Глава 2. Методы определения микронутриентов

Глава 2
Методы определения микронутриентов

I. Методы определения витаминов

1. Одновременное определение витаминов А, Е и каротиноидов в БАД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Метод определения витаминов А, Е и каротиноидов, включая (бета-каротин, альфа-каротин, ликопин, криптоксантин, лютеин, зеаксантин, при совместном присутствии в биологически активных добавках (витаминное драже, таблетки, порошки и кристаллические витаминные препараты, их растворы или суспензии в жирах) основан на экстракции микронутриентов органическим растворителем после щелочного омыления субстрата (1) или непосредственного растворения, упаривании полученного экстракта и переводе сухого остатка в другой растворитель, введении экстракта на ВЭЖХ колонку для хроматографического разделения и последующего определения с помощью флуоресцентного и спектрофотометрического детекторов (2). Определение массовой концентрации витаминов и каротиноидов основано на измерении площади (или высоты) пика при соответствующей каждому соединению длине волны детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации жирорастворимых витаминов А, Е и каротиноидов в биологически активных добавках с вероятностью Р = 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +-15% во всем диапазоне измерений.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Спектрофотометр, например, "СФ-46" с диапазоном измерения от 190 нм до 700 нм с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1% по ТУ 3-3.1841-84; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.

Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско 870-UV", Япония) с проточной кюветой объемом 8 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более 2% с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра (от 190 до 600 нм).

Спектрофлуориметрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско" 821-FP) с проточной кварцевой кюветой объемом 16 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения интенсивности флуоресценции не более 2% с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра возбуждения и эмиссии (от 220-650 нм).

Насос для ВЭЖХ (типа "Джаско" 880-PU), позволяющий осуществлять расход элюента 0,5-1,0 см3/мин с возможностью работы при давлении не менее 300 кг/см2, погрешностью поддержания скорости подачи растворителя 0,6 см3/мин не более 2,5%.

Микрошприц (типа "Гамильтон", США) вместимостью 100 мм3 для ввода проб в жидкостный хроматограф.

Регистрирующее устройство: интегратор (типа "Шимадзу C-R6A", Япония) или самописец, позволяющий проводить измерение с погрешностью не более 0,5%.

Дозатор автоматический типа ПЛ-01-200.

Колбы мерные 2-100-2, 2-50-2 по ГОСТ 1770-74 Е.

Цилиндры вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770-74 Е.

Пробирки П-4-10-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427-75.

Вспомогательные устройства и материалы

Встряхиватель типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.

Центрифуга ОПн-8-У4.2 по ТУ 5.375-4261-76.

Баллон с газообразным азотом квалификации "ос.ч" по ГОСТ 9293-74.

Реактивы

Метанол (СН3ОН) для жидкостной хроматографии "ос. ч" по ТУ 6-09-2192-85.

Ацетонитрил (CH3CN) для жидкостной хроматографии "ос. ч" по ТУ 6-09-14-2167-84.

Метилен хлористый (СН2Сl2), "ос. ч" по ТУ 6-09-14-2149-83.

Гексан (С6Н6), "хч" для хроматографии по ТУ 6-00-4521.

Спирт этиловый (С2Н5ОН) ректификованный технический по ГОСТ 18300-87.

Полностью транс-ретинол (С20Н30О) кристаллический, номер по каталогу 124769 фирмы "Мерк" (Германия).

Ретинола ацетат (С22Н32О2) по Госфармакопея, X изд., ст.578.

Ретинола пальмитат (С26Н60O2) по ФС 42-2229-84

DL-aльфа-Токоферол (С29Н50О2), номер по каталогу Т3251 фирмы "Сигма".

aльфа-Токоферола ацетат (С31Н52О2) по ФС 42-2495-87.

Каротиноиды: лютеин (C40H56O2), ликопин (С40Н56), aльфа-каротин (C40H56), бета-каротин (С40Н56), соответствующие номера Х6250, L9879, С0251, С9750 по каталогу фирмы "Сигма" (США), зексантин С40Н56O2, бета-криптоксантин (С40Н56O) фирмы "Рош" (Швейцария).

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч. д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Средства измерения должны быть поверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерения, вспомогательного оборудования и реактивов, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

Условия выполнения измерений

Для предотвращения разрушения витаминов и каротиноидов анализ БАД и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление растворов

1. Приготовление раствора гидроокиси калия с массовой долей 50%.

50 г гидроокиси калия растворяют в 50 см3 дистиллированной воды.

2. Подвижная фаза для хроматографии

В мерную колбу на 500 см3 помещают 250 см3 ацетонитрила, 25 см3 дихлорметана и доводят объем смеси до метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения в темноте при 2-8°C - 1 год.

Количественное определение витаминов А, Е и бета-каротина

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, для чего проводят определение градуировочного коэффициента.

Для определения градуировочного коэффициента готовят несколько (не менее 4) калибровочных растворов витамина А (полностью транс-ретинол кристаллический; ретинола ацетат по Госфармакопея, X изд., ст. 578; ретинола пальмитат по ФС 42-2229-84) с концентрацией от 0,3 до 3 мкг/см3, витамина Е с концентрацией от 2 до 20 мкг/см3 (DL-aльфа-токоферол; aльфа-токоферола ацетат по ФС 42-2495-87), бета-каротина с концентрацией от 0,2 до 1,5 мкг/см3.

Приготовление градуировочных растворов витамина А

Для приготовления градуировочных растворов из ретинола 0,01 г витамина А количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 этанола. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов ретинола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см3 аликвоты раствора витамина А в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см3) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления калибровочных растворов из ацетата ретинола (пальмитата ретинола) 0,01 г витамина А помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, прибавляют 30 см3 этанола, 3 см3 50% раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63-68°C. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 см3 воды в делительную воронку и извлекают 150 см3 гексана (3 раза по 50 см3) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 см3 и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 1, 2, 3, 4, 5 см3 раствора в мерные колбы вместимостью 100 см3, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в этаноле и доводят объемы до метки тем же растворителем.

Приготовление градуировочных растворов витамина Е

Для приготовления градуировочных растворов из aльфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 2 см3 дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения токоферола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см3 аликвоты раствора витамина Е в этаноле (1, 3, 5, 7, 10 см3) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления градуировочных растворов из ацетата aльфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в коническую колбу вместимостью 100 см3, добавляют 0,2 г аскорбиновой кислоты, 30 см3 этанола, 3 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63-68°C. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 см3 воды в делительную воронку и извлекают 150 см3 гексана (3 раза по 50 см3) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 см3 и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 2, 4, 6, 8, 10 см3 раствора в мерные колбы вместимостью 100 см3, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в 1 см3 дихлорметана и доводят объемы до метки этанолом.

Приготовление градуировочных растворов каротиноидов

Для приготовления градуировочных растворов бета-каротина 5 мг кристаллического бета-каротина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют 1 мл дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов, после чего объем в колбе доводят до метки этанолом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см3 аликвоты раствора бета-каротина в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см3) добавляют растворитель до метки.

Градуировочные растворы других каротиноидов (aльфа-каротина, ликопина, бета-криптоксантина, лютеина, зеаксантина) готовят аналогично раствору бета-каротина.

