Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения (утв. заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора Г.Г. Онищенко 22 июня 1995 г. N 06-19/52-17) (утратили силу)

Методические рекомендации
по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения
(утв. заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора Г.Г. Онищенко 22 июня 1995 г. N 06-19/52-17)

Дата введения - с момента утверждения

1. Область применения.

Данный документ предназначен для учреждений здравоохранения и санэпиднадзора, использующих метод полимеразной цепной реакции в целях диагностики инфекционных заболеваний.

2. Обоснование необходимости.

Благодаря высокой специфичности и чувствительности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) находит широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Однако ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации.

Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемой в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положительных результатов.

Сотрудник, занимающийся ПЦР-диагностикой, в своей работе сталкивается с двумя видами контаминации:

1). перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов;

2). контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложно-положительных результатов.

Как правило, определить источник контаминции бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств.

Накопленный к настоящему моменту опыт работы лабораторий, использующих полимеразную цепную реакцию для диагностики инфекций (ПЦР-диагностические лаборатории) позволяет сформулировать основные требования к планировке таких подразделений и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований обеспечивает исключение возможности контаминации и получения ложно-положительных результатов.

3. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностических лабораторий.

1). Лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат:

- пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

- пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации; в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены настольные боксы с ультрафиолетовыми лампами.

5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

7). Обработка рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должна производится# раздельно.

8). Следует однократно использовать перчатки как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР.

9). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

10). Необходимо использовать наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.

11). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.

12). В пре-ПЦР- и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные сотрудники.

13). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов.

14). Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следут использовать суховоздушные термостаты.

15). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М., 1980.

16). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

- каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 700 этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы.

- при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя) и затем - 700 этанолом.

- следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы 700 этанолом и с целью борьбы с пылью.

17). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей которые диагносцируются в данной лаборатории.

18). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

4. Требования к проведению ПЦР-анализа.

4.1. Обработка клинических образцов.

1). Забор клинических образцов необходимо производить только в одноразовые пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные.

2). Работать только в одноразовых перчатках.

3). Необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

4). Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой.

5). Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываются# в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с 1 н. раствором соляной кислоты.

4.2. Постановка ПЦР.

1). Работать только в одноразовых перчатках.

2). Следует готовить смесь реактивов для ПЦР, рассчитанную на все пробы, включая контрольные, и затем - раскапывать ее по пробиркам.

3). Использовать автоматические пипетки с переменным объемом и одноразовые наконечники.

4). В каждый данный момент работать только с одной пробиркой.

5). Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно применять отрицательные и положительные контроли в соответствии с инструкцией по применению диагностических наборов.

6). Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы должны добавляться в реакционные смеси одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьером в последнюю очередь. Использованные наконечники следует сбрасывать в емкость с 1 н раствором HCl.

4.3. Детекция продуктов амплификации.

1). Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной комнате сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью.

2). Работать следует только в одноразовых перчатках.

3). Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также уборочный инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), должны находиться только в этой комнате и не должны попадать в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате детекции продуктов амплификации необходимо работать в сменной обуви.

5. Использование физических и химических методов борьбы с контаминацией.

1). Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

2). Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1 н HCL, 10% гипохлоритом натрия или 10% хлорной известью).

6. Оценка качества работы ПЦР-диагностической лаборатории.

1). Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории следует периодически применять зашифрованные внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакцией, но и другими методами диагностики данной инфекции.

2). Следует периодически проводить оценку чувствительности диагностических наборов на основе полимеразной цепной реакции.