больной заразился лекарственно-устойчивым штаммом микобактерий. Первичная лекарственная устойчивость характеризует состояние микобактериальной популяции, циркулирующей в данной территории, и ее показатели важны для оценки степени напряженности эпидемической ситуации.

Приобретенная (вторичная) лекарственная устойчивость определяется как устойчивость микобактерий, выявленных у больного туберкулезом, получавшего лечение противотуберкулезными препаратами в течение месяца и более. Вторичная лекарственная устойчивость является косвенным показателем эффективности проводимой химиотерапии.

6.2. Критерии лекарственной устойчивости

Уровень устойчивости данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение микобактерий (по числу колоний на плотных средах).

Лекарственно-устойчивые микроорганизмы способны размножаться при таком содержании препарата в среде, которое оказывает на чувствительные особи бактериостатическое или бактерицидное воздействие.

Критические концентарции. Критерии лекарственной устойчивости.

Для различных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на микобактерии туберкулеза в условиях макроорганизма.

Критерием устойчивости микобактериальной популяции называют показатель роста микобактериального пула, выраженный в абсолютных (число КОЕ) или относительных единицах (пропорция КОЕ), на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат в критической концентрации, превышение которого считается наличием признака устойчивости микобактерий.

Для метода абсолютных концентраций появление более 20 КОЕ микобактерий на питательной среде, содержащей лекарственный препарат в критической концентрации, свидетельствует о том, что данный штамм микобактерий обладает лекарственной устойчивостью. При этом необходимо иметь ввиду, что объем засеваемой суспензии клеток стандартизован и соответствует 1 х 10(7) микробных тел.

Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же препарата - различна. Значения критических концентраций существенно отличаются также при использовании разных методов определения лекарственной чувствительности.

Таблица 8

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов для определения лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена

Название препарата	Концентрация в мкг/мл
Препараты основного ряда
Стрептомицин	10
Изониазид	1
Рифампицин	40
Этамбутол	2
Препараты резервного ряда*
Канамицин	30
Протионамид (этионамид)	30
Циклосерин	30
Капреомицин	30
Офлоксацин	2
ПАСК	1
Пиразинамид	200

------------------------------

* Критические концентрации препаратов II ряда носят ориентировочный характер и будут окончательно установлены после дополнительных исследований.

6.3. Метод абсолютных концентраций

В России для определения лекарственной устойчивости микобактерий традиционно используется метод абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена.

В большинстве случаев этот метод применяется для непрямого определения лекарственной устойчивости. Непрямым методом называется метод определения лекарственной устойчивости после выделения культуры микобактерий. Он позволяет исследовать любое количество микобактерий в диагностическом материале, поскольку для определения лекарственной устойчивости используются штаммы микобактерий, предварительно выделенные на питательных средах. Так как сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1-1,5 месяцев, результаты определения лекарственной устойчивости указанным методом обычно получают не ранее, чем через 2-2,5 месяца после посева материала.

При определении лекарственной устойчивости микобактерий на плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 1 х 10(7) микробных тел. Культура расценивается как устойчивая к данной концентрации препарата только при наличии на пробирке с этой концентрацией 20 колоний и более при обильном росте в контрольной пробирке, не содержащей лекарственного препарата.

В отечественной фтизиатрической практике при определении лекарственной устойчивости не ограничиваются определением только критических концентраций. Это связано с тем, что расширенное определение уровня лекарственной устойчивости возбудителя позволяет клиницисту варьировать дозировки препаратов и лекарственные режимы, добиваясь более эффективного воздействия препаратов за счет допустимого повышения дозы и использования синергидных и аддитивных свойств различных комбинаций лекарственных препаратов.

Таблица 9

Концентрации препаратов, используемые при определении лекарственной устойчивости микобактерий методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена

Препарат	Концентрации в мкг/мл
Препараты I ряда
Стрептомицин	10	25
Изониазид	1	10
Рифампицнн	40	80
Этамбутол	2	5
Препараты II ряда
Канамицин	30	50
Протионамид (этионамид)	30	50
Циклосерин	30	50
Капреомицин	30	50
Офлоксацин	2	10
ПАСК	1	5

6.3.1. Разведение противотуберкулезных препаратов и приготовление питательных сред

В питательную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмала (крахмал адсорбирует лекарственные препараты), непосредственно перед свертыванием добавляют рабочие разведения различных противотуберкулезных препаратов.