Полученные растворы хранят в холодильнике при 2-8°C не более 6 месяцев.

Массовую концентрацию витаминов и каротиноидов в градуировочных растворах (С, мкг/см3) уточняют спектрофотометрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность (D) слоя градуировочного раствора толщиной 1 см по отношению к растворителю при длине волны, указанной в таблице, и рассчитывают по формуле:

                          D x 10

                     C = ----------,  где

1%

                          E    х l

                           1см

1%

     E    - коэффициент светопоглощения, см3 х мкг(-1) х см(-1);

      1см

     l - толщина слоя раствора, см;

     10  - коэффициент пересчета.

Таблица 11

Условия проведения спектрофотометрических измерений

Витамин (каротиноид)	Растворитель	Дельта макс., HM	Е(1%)_1 см	Литературный источник
Ретинол	этанол	325	1832	/2/
альфа-Токоферол	этанол	292	75,8	/2/
бета-Каротин	этанол	453	2620	/3/
альфа-Каротин	гексан	445	2710	/3/
Ликопин	гексан	474	3470	/3/
бета-Криптоксантин	гексан	451	2460	/3/
Зеаксантин	этанол	452	2480	/3/
Лютеин	этанол	447	2560	/3/

Градуировка прибора

Градуировка хроматографической системы проводится с целью убедиться, что область определяемых концентраций лежит в пределах линейного участка градуировочного графика, построенного по площадям (высотам) пиков. Она проводится в следующих случаях:

- на этапе освоения методики;

- при смене колонки и/или предколонки;

- при замене стандартного образца;

- в других случаях, когда есть основания полагать, что изменилась эффективность хроматографической системы или чувствительность детектора.

Градуировку хроматографа проводят, строя градуировочный график по серии градуировочных растворов. Аналитический сигнал (площадь, мм2 или высота пика, мм) фиксируют на интеграторе или самописце, соблюдая условия и продолжительность хроматографического разделения и детектирования (табл. 12).

Таблица 12

Условия детектирования витаминов А, Е и каротиноидов

Детектор	Условия детектирования
Детектор	Витамины (каротиноиды)	Длина волны детектирования	Продолжительность, мин
Флуориметрический	Витамин А	ламбда_возб = 325 нм ламбда_эмисс = 480 нм	0-6
Флуориметрический	Витамин Е	ламбда_возб = 295 нм ламбда_эмисс = 330 нм	6,1-16
Спектрофотометрический	Каротиноиды	ламбда = 450 нм	0-30

Ориентировочные времена удерживания и последовательность выхода витаминов из хроматографической колонки: ретинол - 4,0-4,5 мин, альфа-токоферол - 10,5-11,0 мин (флуориметрическое детектирование), бета-каротин > альфа-каротин > ликопин > бета-криптоксантин > лютеин > зеаксантин (спектрофотометрическое детектирование).

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см3". Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времен удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций микронутриентов. Коэффициент градуировочного графика (k_гр) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых формуле:

                          k = ------, где

                           i   S

     С  - массовая   концентрация  микронутриентов    в    градуировочном

      i   растворе,  мкг/см3;

     S  - площадь (высота) аналитического сигнала.

Описание хроматографической системы

Подготовку к работе хроматографической системы, состоящей из последовательно соединенных насоса высокого давления, спектрофотометрического и флуориметрического детекторов и интеграторов проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.

Используется система для ВЭЖХ следующей конфигурации:

- аналитическая хроматографическая колонка (типа картридж "Элсикарт" фирмы "Элсико", Россия) из нержавеющей стали, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4 мм, с обращеннофазным сорбентом, например Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим, аналогичным по свойствам, с эффективностью по бета-каротину не ниже 5000 теоретических тарелок;

- предколонка из нержавеющей стали длиной 50 мм, внутренним диаметром 4 мм с сорбентом типа "Нуклеосил" 100 С18, 7 мкм или аналогичным по свойствам;

- петлевой кран-дозатор (инжектор ввода пробы типа "Реодайн 7125", США) с рабочим объемом петли 50 мм3;

- объемная скорость подачи подвижной фазы - 0,6 см3/мин.

Подготовка пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Взвешивают не менее 10 таблеток (драже, порошкообразное содержимое капсул) и определяют вес одной штуки, затем материал тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,05-0,20 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 15 см3 воды и нагревают на водяной бане при температуре от 60°C до 70°C при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 30 см3 этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 3 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре кипения смеси. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в делительную воронку и экстрагируют неомыляемые вещества 150 см3 гексана (3 раза по 50 см3) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 см3 до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу объемом V_1 (200 см3) и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Аликвоту V_2 (2 см3) полученного раствора переносят в мерную пробирку на 10 см3, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в точно измеренном объеме V_3 (1 см3) подвижной фазы.

Измерение концентрации витаминов и каротиноидов в экстракте пробы

Полученный раствор анализируют дважды с помощью хроматографической системы.

Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и спектральные отношения с временами удерживания и спектральными отношениями растворов соответствующих стандартов (табл. 13).

Таблица 13

Идентификация пиков витаминов и каротиноидов

Витамин	Время удерживания, мин	Условия детектирования - 1	Условия детектирования - 2	Соотношения аналитических сигналов (1:2)
Ретинол	4,0-4,5	ламбда_возб = 325 нм ламбда_эмисс. = 480 нм	ламбда_возб = 340 НМ ламбда_эмисс. = 95 НМ	1,2-1,3
альфа-токоферол	10,5-11,0	ламбда_возб = 295 нм ламбда_эмисс. = 330 НМ	ламбда_возб = 305 нм ламбда_эмисс. = 340 НМ	1,9-2,0
бета-каротин	28-30	450 нм	470 нм	1,1-1,2
альфа-каротин	24-26	450 нм	470 нм	1,2-1,3
Ликопин	17-18	450 нм	470 нм	0,7-0,8
бета-криптоксантин	11-12	450 нм	480 нм	1,0-1,1
Лютеин	5,0-5,5	450 нм	480 нм	1,2-1,3
Зеаксантин	5,6-6,5	450 нм	480 нм	1,2-1,3

Концентрацию витаминов и бета-каротина в растворе пробы (С_пр, мкг/см3) определяют по формуле:

                             C   = k   S  , где

                              пр    гр  пр

     S   - площадь (высота) пика витамина или каротиноида в растворе

      пр   пробы;

     k   - коэффициент градуировочного графика

      гр

За окончательный результат определения концентрации микронутриентов в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Представление результатов

Содержание микронутриентов (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки, рассчитывают по формуле:

                          0,001 x C   x V  x V

                                   пр    1    3

                     X = ----------------------- , где

                                 V  х m

     С   - концентрация  витамина  или  каротиноида    в    анализируемом

      пр   растворе  (мкг/ см3);  коэффициент  0,001  учитывает  пересчет

           содержания витаминов и бета-каротина в мг.

Минимально детектируемое количество ретинола и aльфа-токоферола - 0,1 мкг/мл, каротиноидов - 0,05 мкг/мл.

Погрешность измерения вычисляется по формуле:

                                дельта х Х

                      Дельта = ------------ , где

     дельта - характеристика погрешности измерений (п. 2), %.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации витаминов А, Е и бета-каротина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок.

