4. Требования к организации работы с ПБА III - IV групп патогенности методом ПЦР
4.1. Общие требования
4.1.1. Работу с ПБА III - IV групп патогенности методом ПЦР проводят только при наличии в организации лицензии на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний человека, и санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения соответствующих работ в лаборатории, выданных в установленном порядке.
4.1.2. Организацию работ на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, а также обеззараживания проб проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Работу на остальных этапах ПЦР-анализа проводят, как с обеззараженным материалом.
4.1.3. В лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности, допускается проведение исследований методом ПЦР (без предварительного накопления возбудителя) с целью диагностики бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, возбудители которых относятся ко II группе патогенности.
4.2. Требования к помещениям ПЦР-лаборатории
4.2.1. Помещения ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III - IV групп патогенности, должны соответствовать требованиям СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".
4.2.2. Проведение исследований методом ПЦР с ПБА III - IV группы патогенности допускается на базе действующих микробиологических (бактериологических, вирусологических, иммунологических и др.) лабораторий при условии соблюдения требований СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами" и организации в лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа.
4.2.3. ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:
- приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;
- выделения НК;
- приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;
- детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.
4.2.4. В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: комнаты ведения учетных документов или ординаторской (комнаты персонала)*; кабинета заведующего лабораторией*; раздевалки для сотрудников**; комнаты приема пищи**; туалета**; подсобных (складских) помещений**.
4.2.5. Необходимо наличие автоклавной комнаты для обеззараживания исследуемого материала. Она может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.
4.2.6. Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами).
4.2.7. В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием ПБА, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и др.), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (бактериологическими, вирусологическими, иммунологическими и т.д.), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.
4.2.8. Зону выделения нуклеиновых кислот размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей микробиологической лаборатории допускается выделение НК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ и работ по накоплению ПБА. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения нуклеиновых кислот (НК), в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе (или боксе биологической безопасности) для выделения НК не допускается проведение других работ.
4.2.9. В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.
4.2.10. При необходимости этап выделения НК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов (боксов биологической безопасности) - для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения НК.
4.2.11. Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом.
4.2.12. При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.
4.2.13. Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.
4.2.14. Лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением в соответствии с СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Все помещения лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.
4.2.15. При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна соответствовать значениям, приведенным в таблице.
|
Наименование помещения
|
Кратность воздухообмена (м3/ч)
|
|
приток
|
вытяжка
|
|
Зона приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала
|
5
|
6
|
|
Зона выделения нуклеиновых кислот (НК)
|
5
|
6
|
|
Зона приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР
|
5
|
5
|
|
Зона детекции продуктов амплификации
|
5
|
7
|
4.2.16. При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены кондиционеры в соответствии с СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".
4.2.17. Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими.
4.2.18. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов.
4.2.19. Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют бактерицидными лампами в соответствии с "Методическими указаниями по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях" N 11-16/03-06 от 28.02.95. Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории устанавливают из расчета 2,5 Вт/м3.
4.2.20. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых.
4.2.21. ПЦР-лабораторию обеспечивают средствами пожаротушения.
4.3. Требования к лабораторному оборудованию
4.3.1. Комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых наборов реагентов для выделения НК, амплификации и детекции результатов исследований. Помещение для каждого этапа проведения ПЦР обеспечивают своим набором лабораторного оборудования (прилож. 2).
4.3.2. Приборы, оборудование и средства измерения, используемые в работе лаборатории, должны быть технически исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации. Средства измерения регулярно подвергают метрологическому контролю. Используемые приборы должны соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости.
4.3.3. Для проведения исследования используют приборы и расходные материалы (пробирки, наконечники к микродозаторам), исключающие возможность перекрест ной контаминации исходного материала, выделенных НК и продуктов ПЦР. Для этого используют:
- термостаты с твердотельным термоблоком;
- пробирки с плотно закрывающимися крышками;
- одноразовые пробирки и наконечники к микродозаторам;
- наконечники, строго соответствующие автоматическим пипеткам, а пробирки для амплификации - термоциклерам (в соответствии с инструкцией фирмы - производителя прибора), смена наконечников после завершения каждой манипуляции является обязательной;
- специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок, устанавливаемые на рабочих местах.
4.3.4. Микродозаторы, рабочая поверхность и наружная поверхность корпуса приборов должны быть устойчивы к действию моющих и дезинфицирующих средств и ультрафиолетового излучения.
4.3.5. Для каждого этапа проведения ПЦР-исследований необходимо предусмотреть наличие холодильников (прилож. 2):
- в комнате приема материала от 4 до 8°С, минус 20°С (для хранения исследуемых проб);
- в комнате выделения НК от 4 до 8°С и минус 20°С для хранения набора выделения НК; от 4 до 8°С - для хранения препаратов НК; не допускается хранение препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;
- в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8°С и минус 20°С - для хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;
- в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8°С - для хранения наборов электрофоретической детекции и ГиФА.