Для приготовления питательных сред с целью определения лекарственной устойчивости микобактерий должны использоваться химически чистые субстанции противотуберкулезных препаратов

Для приготовления из химически чистой порошковидной формы препарата рабочих растворов, содержащих необходимые для исследования концентрации активной субстанции, расчеты производят с учетом процента активности препарата.

Активность препарата может варьировать от одной его серии к другой серии. Сведения об активности приводятся на этикетках или упаковках лекарственных препаратов и могут быть получены от компании-изготовителя.

6.3.2. Примеры приготовления питательных сред с препаратами

Для определения лекарственной чувствительности к лекарственным прпаратам в лаборатории должны иметься поверенные весы, позволяющие производить взвешивание с точностью до 0,2 мг, что обеспечит точность навески препаратов с погрешностью не более +- 1,5%.

Стрептомицин

Для определения лекарственной чувствительности к стрептомицину используют стрептомицина сульфат.

По данным производителя активность стрептомицина сульфата составляет 750 мг в 1 г чистой субстанции.

Чтобы получить исходный рабочий раствор (А), содержащий в 1 мл раствора 1 мг активной субстанции, следует:

- (А) приготовить навеску 20 мг стрептомицина сульфата с точностью до 0,2 мг, что будет соответствовать 15 мг активного начала, и растворить в 15 мл стерильной дистиллированной воды - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл;

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1-10 мкг/мл, N 2-25 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (А) = 10 мкг/мл;

- в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) = 25 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды.

Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8-10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Изониазид

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции содержится 990 мг активного начала = 99%.

Приготовить навеску 20 мг изониазида.

- (А) в 20 мл стерильной дистиллированной воды растворить 20 мг изониазида - 1 мг/ мл = 1000 мкг/мл;

- (Б) к 9 мл стерильной дистиллированной воды добавить 1 мл раствора (А) - 100 мкг/мл.

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1-1 мкг/мл, N 2-10 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) = 1 мкг/мл;

- в N 2 - 198 мл среды + 2 мл раствора (А) =10 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора Б или А, а затем расчетное количество питательной среды.

Перемешивание, разливание и коагулирование производят как и в предыдущем случае.

Рифампицин

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 970 мг активного начала = 97%.

Взвесить 30 мг порошковидной формы чистой субстанции рифампицина.

Рифампицин нерастворим в дистиллированной в воде, поэтому можно предложить нижеприведенную последовательность приготовления растворов:

Приготовление питательной среды:

На 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40):

Приготовить навеску 30 мг и перенести ее в стерильную пробирку N 1.

(1) 30 мг RIF + 2,0 мл этанола - 14550 мкг/мл;

Подогреть до Т° 35-40°С на водяной бане. Затем, используя стерильные пробирки:

(А) 2,0 мл раствора (1) + 5,2 Н2О - 4000 мкг/мл;

(Б) 2,5 мл раствора (А) + 2,5 мл H2O - 2000 мкг/мл;

Маркируют стерильные колбы N 1 "40 мкг/мл", N 2 "80 мкг/мл":

- в N 1 4 мл (Б) + 196 мл среды - 40 мкг/мл

- в N 2 4 мл (А) + 196 мл среды - 80 мкг/мл

Для ускорения полного растворения препарата допустимо легкое подогревание на водяной бане до 35-40°С).

Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество растворов А или Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды.

Содержимое колб N 1 и N 2 тщательно перемешать круговыми движениями. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8-10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Этамбутол

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 740 мг активного начала.

Для определения лекарственной устойчивости используется этамбутол дигидрохлорид.

(А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить ее в 14,8 мл стерильной дистиллированной воды - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл;

(Б) к 8 мл стерильной дистиллированной воды добавить 2 мл раствора (А) - 200 мкг/мл;

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "2 мкг/мл", N 2 "5 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) = 2 мкг/мл;

- в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (Б) = 5 мкг/мл.

Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды.

Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Канамицин

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции канамицина моносульфата колеблется от 750 до 823 мг активного начала.

Для расчета возьмем величину активности, равную - 750 мкг в 1 мг.

Чтобы получить исходный рабочий раствор (А), содержащий в 1 мл раствора 2000 мкг активной субстанции, следует:

(А) приготовить навеску 30 мг порошковидной формы канамицина моносульфата = 22,5 мг активного начала и растворить в 11,3 мл стерильной дистиллированной воды - 2 мг/мл = 1000 кг/мл;

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1-30 мкг/мл, N 2-50 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 197 мл среды + 3 мл раствора (А) = 30 мкг/мл;

- в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) = 50 мкг/мл.

Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора А, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды.

Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8-10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Протионамид (этионамид)

Оба препарата плохо растворяются в воде.

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 990 мг активного начала.

Препарат нерастворим в дистиллированной воде.

(А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества, и растворить в 3 мл ректифицированного этилового спирта 96° или диметил-сульфоксида. Добавить к раствору 6,9 мл стерильной дистиллированной воды - 2000 мкг/мл;

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "30 мкг/мл", N 2 "50 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 197 мл среды + 3 мл раствора (А) - 30 мкг/мл;

- в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) - 50 мкг/мл.

Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора А, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды.

Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Капреомицин

Содержание активного начала в препарате - 840 мг в 1 г.

Растворы капреомицина отличаются нестабильностью, поэтому их готовят непосредственно перед приготовлением сред.

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40) можно воспользоваться следующей схемой:

Приготовить навеску 20 мг вещества

(А) 20 мг кампреомицин + 8,4 мл Н2О - 2000 мкг/мл;

Колбы N 1 "30 мкг/мл", N 2 "50 мкг/мл":

- в N 1 3 мл (А) + 197 мл среды - 30 мкг/мл

- в N 2 5 мл (А) + 195 мл среды - 50 мкг/мл

Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды.

Перемешивание, разливание и коагулирование производят как и в предыдущем случае.

Циклосерин (D-cycloserin)

В 1 г препарата 980 мг активного начала.

Растворы циклосерина отличаются нестабильностью, поэтому их готовят непосредственно перед приготовлением сред.

(А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества, и растворить в 9,9 мл стерильной дистиллированной воды - 2 мг/мл = 2000 мкг/мл;

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1 - 30 мкг/мл, N 2 - 50 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 197 мл среды + 3 мл раствора (А) - 30 мкг/мл;

- в N 2 - 195 мл среды + 5 мл раствора (А) - 50 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды.

Перемешивание, разливание и коагулирование производят как и в предыдущем случае.

ПАСК

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 877,2 мг активного начала.

Для примера расчета возьмем среднюю величину активности, равную - 880 мг в 1 мг

Чтобы получить исходный рабочий раствор (А), содержащий в 1 мл раствора 1,0 мг активной субстанции, следует:

(А) взвесить на электронных или аналитических весах 20 мг порошковидной формы ПАСК = 17,6 мг активного начала и растворить в 17,6 мл стерильной дистиллированной воды - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл;

(Б) к 18 мл стерильной дистиллированной воды добавить 2 мл раствора А - 100 мкг/мл;

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "1 мкг/мл", N 2 "5 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) - 1 мкг/мл;

- в N 2 - 190 мл среды + 10 мл раствора (Б) - 5 мкг/мл.

Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды.

Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить в аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Офлоксацин

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции - 1000 мг активного начала.

Офлоксацин не растворим в дистиллированной воде, для его растворения применяется 0,1 N раствор NaOH. Для этого:

к навеске 0,4 г NaOH добавить 100 мл стерильной дистиллированной воды = 0,1 N NaOH.

(А) приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить ее в 20 мл 0,1 N раствора NaOH - 1 мг/мл = 1000 мкг/мл;

(Б) к 12 мл стерильной дистиллированной воды добавить 3 мл раствора (А) - 200 мкг/мл;

Приготовление питательной среды:

Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40) на каждое разведение препарата необходимо:

В две стерильные промаркированные колбы (N 1 "2 мкг/мл", N 2 "10 мкг/мл") стерильной пипеткой налить последовательно:

- в N 1 - 198 мл среды + 2 мл раствора (Б) = 2 мкг/мл;

- в N 2 - 190 мл среды + 10 мл раствора (Б) = 10 мкг/мл.

Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды.

Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы N 1. Пробирки поместить аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Пиразинамид

Пиразинамид является препаратом, входящим во все схемы лечения, и обладает бактерицидной активностью в отношении внутриклеточно расположенных микобактерий. Особенностью препарата является его высокая противотуберкулезная активность при сниженных значениях кислотности среды (рН = 6,0). В то же время для культивирования микобактерий туберкулеза на плотных яичных средах оптимальным является значение кислотности, близкое к нейтральному.