Производят измерение концентрации витаминов и бета-каротина в экстракте пробы в соответствии с п. 5.7 (С_пр, мкг/см3), а затем с введенной в него добавкой (C_д, мкг/см3), который также анализируют (С', мкг/см3). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация микронутриентов в экстракте увеличилась на 50-150%. Для добавки используют градуировочные растворы микронутриентов.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

                   |С'- С   - С | <= 0,01-С  х К , где

                         пр    д           д    д

     К  - норматив оперативного контроля погрешности, составляющий 15%;

д

     С  - расчетное значение величины добавки, мкг/см3.

д

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

2. Определение витамина В-6 (пиридоксина) в БАД

Сущность метода

В биологически активных добавках витамин В-6 содержится в основном в виде пиридоксина гидрохлорида, действующим началом которого выступает пиридоксин (витамин В-6). Пиридоксин определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме со спектрофлуориметрическим детектированием. Массовую концентрацию пиридоксина определяют по площади (высоте) пика при соответствущих пиридоксину длинах волн флуориметрического детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +- 15% во всем диапазоне измерений.

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ с спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220-650 нм) и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали, длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по пиридоксину не ниже 8 000 теоретических тарелок. (США) Р7949.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения пиридоксина под действием света подготовку проб и приготовление стандартных растворов пиридоксина проводят в посуде темного стекла, либо, обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1М.

К дистиллированной воде добавляют 4 см3 концентрированной соляной кислоты (ро = 1,19 г/см3), объем доводят до 500 см3.

Раствор фосфорной кислоты с массовой долей 30%.

41,3 г 85%-ной фосфорной кислоты (ро = 1,698 г/см3) растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 100 см3.

Приготовление 0,03 М калий фосфатный буфер, pH 3,0.

4,08 г дигидроортофосфата калия растворяют в 500 см3 дистиллированной воды, доводят pH потенциометрически с помощью раствора фосфорной кислоты с массовой долей 30% до значения 3,0 и объем доводят до 1000 см3.

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе.

40 г винной кислоты растворяют в 800 см3 дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 см3.

Подвижная фаза для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 500 см3 добавляют 100-150 см3 0,03 М калий фосфатного буфера, 20 см3 ацетонитрила, 326 мг гептилсульфоната натрия и доводят объем до метки фосфатным буфером. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение пиридоксина (витамина В-6)

Количественное определение пиридоксина проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) с концентрациями пиридоксина в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/см3.

Приготовление градуировочных растворов пиридоксина

Приготовление стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида с концентрацией пиридоксина 500 мкг/см3

Точную навеску 61 мг пиридоксина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в 0,1М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 7 000 М(-1) x см(-1) в 0,1М растворе едкого натра при длине волны 308 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес.

Градуировочные растворы пиридоксина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см3 аликвоты 1 см3 приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 см3 и получают раствор с концентрацией 5 мкг/см3. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают аликвоты раствора пиридоксина с концентрацией 5 мкг/см3 (0,2; 0,6; 1,0; 4,0 см3) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1. Аналитический сигнал (площадь в мм2 или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 290 нм, эмиссии 395 нм. Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0-15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/см3". Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций пиридоксина. Коэффициент градуировочного графика (k_гр) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых по формуле:

                             k  = ------, где

                              i     S

     С  - массовая концентрация пиридоксина в градуировочном растворе,

      i   мкг/см3,

     S  - площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2-1,5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 0,1М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3-5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 мин, периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3-5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колб# вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помешают# на УЗ-баню на 5 мин, доводят экстрагирующей смесью объем до 50 см3 и фильтруют через бумажный фильтр.

При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентрации пиридоксина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрацией пиридоксина в растворах для построения градуировочного графика (0,03-0,05 мкг/см3).

Полученные из экстрактов растворы анализируют дважды с помощью хроматографической системы, вводя на колонку с помощью крана-дозатора (петля 0,1 см3).

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя времена удерживания и спекральное отношение с временами удерживния и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 14).

Таблица 14

Идентификация пиков пиридоксина

Витамин

Время удерживания, мин

Условия детектирования - 1

Условия детектирования - 2

Соотношение аналитических сигналов (1:2)

Пиридоксин

15,0-15,6

ламбда_возб = 290 нм

ламбда_эмисс = 395 нм

ламбда_возб = 305 нм ламбда_эмисс = 410 нм

1,11

Концентрацию пиридоксина в растворе пробы (С_пр, мкг/см3) определяют по формуле:

                       C   = k   - S   , где

                        пр    гр    пр

     S   - площадь (высота) пика пиридоксина в растворе пробы;

      пр

     k   - коэффициент градуировочного графика.

      гр

За окончательный результат определения концентрации пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Обработка результатов

Содержание пиридоксина в 1 таблетке (драже) (мг):

                        k   х S   х V x k     х M

                         гр    пр        разв

                    C = -------------------------- , где

                     пр       m х 1000

     S      - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

      пр

     k      - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V      - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k      - конечное разведение гидролизата;

      разв

     m      - навеска таблеток, взятая на анализ;

     М      - масса таблетки;

     1000   - коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание пиридоксина в 1 капсуле (мг):

                        k   х S   х V x k     х M

                         гр    пр        разв

                 C   = --------------------------- , где

                  пр         n х 1000

     S     - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

      пр

     k     - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V     - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k     - конечное разведение гидролизата;

      разв

     n     - количество капсул, взятых на анализ;

     1000  - коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в гидролизат.

Производят измерение концентрации пиридоксина в гидролизате пробы (С_пр, мкг/см3), а затем с введенной в него добавкой (С_д, мкг/см3), который также анализируют (С', мкг/см3). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация пиридоксина в гидролизате увеличилась на 50-150%. Для добавки используют калибровочные растворы пиридоксина.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

                   |С'- С   - С | <= 0,01 x С  x К , где

                         пр    д             д    д

     К  - норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20%);

д

     С  - расчетное значение величины добавки, мкг/см3.

д

Таблица 15

Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения пиридоксина	0,005 мкг в 1 см3 гидролизата
Воспроизводимость, %	2,0
Правильность, %	98,6
Относительная сходимость, %	5,0

3. Одновременное определение витаминов в-1 и в-2 в бад методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Витамин В-1 (тиамин) под действием красной кровяной соли превращается в тиохром, который флуоресцирует в щелочной среде. В данном варианте методики происходит постколоночная дериватизация, то есть после отделения тиамина от пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме, а окисляющий агент смешивается с выходящим из колонки элюатом, и образующийся тиохром детектируется флуориметрическим методом [1] при соответствующих длинах волн. Массовую концентрацию рибофлавина определяют по площади (высоте) пика при соответствущих ему длинах волн, так как это соединение способно флуоресцировать в нативном состоянии в растворе.

Характеристика погрешности измерений

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220-650 нм), двухходовым смесителем, в котором происходит реакция образования тиохрома из витамина В-1; и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали, длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по тиамину и рибофлавину не ниже 8 000 теоретических тарелок.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения рибофлавина и тиамина под действием света подготовку проб и приготовление их стандартных растворов, а также растворов гексацианоферрата (III) калия проводят в посуде темного стекла, либо, обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1М

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе

40 г винной кислоты растворяют в 800 см3 дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1 000 см3.

