Методические рекомендации
по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения
(утв. заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора Г.Г. Онищенко 22 июня 1995 г. N 06-19/52-17)
Дата введения - с момента утверждения
1. Область применения.
Данный документ предназначен для учреждений здравоохранения и санэпиднадзора, использующих метод полимеразной цепной реакции в целях диагностики инфекционных заболеваний.
2. Обоснование необходимости.
Благодаря высокой специфичности и чувствительности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) находит широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Однако ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации.
Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемой в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положительных результатов.
Сотрудник, занимающийся ПЦР-диагностикой, в своей работе сталкивается с двумя видами контаминации:
1). перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов;
2). контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.
Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложно-положительных результатов.
Как правило, определить источник контаминции бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств.
Накопленный к настоящему моменту опыт работы лабораторий, использующих полимеразную цепную реакцию для диагностики инфекций (ПЦР-диагностические лаборатории) позволяет сформулировать основные требования к планировке таких подразделений и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований обеспечивает исключение возможности контаминации и получения ложно-положительных результатов.
3. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностических лабораторий.
1). Лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат:
- пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.
- пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации; в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.
2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.
3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения.
4). В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены настольные боксы с ультрафиолетовыми лампами.
5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.
6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.
7). Обработка рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должна производится# раздельно.
8). Следует однократно использовать перчатки как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР.
9). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.
10). Необходимо использовать наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.
11). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.
12). В пре-ПЦР- и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные сотрудники.
13). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов.
14). Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следут использовать суховоздушные термостаты.
15). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М., 1980.
16). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:
- каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 700 этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы.
- при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя) и затем - 700 этанолом.
- следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы 700 этанолом и с целью борьбы с пылью.
17). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей которые диагносцируются в данной лаборатории.
18). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение.
4. Требования к проведению ПЦР-анализа.
4.1. Обработка
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Введены в действие методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) широко применяется в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода.
Методические рекомендации предназначены для учреждений здравоохранения и санэпиднадзора в целях диагностики инфекционных заболеваний.
Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения (утв. заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора Г.Г. Онищенко 22 июня 1995 г. N 06-19/52-17)
Текст методических рекомендаций официально опубликован не был
Дата введения - с момента утверждения
1. Разработаны
Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора
исполнители: Покровский В.В., Федоров Н.А., Шипулин Г.А., Безруков В.М.
Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Госкомсанэпиднадзора
исполнители: Бектиниров Т.А., Блоха В.В.
Российским научно-исследовательским противочумным институтом Госкомсанэпиднадзора
исполнитель: Куличенко А.Н.
2. Утверждено ГКСЭН 22 июня 1995 г.
Рассмотрены и рекомендованы к утверждению Ученым Советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол N 5 от 28 марта 1995 г.)
3. Введено впервые
Настоящие Методические рекомендации признаны утратившими силу в связи с введением Методических указаний МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности", утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.