Эти обстоятельства не позволяют использовать стандартные методики для определения лекарственной устойчивости к пиразинамиду на плотных яичных питательных средах.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

6.3.2. Постановка опытов по определению лекарственной устойчивости

Непосредственно перед постановкой опыта по определению лекарственной устойчивости необходимо убедиться в том, что отобранные для исследования культуры микобактерий не загрязнены посторонней микрофлорой. Для этого необходимо:

- провести визуальную (макроскопическую) оценку каждой отобранной культуры, обращая внимание на массивность и характер роста, однородность колоний, отсутствие загрязнения, цвет питательной среды;

- провести микроскопию окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из отобранной культуры с целью определения чистоты культуры и степени ее кислотоустойчивости.

Проверенные и отобранные для постановки опыта культуры микобактерий расставить в штативе в порядке номеров.

При любом методе определения чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам каждую серию приготовленной питательной среды с препаратами необходимо проверить, засевая на нее заведомо чувствительную культуру микобактерий туберкулеза. Для контроля можно пользоваться чувствительным штаммом Н37Rv или любой другой многократно проверенной культурой микобактерий туберкулеза, чувствительной ко всем испытуемым противотуберкулезным препаратам. Контрольная культура засевается так же, как и испытуемые.

Если среда с препаратами приготовлена правильно, то контрольная культура не должна расти при тех концентрациях препаратов, при которых не растут чувствительные к данному препарату штаммы. Появление роста контрольного штамма в пробирке с препаратом указывает на то, что при приготовлении среды с препаратами допущена ошибка или на то, что неправильно приготовлена бактериальная суспензия.

При подготовке процедуры исследования необходимо предварительно:

- занести номера отобранных культур в рабочий журнал;

- расставить в штативы наборы питательных сред с препаратами для каждой культуры, контрольную пробирку (со средой без препаратов) и пробирку со средой, содержащей салицилат натрия - 1000 мкг/мл;

- на каждой пробирке со средой написать номер культуры, название препарата и его концентрацию.

Пример:

Надпись на пробирке
N культуры по журналу регистрации	203	203	203	203
Препарат	К	NaS	Sm	Sm
Концентрация			10	25
Пояснения	Контроль	Натрия салицилат	Стрептомицин 10 мкг/мл	Стрептомицин 25 мкг/мл

Приготовление бактериальной суспензии

Выросшую на плотной питательной среде культуру (обязательно несколько колоний) снимают платиновой лопаточкой и помещают в стерильную фарфоровую ступку или толстостенную стеклянную пробирку. В случае наличия роста на 2 пробирках с разными питательными средами (Левенштейна-Йенсена и Финна-II) для приготовления суспензии культуру снимают с обеих пробирок.

Тщательно растирают пестиком или стеклянной палочкой, постепенно добавляя по каплям стерильный физиологический раствор. Полученную суспензию отбирают пастеровской пипеткой и переносят в стерильную пробирку, диаметр которой соответствует диаметру пробирки с оптическим стандартом мутности. Для осаждения клеточных конгломератов и стеклянных или фарфоровых частиц густую исходную суспензию клеток отстаивают в течение 15 минут и переносят в новую пробирку. После этого суспензию культуры стандартизуют по оптическому стандарту мутности N 5 (500 млн. микробных тел в 1 мл.).

Затем разводят в 10 раз стерильным физиологическим раствором. Для этого следует заранее приготовить ряд пробирок по числу исследуемых культур микобактерий и подписать на них номера исследуемых культур. В каждую пробирку налить по 9 мл стерильного физиологического раствора. После приготовления суспензий всех взятых в опыт культур микобактерий в каждую из приготовленных пробирок внести стерильной пипеткой по 1 мл суспензии микобактерий, соответствующей стандарту N 5. Получают суспензии с содержанием клеток соответствующему 5-10 микробных тел. Посев на среды с лекарственными препаратами производить из этих суспензий.

Процедура исследования:

- полученную бактериальную суспензию набрать в мерную пипетку объемом 1,0 или 2,0 мл;

- внести по 0,2 мл суспензии в верхнюю 1/3 косяка во все пробирки с питательной средой, приготовленной для определения устойчивости культуры данного номера, тщательно сверяя номер культуры засеваемой суспензии с номерами, написанными на пробирках. Во избежание ошибок все пробирки, подготовленные для засева одной культуры, следует расставлять в одном ряду штатива;

- каждую засеянную суспензией пробирку закрыть ватно-марлевой или дренированной силиконовой пробкой и поставить в вертикальный штатив с тем, чтобы суспензия равномерно распределялась по поверхности косяка среды к дну пробирки;

- использованную для засева пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором;