3,75 М раствор гидроксида натрия: К 75 г гидроксида натрия добавить 500 см3 дистиллированной воды.

0,04 М раствор гексаноцианоферрата(III) калия: 1,0 г гексаноцианоферрата(III) калия растворить в воде в мерной колбе вместимостью 100 см3 и довести дистиллированной водой до метки.

1,6 10(3)М щелочной раствор гексаноцианоферрата(III) калия

2,0 см3 раствора с содержанием гексаноцианоферрата(III) калия 10 г/1000 мл смешать в мерной колбе вместимостью 50 см3 с 3,75 М раствором гидроксида натрия и довести до метки этим же раствором.

Подвижная фаза для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 500 см3 добавляют примерно 50 см3 дистиллирбванной воды, 60 см3 метанола, 100 мг гептилсульфоната натрия, 10 см3 ледяной уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение витаминов В-1 и В-2

Количественное определение витаминов проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) тиамина с концентрациями в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/см3,

Рибофлавина с концентрациями от 0,02 до 0,100 мкг/мл.

Приготовление градуировочных растворов тиамина

Приготовление стандартного раствора тиамина гидрохлорида с концентрацией тиамина 1000 мкг/см3.

Точную навеску 62,5 мг тиамина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 14200 М(-1) x см(-1) в 0,1 М растворе едкого натра при длине волны 247 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы тиамина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см3 аликвоты 1 см3 приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 см3 и получают раствор с концентрацией 10 мкг/см3. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/см3 (0,1; 0;2# 0,5; 1,0; 2,0 см3) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Приготовление градуировочных растворов рибофлавина

Приготовление стандартного раствора рибофлавина с концентрацией тиамина 100 мкг/см3.

Точную навеску 10,0 мг рибофлавина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют примерно 70 см3 воды и нагревают в течение 20 мин до полного растворения, после охлаждения и доводят объем водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 12500 М(-1) x см(-1) в 0,1М фосфатном буфере (рН = 7,0) при длине волны 255 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы рибофлавина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см3 аликвоты 1 см3 приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 50 см3 и получают раствор с концентрацией 2 мкг/см3. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/см3 (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 см3) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленны по п. 5.1-5.2. Аналитический сигнал (площадь в мм2 или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 375 нм, эмиссии 435 нм для тиамина и при длине волны возбуждения 450 нм, эмиссии - 521 нм (для рибофлавина). Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0-15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/см3". Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций витаминов. Коэффициент градуировочного графика (k_гр) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых по формуле:

С

                           k  = -----, где

                            i    S

     С  - массовая концентрация витамина в градуировочном растворе,

      i   мкг/см3,

     S  - площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом. Подготовка проб аналогична таковой при определении пиридоксина, поэтому можно использовать один и тот же гидролизат.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2-1,5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 0,1 М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин. При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3-5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 минут, периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3-5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колб# вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помешают на УЗ-баню на 5 мин, доводят экстрагирующей смесью объем до 50 см3 и фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентрации тиамина и рибофлавина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрациями витаминов в растворах для построения градуировочного графика.

Аликвоту фильтрата 0,1 см3 вводили в аналитическую хроматографическую колонку. Витамин В-1 определяли после окисления его в тиохром путем послеколоночной дериватизации 0,06%-ным раствором калия гексацианоферрата (III) в 3 N гидроокиси калия со скоростью подачи реагента 0,1 см3 в течение 5 мин после ввода пробы. Длина волны возбуждения для тиохрома составляла 375 нм, длина волны флуоресценции - 435 нм. Время удерживания витамина В-1 - 4,0-4,5 мин. После 6-й минуты длины волн автоматически переключались для определения витамина В-2. Длина волны возбуждения для рибофлавина (витамина В-2) составляла 450 нм, длина волны флуоресценции - 521 нм. Время удерживания витамина В-2 составляло 10,0-10,3 мин. Идентификацию пиков проводили, сопоставляя времена удерживания с временами удерживания растворов соответствующих стандартов.

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя времена удерживания и спектральное отношение с временами удерживния и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 16).

Таблица 16

Идентификация пиков тиамина рибофлавина

Витамин

Время удерживания, мин

Условия детектирования - 1

Условия детектирования - 2

Соотношение аналитических сигналов

(1:2)

Рибофлавин

10,0-10,3

ламбда_возб = 450 нм

ламбда_эмисс = 521нм

ламбда_возб = 465 нм

ламбда_эмисс = 535 нм

1,12

Тиамин

4,0-4,5

ламбда_возб = 375 нм

ламбда_эмисс = 435 нм

ламбда_возб = 395 нм

ламбда_эмисс = 450 нм

1,01

Концентрацию витаминов в растворе пробы (С_пр, мкг/см3) определяют по формуле:

                          C   = k   х S  , где

                           пр    гр    пр

     S   - площадь (высота) пика витаминов в растворе пробы;

      пр

     к   - коэффициент градуировочного графика.

      гр

Обработка результатов

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 таблетке (драже) (мг):

                      k   х S   х V x k

                       гр    пр        разв

               C   = -----------------------, где

                пр         m х 1000

     S     - площадь (высота) пика витамина в пробе;

      пр

     k     - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V     - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k     - конечное разведение гидролизата;

      разв

     m     - навеска таблеток, взятая на анализ;

     М     - масса таблетки;

     1000  - коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 капсуле (мг):

                        k   х S   х V x k

                         гр    пр        разв

                 C   = -----------------------, где

                  пр         n х 1000

     S     - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

      пр

     k     - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V     - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k     - конечное разведение гидролизата;

      разв

     n     - количество капсул, взятых на анализ;

     1000  - коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Производят измерение концентрации тиамина или рибофлавина в гидролизате пробы (С_пр, мкг/см3), а затем с введенной в него добавкой (С_д, мкг/см3), который также анализируют (С', мкг/см3). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация данного витамина в гидролизате увеличилась на 50-150%. Для добавки используют калибровочные растворы.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

                    |С'- С   - С | <= 0,01 x С  x К , где

                          пр    д             д    д

     К  - норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20%);

д

     С  - расчетное значение величины добавки, мкг/см3.

д

Таблица 17

Метрологические характеристики метода

Характеристика	Тиамин	Рибофлавин
Предел обнаружения	0,005 мкг в 1 мл гидролизата	0,006 мкг в 1 мл гидролизата
Воспроизводимость, %	3	3
Правильность, %	98,1	98,7

4. Флуориметрический метод определения рибофлавина (витамин В2) титрованием рибофлавинсвязывающим апобелком

Принцип метода основан на способности рибофлавинсвязывающего апобелка при связывании с рибофлавином полностью тушить его флуоресценцию.

Реактивы и их приготовление

0,1 н. соляная кислота (HCl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 см3 концентрированной (ро = 1,19 г/см3) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 см3.

Стандартный раствор рибофлавина (C17H20N4O6) концентрацией 100 мкг/см3.

5 мг рибофлавина растворяют при нагревании на водяной бане при 70°C в 45 см3 0,1 н. соляной кислоты (раствор 1). После охлаждения объем доводят до 50 см3. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции (прилож. 3). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 мес.

Рабочий стандартный раствор (концентрация рибофлавина 2 мкг/см3).

Перед определением к 1 см3 стандартного раствора добавляют дистиллированную воду в мерной колбе до объема 50 см3.

4 М фосфат калия однозамещенный (К2НРО4).

54,4 г К2НРО4 растворяют в дистиллированной воде, объем доводят до 100 см3.

Рибофлавинсвязывающий апобелок (РбСБ) со связывающей способностью 5-15 мкг рибофлавина на 1 мг белка.

Можно использовать коммерческий препарат (Sigma, США, R 8628) или выделить его из белка куриного яйца по методу, изложенному в прилож. 3.

Средства измерений

Спектрофлуориметр F-2000 (Hitachi, Япония) или аналогичный по оптическим характеристикам

Условия измерения

Интенсивность флуоресценции измеряют в кварцевой кювете объемом 3 см3 с длиной оптического пути 1 см при длине волны возбуждающего света ламбда_возб = 465 нм, испускаемого ламбда_фл = 525 нм.

Приготовление кислотного гидролизата

3 таблетки (драже) или содержимое 3 капсул растирают и тщательно перемешивают в ступке. При расчете массы навески исходят из того, чтобы в 1 см3 гидролизата содержалось не более 5 мкг рибофлавина. К навеске (100-500 мг в зависимости от содержания витамина) добавляют 100 см3 0,1 н. HCl и помещают на кипящую водяную баню на 40 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до 100 см3 и при необходимости фильтруют.

В случае необходимости разводят гидролизат до концентрации рибофлавина около 0,5 мкг/см3 или уменьшают количество гидролизата, взятого на анализ, с таким расчетом, чтобы интенсивность флуоресценции опытной пробы (о - к) была сопоставима с интенсивностью флуоресценции добавленного в пробу стандарта (с - о).

Ход определения

К 0,1 см3 кислотного гидролизата добавляют равный объем 4М К2НРО4 и дистиллированную воду до 3 см3, измеряют флуоресценцию (о), добавляют 0,03 см3 стандартного раствора рибофлавина концентрацией 2 мкг/см3. После перемешивания повторяют измерение (с). Затем добавляют по 0,03 см3 раствора РбСБ, перемешивают, измеряют флуоресценцию после каждой добавки белка. Добавление белка продолжают до тех пор, пока флуоресценция после двух добавок перестает снижаться (к). Разница интенсивности флуоресценции (о - к) пропорциональна количеству рибофлавина в гидролизате. Необходимое количество РбСБ подбирают эмпирически.

Обработка результатов

Содержание рибофлавина в 1 таблетке (мг):

                        (о - к) x 0,06 x V x M

                 C   = ------------------------- , где

                  рб    (c - о) x V  x m х 1000

     0,06 - количество рибофлавина, внесенное в кювету, мкг;

     V    - исходный объем гидролизата, см3;

     М    - масса таблетки БАД, г;

     V    - объем гидролизата, внесенного в пробу, см3;

     m    - навеска измельченных таблеток, взятая на анализ, г;

     1000 - перевод мкг в мг.

Таблица 18

Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения	0,03 мкг в 1 мл гидролизата
Воспроизводимость, %	6,4
Правильность, %	97,1
Относительная сходимость, %	18

5. Метод определения аскорбиновой кислоты (витамин С)

Определение витамина С в биологически активных добавках к пище основано на определении непосредственно аскорбиновой кислоты (АК) без учета окисленной формы витамина С - дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК).

Для целей рутинного анализа наиболее легко и доступно определение методом визуального титрования с использованием количественного окисления АК раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Однако этот метод применим только для объектов исследования, дающих светлоокрашенные экстракты. В других случаях используют метод потенциометрического титрования, спектрофотометрические и флуорометрический методы анализа, которые применимы для любых объектов исследования.

Аппаратура, материалы и реактивы

Спектрофотометр с диапазоном измерения от 220 до 1 100 нм или фотоэлектроколориметр с диапазоном измерения от 364 до 2 980 нм с диапазоном измерения коэффициента пропускания от 100 до 1%.

Флуориметр типа "Квант" с набором светофильтров или спектрофлюориметр.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Секундомер 2-го класса или часы 2-го класса.

РН-метр-милливольтметр лабораторный для измерения pH и окислительно-восстановительных потенциалов с диапазонами от минус 1 до плюс 14 мВ и погрешностью не более +-0,05 при измерении pH и диапазонами от минус 100 до плюс 1 400 мВ и погрешностью не более +-5 мВ при измерении окислительно-восстановительных потенциалов. При измерении окислительно-восстановительных потенциалов используют электроды: измерительный - платиновый, вспомогательный - хлорсеребряный.

Термостат с поддержанием заданного режима от 0 до 60°C с погрешностью +-0,8°C.

Термометр жидкостный с диапазоном измерения от 0 до 100°C с ценой деления шкалы 1°C.

Мешалка магнитная с плавным регулированием частоты вращения.

Воронки стеклянные лабораторные типа В по ГОСТ 25336.

Колбы мерные лабораторные стеклянные номинальной вместимостью 50, 100, 500, 1000 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы типа Кн исполнения 2 номинальной вместимостью 50, 100, 250, 750 см3 по ГОСТ 25336.

Микробюретка по ГОСТ 20292 с ценой деления не более 0,01 см3.

Палочки стеклянные.

Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 20292 номинальной вместимостью 1, 2, 5, 10 см3 ценой деления шкалы 0,1 см3.

Стаканы типа В исполнения 1 номинальной вместимостью 50, 100, 400, 1000 см3 по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250 см3 по ГОСТ 1770.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Бумага масштабно-координатная (миллиметровая) по ГОСТ 334.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Кислота азотная по ГОСТ 4461 плотностью 1,41 г/см3, раствор с объемной долей 25%.

Кислота аскорбиновая по ГФ XI изд., растворы массовых концентраций 1,0 и 0,1 г/дм3.

Кислота борная, ч.

Кислота серная о. с. ч. или ч. д. а. (предпочтительней по Савалю).

Кислота соляная плотностью 1,19 г/см3, х. ч., раствор с массовой долей 2%.

Кислота трихлоруксусная, х. ч., раствор с массовой долей 3%.

Кислота фосфорная (мета), ч. по ГОСТ 841, растворы с массовой долей 3 и 6%.

Кислота уксусная ледяная, ч. д. а. или х.ч. по ГОСТ 61, раствор с массовой долей 3%.

Кислота хлорная, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм3. Готовят перед обработкой электродов.

Кислота щавелевая, раствор с массовой долей 2%.

Ксилол.

Натрий 2,6-дихлорфенолиндофенолят, х. ч., Serva

Натрий уксуснокислый, 3-водный, ч. д. а. по ГОСТ 199.

О-Фенилендиамин, раствор 0,2 г/дм3.

Формальдегид, 36-40%-ный раствор.

Уголь активированный.

L-цистеин солянокислый или L-цистеин, 50 мг в 1 см3 2%-ного раствора соляной кислоты.

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) или трилон Б (динатриевая соль этилендиаминa-N,N',N'-тетрауксусной кислоты, 2-водная, ч. д. а.).

Эфир уксусной кислоты бутиловый (бутилацетат), х. ч.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

Хранение растворов по ГОСТ 4212.