- по завершении засева всех суспензий засеянные пробирки переместить в горизонтальные штативы-"диваны" и поместить в термостат при температуре 37°С; при этом поверхность косяка питательной среды должна находиться в горизонтальной плоскости, а наклон штатива должен исключить смачивание пробки материалом засева;

- по истечении 2-3 суток инкубации ватно-марлевые пробки заменить резиновыми или недренированными силиконовыми;

- после этого засеянные пробирки перевести в вертикальное положение;

- инкубирование проводить в течение 3-4 недель при обязательном еженедельном просмотре;

Оценка результатов

Результат определения лекарственной устойчивости учитывают на 21 день после посева. При скудном росте в контрольной пробирке все пробирки с препаратами оставляют еще на 1-2 недели в термостате до получения выраженного роста в контроле, после чего выдают окончательный ответ. Культуру считают чувствительной к данной концентрации препарата, если в пробирке со средой, содержащей препарат, выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке. Культура считается устойчивой к той концентрации препарата, которая содержится в данной пробирке, если в пробирке со средой выросло более 20 колоний при обильном росте в контроле.

6.4. Альтернативные методы определения лекарственной устойчивости микобактерий

Существует несколько методов определения лекарственной устойчивости микобактерий. Практически все они основаны на культивировании микобактерий на плотных (яичные или агаровые) или жидких питательных средах и осуществляются как прямой или непрямой метод определения лекарственной устойчивости (см. выше).

При прямом методе на ряд питательных сред, содержащих и не содержащих определенные концентрации лекарственных препаратов, засевается обработанный гомогенизирующими и обеззараживающими средствами обогащенный при центрифугировании осадок диагностического материала.

При непрямом методе на ряд питательных сред, содержащих и не содержащих определенные концентрации лекарственных препаратов, засевается суспензия чистой культуры микобактерий, выращенной на плотной яичной или агаровой среде. Аналогичным образом может исследоваться культура, выращенная на жидкой питательной среде (7Н9 бульон) и соответствующим образом дозированная.

Как указывалось выше, в международной практике используются преимущественно 4 метода:

- метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука 7Н10,

- метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена,

- метод коэффициента резистентности.

- радиометрический метод Bactec r 460.

6.4.1. Прямой метод абсолютных концентраций

Наряду с непрямым определением лекарственной устойчивости микобактерий в ряде случаев при наличии у больного массивного бактериовыделения (значительное или умеренное количество микобактерий - см. Таблицу 3), выявляемого при микроскопическом исследовании мазка нативного материала или осадка, можно использовать метод прямого определения лекарственной устойчивости. В таких случаях производится прямой посев осадка обработанного детергентами диагностического материала на набор питательных сред с противотуберкулезными препаратами Параллельно, чтобы не упустить возможность выделения культуры микобактерий, обязательно производится посев материала на стандартные питательные среды. Метод прямого определения лекарственной устойчивости может (в случае положительного результата) значительно ускорить получение ответа о лекарственной устойчивости возбудителя. Однако следует иметь в виду, что при его выполнении (в отличие от непрямого метода) производится недозированный засев микобактерий, что значительно затрудняет интерпретацию результатов.

6.4.2. Метод пропорций

Метод основан на сравнении числа микобактерий выделенной культуры, выросших в отсутствии препарата и в его присутствии в критических концентрациях. Для этого приготовленную, как описано выше, суспензию микобактерий, содержащую 1 мг/мл влажного веса микобактерий, разводят до концентрации 10(-4) и 10(-6). Оба разведения суспензии засевают на питательную среду без препарата и на набор сред с разными препаратами. Если на среде с препаратом вырастают колонии, составляющие более 1% от числа выросших на среде без препарата, культура считается устойчивой к данному препарату. Если количество КОЕ, устойчивых к данному препарату, менее 1%, культура считается чувствительной.

6.4.3. Метод коэффициента резистентности

Этот метод основан на определении соотношения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), определяемой для данного штамма конкретного больного к МИК лекарственно-чувствительного стандартного штамма H37Rv, испытываемых в одном и том же эксперименте. В данном случае штамм H37Rv используется не для контроля опыта, а для определения возможных вариаций при постановке теста. С этой точки зрения данный метод является наиболее точным из трех выше перечисленных, однако в силу необходимости использовать большое количество пробирок с питательной средой, он является и наиболее дорогим. Последнее обстоятельство резко ограничивает его применение.

Кроме описанных выше классических методов культивирования микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах, в настоящее время нашли свое применение следующие системы культуральной диагностики микобактерий и определения лекарственной устойчивости.

- полуавтоматизированная радиометрическая система для выявления микобактерий в диагностическом материале и определения лекарственной устойчивости к основным противотуберкулезным препаратам. Для роста микобактерий в системе используются флаконы с жидкой питательной средой, которая представляет собой обогащенную бульонную основу, содержащую С(14) - меченый субстрат. По мере роста микобактерий утилизируют меченый субстрат и выделяют радиоактивный углекислый газ С(14)О2 в пространство над средой во флаконе. В процессе тестирования газ автоматически забирается из флакона, уровень радиоактивности измеряется и регистрируется в виде индекса роста по шкале от 0 до 999. Результат посева считается положительным, если индекс роста превышает заданный порог. Ежедневное изменение индекса роста пропорционально степени роста микобактерий туберкулеза в среде. Наличие роста микобактерий может быть зафиксировано, начиная с 4-5 суток от момента посева, учет результатов производят в течение 6 недель.

Для выделения микобактерий и определения лекарственной устойчивости может быть использована система с индикацией роста по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. Пробирки с индикатором роста содержат модифицированный бульон. В пробирки с питательной средой вносят обогатитель и смесь антибиотиков, подавляющую рост посторонней микрофлоры. Встроенный в силикон дна пробирок флюоресцентный компонент чувствителен к присутствию кислорода, растворенного в бульоне. Высокие начальные концентрации растворенного кислорода гасят эмиссию этого вещества, и регистрируется очень низкий уровень флюоресценции. Позднее, активно размножающиеся микобактерии поглощают кислород, что позволяет наблюдать более интенсивную флюоресценцию при использовании ультрафиолетового трансиллюминатора. Рост также может быть зафиксирован по наличию негомогенной замутненности - мелких зерен или хлопьев в культуральной среде. Учет результатов производится в течение 8-ми недель от момента посева. Для определения лекарственной устойчивости требуется от 3-х до 14-ти дней. Во всех случаях исследования лекарственной резистентности положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться при контрольном микроскопическом исследовании на наличие кислотоустойчивых бактерий и отсутствие роста загрязняющей микрофлоры.

Метод, основанный на технологии колориметрического детектирования продукции СО2 как продукта метаболизма субстратов среды развивающимися в ней микроорганизмами. Он обеспечивает уровень чувствительности, ранее достижимый только с помощью радиометрических методик, при высоком уровне безопасности, сокращении времени анализа и трудозатрат.

Система включает флаконы с питательной средой и реагенты, детекторно-инкубационные модули и компьютерную систему учета. В системе используется питательная среда с добавками факторов роста. Система совмещает 3 функции: выделение микроорганизмов из крови; выделение микобактерий из различного диагностического материала; проверка стерильности.

Последняя разработка, используемая для определения лекарственной чувствительности микобактерий к критическим концентрациям 5 противотуберкулезных препаратов (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид), основана на сочетании агарового метода пропорций с радиометрическими методами, использующими жидкие питательные среды.

------------------------------

* Дезинфицирующие средства, используемые в лабораториях в противотуберкулезных целях, содержат фенолы, гипохлориты, спирт, формальдегиды, йодофоры и глутаральдегиды. Тип дезинфицирующего вещества зависит от материала, подлежащего дезинфекции. Не следует пользоваться ароматизированными "антисептиками". Неверно распространенное мнение о том, что дезинфицирующие средства, эффективные против различных видов микроорганизмов, столь же эффективны и против микобактерий. Целый ряд распространенных дезинфектантов обладают незначительной или не обладают вовсе микобактерицидной активностью, а средства на основе четвертичного аммония неэффективны в рекомендуемых концентрациях. Перекиси водорода в низких концентрациях (менее 3% также мало эффективны в отношении микобактерий туберкулеза).

** Ускорение центрифугирования ("относительная сила центрифугирования" (ОСЦ)) измеряется в относительных единицах к ускорению свободного падения "g". Формула расчета ОСЦ:

ОСЦ = 1,12 R_max (об/мин/1000)(2), где R_max - максимальный радиус от центра вращения ротора до дна пробирки в мм.

Например, при R = 180 мм и 1500 об/мин (центрифуга ЦЛ1-3) ОСЦ = 450 g. При увеличении частоты вращения до 3000 об/мин ОСЦ возрастает до 1800 g.

Необходимое число оборотов в мин. можно рассчитать по формуле:

Об.мин(-1) = 1000 кв. корень (ОСЦ/(1,12 R_max))