Методы отбора проб

Подготовка средней пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Выделение витамина необходимо осуществлять возможно быстрее, без использования повышенной температуры, не на ярком свету и при минимальном контакте образца с кислородом воздуха.

Дражированная форма

Из средней пробы драже отбирают 10-15 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Таблетированная форма

Из средней пробы таблеток отбирают 3-7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Капсулированная форма

Из средней пробы капсул с порошкообразным содержимым отбирают 3-7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки за вычетом массы оболочки, затем содержимое капсул тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Из средней пробы "жировых" капсул отбирают 3-7 шт., взвешивают их, затем осторожно вскрывают, содержимое капсул тщательно перемешивают. Оболочки капсул отмывают органическим растворителем (ацетоном, гексаном и др.), высушивают и взвешивают. Затем высчитывают массу содержимого одной капсулы.

Кристаллические витаминные препараты (субстанции и премиксы)

Пробу витаминных препаратов отбирают в количестве 5-10 г и тщательно перемешивают.

Порошкообразная форма

Среднюю пробу порошкообразных веществ (сухие напитки, сухие молочные смеси и каши для детского питания и т.д.) отбирают в количестве 25-50 г. Перед взятием пробы порошок тщательно перемешивают.

Примечание. При исследовании равномерности перемешивания сыпучих продуктов, расфасованных в порционные упаковки, целесообразно при проведении анализа использовать порционную упаковку исследуемого образца целиком.

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты в количестве 50-100 см3 осторожно, избегая аэрации, перемешивают путем многократного переворачивания склянки, содержащей пробу.

Витаминизированные кондитерские изделия (конфеты, вафли, батончики, бисквиты и др.)

Пробу штучных изделий берут в количестве не менее 100-200 г (в зависимости от содержания витамина), взвешивают, определяют вес единицы изделия, а затем подвергают размельчению и растиранию в ступке.

Подготовка аналитической пробы

Из измельченной и перемешанной пробы берут навеску не менее 0,5-1 г, взвешанную с погрешностью + 0,0001 г. При расчете массы необходимой навески можно пользоваться следующей формулой:

                              10 x V

                                    общ

                         m = --------------, где

                              V   x B

                               пр    заявл

     m      - навеска исследуемого образца, г

     V      - общий объем экстракта, мл

      общ

     V      - объем экстракта, взятого на титрование, мл

      пр

     B      - заявленное содержание АК в исследуемом образце, мг/100 г.

      заявл

Навески жидких проб (витаминизированные соки, напитки и т.п.) отбирают пипеткой. Навески проб густой консистенции (сиропы, концентраты и пр.), плохо стекающие из пипетки, берут весовым путем подобно твердым продуктам. Затем в этих пробах определяют по общим правилам плотность для пересчета содержания витамина на единицу объема.

5.1 Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты

Сущность метода

Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты основано на экстрагировании аскорбиновой кислоты или ее солей раствором кислоты (соляной, щавелевой, трихлоруксусной, метафосфорной или смесью уксусной и метафосфорной) с последующим визуальным титрованием раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски.

Подготовка к выполнению измерения (испытанию)

Выбор экстрагирующего раствора

Таблица 19

Экстрагирующие агенты

Экстрагирующий агент	Область применения
1	2
2% соляная кислота	Дражированные, таблетированные, капсулированные, кристаллические формы БАД, обогащенные продукты питания, без длительного хранения экстрактов. Исключая продукты с высоким содержанием белка
2% щавелевая кислота	То же, но возможно хранение экстрактов в течение 4-5 ч
3% трихлоруксусная кислота	Для всех видов БАД и обогащенных продуктов питания, включая продукты с высоким содержанием белка
Смесь уксусной и метафосфорной кислот	То же
6% метафосфорная кислота	То же, возможно хранение экстракта в течение 4-5 ч

При выборе экстрагирующего агента также следует учитывать влияние мешающих определению компонентов исследуемой матрицы (табл. 20).

Таблица 20

Компоненты, мешающие определению АК

Компоненты, мешающие определению	Устранение влияния мешающих компонентов
Диоксид серы (SO2)	В экстракт добавляют объем ацетона, равный 1/5 части массы навески.
Наличие ионов двухвалентных металлов (Fe(2+), Cu(2+), Sn(2+) и др.)	Экстрагирование проводят смешивая равные объемы 0,18% раствора ЭДТА и 6% раствора метафосфорной кислоты (3% раствора ТХУ).
Высокое содержание жира	Использование в качестве экстрагирующего агента смеси 6% раствора метафосфорной кислоты и ацетона в соотношении 1:3
Жирорастворимые витамины в составе "жировых" капсул	Аналитическую пробу исследуемого БАД перед проведение# экстракции следует предварительно растворить в небольшом объеме органического растворителя (эфир, хлороформ, гексан)
Восстанавливающие сахара (редуктоны)	Обработка экстракта формалином при pH 3,5 приводит к полной дезактивации АК, при pH 0 - редуктонов.
Сульфгидрильные соединения (цистеин, глутатион восстановленный, белки, танин и т.п.)	Обработка экстракта 5% раствором уксуснокислого свинца.
Наличие в исследуемом образце большого количества зерновых	В процессе экстрагирования следует добавить к объекту исследования 2-5 см3 метанола.

Приготовление экстрагирующего раствора

Приготовление водного раствора соляной кислоты массовой концентрации 20 г/дм3 (2%)

47,5 см3 36%-ной соляной кислоты доводят до метки в 1 000 см3 мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3 (3%)

30 г кристаллической трихлоруксусной кислоты доводят до метки в 1 000 см3 мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3

Взвешивают 60,00 г растертой в ступке метафосфорной кислоты на весах 4-го класса точности, растворяют без нагревания в 100-200 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1 000 см3, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Раствор хранят при (6 +- 2)°C не более 7 сут.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3

Необходимый для измерения объем водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3 смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:1. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм3

Взвешивают 1,8 г трилона Б на весах 2 класса точности и растворяют в 100-300 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1 000 см3, доливая дистиллированную воду до метки.

Приготовление смеси водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм3 и раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3 или раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3 (раствор осадителя)

Отмеряют цилиндром 300 см3 водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3 (или водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3) и 300 см3 раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм3 в коническую колбу объемом 750 см3 и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление смеси уксусной и метафосфорной кислот

К раствору 15 г метафосфорной кислоты в 200 см3 дистиллированной воды добавляют 40 см3 ледяной уксусной кислоты и доводят дистиллированной водой до 500 см3. Хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение 7 дней.

Приготовление стандартного раствора АК

Растворяют 0,1000 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты, отвечающей требованиям ГФ XI, в мерной колбе емкостью 100 см3 в выбранном экстрагирующем растворе и доводят тем же раствором до метки, 10 см3 полученного раствора АК помещают в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки раствором, используемым в качестве экстрагирующего. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (раствор красителя) и определение его титра

Взвешивают 0,100 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия на весах 2 класса точности, растворяют, тщательно перемешивая, в 250 см3 свежекипяченой дистиллированной воды температурой (90 +- 5)°C содержащей около 50 мг бикарбоната натрия. После охлаждения раствора до (20 +- 5)°C, доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 500 см3, затем фильтруют через складчатый фильтр в склянку из темного стекла. Раствор хранят при (6 +- 2)°C не более 1 месяца.

Определение титра

К 1 мл стандартного раствора АК добавляют 9 см3 выбранного экстрагирующего раствора и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 15-20 с (V_m). Таким же образом титруют 10 см3 экстрагирующего раствора (V_K). Поправку к титру раствора (Т), в мг АК, эквивалентных 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, вычисляют по формуле:

К

                         Т = ----------, где

                              (V  - V )

                                m    k

     К - количество АК в 1 мл стандартного раствора, мг.

Приготовление раствора ацетатного буфера с pH 4,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 см3 дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 100 см3), потенциометрически доводят pH до 4,0.

Приготовление раствора ацетатного буфера с pH 5,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 см3 дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 50 см3), потенциометрически доводят pH до 5,0.

Приготовление 1,0 М раствора соляной кислоты

17,2 мл 36% соляной кислоты разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе емкостью на 200 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.

Приготовление 1,0 М раствора ацетата натрия

82,0 г безводного ацетата натрия растворяют в мерной колбе емкостью 1 000 см3 дистиллированной водой и доводят до метки.

Приготовление солянокислого буфера с pH 5,2

К 40 см3 1,0 М раствора соляной кислоты приливают 200 см3 1,0 М раствора ацетата натрия и доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе емкостью 1 000 см3.

Проведение испытания

Экстрагирование

Для приготовления экстракта расчитанную массу навески взвешивают с погрешностью +- 0,0001 г. Затем гомогенизируют ее с небольшим количеством выбранного экстрагирующего агента. После чего полученный гомогенат количественно переносят в мерную колбу или мерный цилиндр объемом V_общ, доводят до метки экстрагирующим агентом, тщательно перемешивают, настаивают 5-10 мин и фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Для жидких пищевых добавок необходимое количество материала отмеривают пипеткой и доводят до метки экстрагирующим агентом в соответствующей мерной колбе.

Визуальное титрование

Для определения АК 1-10 мл экстракта с общим содержанием АК около 0,1 мг вносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50 или 100 см3, доводят объем экстрагентом до 10 см3 и титруют раствором 2,6-дихлор-фенолиндофенолята натрия до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 15-20 с. Аналогично титруют равный объем экстрагирующего агента (контроль на реактивы)*.

Обработка результатов измерения

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки вычисляют по формуле:

                              Т x (V  - V ) x V

                                    m    к     общ

                         X = ----------------------, где

                                  V   х m

                                   пр

     Т  - титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, мг/см3;

     V  - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший  на

      m   титрование исследуемого раствора, см3;

     V  - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший  на

      к   контрольное испытание, см3;

     остальные обозначения см. выше.

Для пищевых добавок, содержащих редуцирующие примеси вместо контроля на реактивы проводят контрольное испытание на присутствие этих примесей. Для этого в колбу помещают такой же объем экстракта, как для определения АК, прибавляют равный ему объем ацетатного буферного раствора с pH 4,0, 36-40%-ный раствор формальдегида в объеме, равном половине объема буферного раствора, перемешивают и выдерживают в течение 10 мин, закрыв предварительно колбу пробкой. Затем содержимое титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений и не менее, чем с двумя различными навесками, различающимися не более, чем на 10%. Чувствительность визуального титрования составляет 5 мкг/см3.

5.2 Определение витамина С в образцах, дающих окрашенные экстракты

Флуориметрический метод определения

Этот метод рассмотрен в "Руководстве по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов", 1998 г.

Метод индофенол-ксилольной экстракции

Этот метод рассмотрен в сборнике научных трудов "Теоретические и клинические аспекты науки о питании" т. VIII, 1987, с. 178-180.

Колориметрический анализ АК в водной среде

Приготовление экстракта и реактивов см. в п. 5.2.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "п. 5.1"

Проведение анализа. Готовят растворы в следующей последовательности (табл. 21).

Таблица 21

Последовательность добавления реагентов в колориметрическом методе

N операции	Реагент	N раствора (колбы)
		1	1*	2	3	3*
		контроль	проба сравнения	стандарт	экстракт	проба сравнения экстракта
1	Ацетатный буфер pH 5,0*	2,5 мл	2,5 мл	2,5 мл	2,5 мл	2,5 мл
2	Экстракт	-	-	-	5 мл	5 мл
3	Стандартный раствор АК	-	-	0,5 мл	-	-
4	Экстрагирующий агент (3% HPO3 или 2% HCl)	5 мл	5 мл	4,5 мл	-	-
5	Дистиллированная вода	-	2 мл	-	-	2 мл
6	Фенолят	2 мл	-	2 мл	2 мл	-

При экстракции 2% HCl на анализ берут по 5 см3 ацетатного буфера.

При большой концентрации АК или интенсивной окраске экстракта берут меньше 5 см3 экстракта, добавляя в растворы N 3 и 3* количество экстрагирующего агента равное 5 см3 минус объем пробы. Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах N 1-3 при ламбда = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 100 г исследуемого образца рассчитывают по формуле:

                          K x (D  - D ) x V    х 100

                                1    3     общ

                     X = ----------------------------, где

                          D    x V   x m

                           1-2    пр

     К    - количество АК  в  0,5  см3  стандартного раствора, взятого на

            определение, мг;

     D    - поглощение фенолята  в  контрольном  растворе  (N 1)  против

      1-2   поглощения фенолята в растворе стандарта (N 2);

     D    - поглощение фенолята   в  контрольном  растворе  N 1  (кювета

      1     сравнения - раствор N 1*);

     D    - поглощение фенолята в растворе экстракта N 3 (кювета сравнения

      3   - раствор N 3*);

     остальные обозначения приведены выше.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух определений

5.3. Спектрофотометрическое определение витамина С в напитках

Проведение анализа

После дегазации и, если необходимо, фильтрования исследуемых напитков готовят три раствора, добавляя реагенты в следующей последовательности (табл. 22).

Таблица 22

Последовательность добавления реагентов при спектрофотометрическом определении витамина С

Реагенты	Раствор N, см3
	1	2	3
	контроль на реактивы	стандарт	исследуемый раствор
Солянокислый буфер (рН 5,2)	5,0	4,5	4,5
Напиток	-	-	0,5
Стандартный раствор аскорбиновой кислоты	-	0,5	-
Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия	1,0	1,0	1,0

Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах N 2-3 при ламбда = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 л напитка рассчитывают по формуле:

                 K x  D  -  x V         K x D    x 1000

                       1-3     общ           1-3

            X = ----------------------- = -----------------, где

                    D    x V                  D    x 0,5

                     1-2    пр                 1-2

     К    - количество АК в  0,5 см3  стандартного  раствора,  взятого на

            определение, мг;

     D    - величина     поглощения   исследуемого  раствора  N 3  против

      1-3   поглощения фенолята в контроле на реактивы;

     V    - общий объем исследуемого напитка, обычно его принимают равным

      общ   1000 см3;

     D    - величина      поглощения  стандартного  раствора  N 2  против

      1-2   поглощения фенолята в контроле на рективы;

     V    - объем     исследуемого          напитка,        взятый    для

      пр    спектрофотометрирования, в данном случае - 0,5 см3.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое двух определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 3% от среднего арифметического.

Чувствительность - 3 мкг АК в пробе.

Для одной партии буфера и одного и того же раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия величину (K/D_1-2), характеризующую качество реактива Тильманса, можно определять один раз в течение одной - двух недель, считая ее постоянной.

5.4. Потенциометрическое титрование

Этот метод описан в "Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов", 1998.

Приложение 1

Некоторые физико-химические свойства витаминов

Аскорбиновая кислота

Белые кристаллы. Устойчива в твердом состоянии. Водные растворы имеют pH 3. Водные растворы устойчивы только в отсутствие кислорода, на воздухе устойчивы при pH 5-6, очень неустойчивы при щелочных pH. Окисление катализируют Сu, Fe. Хорошо растворима в воде - 33,3 г в 100 см3 при комнатной температуре.

Тиаминхлорид гидрохлорид

Белые кристаллы. Гигроскопичен. Устойчив в твердом состоянии на воздухе. Водные растворы при pH > 5 не устойчивы к нагреванию, при pH > 7,0 не устойчивы при комнатной температуре. Хорошо растворим в воде - 100 г в 100 см3 при комнатной температуре.

Рибофлавин

Желтые кристаллы. Сухое твердое вещество устойчиво к рассеянному свету. Чрезвычайно фотолабилен в растворах, особенно щелочных. Нейтральные и кислые водные растворы устойчивы в темноте, за 1 мес. разлагается 3% при 27°C и pH 6,0. Быстро разлагается в щелочных растворах. Мало растворим в воде - 0,01 г в 100 см3 при 25°C и 0,23 г в 100 см3 при 100°C. Растворимость в кислых растворах: в 3%-ной соляной кислоте при 15°C - 0,026%.

Пиридоксингидрохлорид

Белые кристаллы. Устойчив в твердом состоянии на свету. Нейтральные и щелочные растворы фотолабильны. Хорошо растворим в воде - 22 г в 100 см3 при комнатной температуре.

Альфа-токоферол

Светло-желтые масла. Хорошо растворим в этаноле. Медленно окисляется на воздухе, быстро - в присутствии щелочи или при нагревании. Устойчив к действию кислот (до 100°C). Постепенно темнеет на свету, чувствителен к УФ-свету.

Альфа-токоферилацетат

Желтые кристаллы. Эфиры (ацетат и др.) гораздо более устойчивы к свету и кислороду.

Ретинол

Желтые кристаллы. Легко окисляется на воздухе. Разрушается под действием УФ-света. Устойчив в щелочной среде, неустойчив - в кислой. Хорошо растворим в этаноле.

Бета-каротин

Темно-фиолетовые кристаллы. Окисляется на воздухе, фотолабилен. Растворим в этаноле.

Приложение 2

Определение концентрации растворов витаминов, используемых в качестве стандартов

Таблица 23

Коэффициенты молярной экстинкции витаминов для уточнения концентрации стандартных растворов

Витамин	Молекулярная масса	Условия измерения	ламбда, нм	E_1 см
Аскорбиновая кислота	176	вода	265	7000
Аскорбиновая кислота	176	кислота	245	7500
Тиамин	265	0,1 М трис-HCl pH 7,5	267	8300
Рибофлавин	376	0,1 М фосфат pH 7,0	266	32500
Пиридоксин	169	0,05 М фосфат pH 6,8	324	7100
Пиридоксин	169	0,1 M NaOH	308	7000

Таблица 24

Коэффициенты экстинкции 1%-ных растворов витаминов для уточнения концентрации стандартных растворов

Витамин	Условия измерения	ламбда, нм	Е(1%)_1 см
Ретинол	Этанол	325	1832
альфа-Токоферол	Этанол	292	75,8
бета-Каротин	Этанол	453	2650

Таблица 25

Уточнение концентрации стандартных растворов витаминов

Витамин	Молекулярная масса	Объем стандартного раствора, см3	Растворитель	Объем растворителя, см3
Аскорбиновая кислота	176	1,0 (рабочий)	2%-ная HCl	2,0
Тиамин гидрохлорид	337	0,3	0,1 М трис-HCl рН 7,5	2,7
Рибофлавин	376	0,1	0,1 М фосфат pH 7,0	2,9
Пиридоксингидрохлорид	206	0,1	0,05 М фосфат pH 6,8	2,9

Концентрацию стандартного раствора витамина (мкг/см3) рассчитывают по формуле:

                                  D x M x V

                             X = ----------- , где

                                   E x V

     D  - поглощение раствора;

     Е  - коэффициент молярной экстинкции;

     М  - молекулярная масса;

     V  - объем раствора в кювете (3 см3), см3;

     V  - объем стандартного раствора, взятого на анализ, см3.

Приложение 3

Выделение рибофлавинсвязывающего апобелка из белка куриных яиц

Получение препарата рибофлавинсвязывающего апобелка (РбСБ) проводят при комнатной температуре по компилятивной методике Tillotson J.A., Bashor M.M., White Н.В. с небольшими изменениями.

Реактивы и их приготовление

5%-ный водный раствор фенола (С6Н5ОН).

5 г фенола растворяют при постоянном перемешивании в дистиллированной воде, доводят объем до 100 см3. Фенол относится к 2 классу опасности.

0,1 н. соляная кислота (HCl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 см3 концентрированной (ро = 1,19 г/ см3) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 см3.

500 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5).

60,5 г трис(гидроксиметил)аминометана (C4H11NO3) растворяют в 500 см3 дистиллированной воды, доводят pH до 7,5 потенциометрически с помощью 1 н. соляной кислоты (примерно 400 см3). Объем буфера доводят дистиллированной водой до 1000 см3.

50 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5).

Готовят разведением в 10 раз, добавляя к 100 см3 500 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5) дистиллированную воду до 1 000 см3.

0,4 М хлорид натрия (NaCl), приготовленный на 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5).

4,37 г NaCl растворяют в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5), доводят объем до 200 см3.

6 мМ соляная кислота (HCl).

К дистиллированной воде добавляют 0,5 см3 концентрированной (ро = 1,19 г/см3) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 900 см3.

250 мМ Na-ацетатный буфер (рН 3,2).

17 г ацетата натрия (СН3СООКа) растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, доводят потенциометрически pH до 3,2 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/см3), доводят объем дистиллированной водой до объема 500 см3.

25 мМ Na-ацетатный буфер (рН 3,2).

К 100 см3 250 мМ Na-ацетатного буфера (рН 3,2) добавляют дистиллированную воду, доводят объем до 1 000 см3.

25 мМ Na-ацетатный буфер (рН 5,8).

340 мг уксуснокислого натрия (CH3COONa) растворяют в 40 см3 дистиллированной воды, доводят потенциометрически pH до 5,8 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/см3). Доливают дистиллированную воду до объема 100 см3.

Выделение

Белки 2-10 свежих куриных яиц гомогенизируют вручную в гомогенизаторе Поттера (стекло-тефлон) до получения массы однородной вязкости. Добавляют сухой NaCl до концентрации 20% (вес/объем) при постоянном перемешивании механической мешалкой. К полученной суспензии приливают равный объем 5%-ного водного раствора фенола и центрифугируют 10 мин при 1 500 g. С помощью ваты снимают верхнюю пленку. Супернатант желтого цвета диализируют 5 ч против 100 объемов дистиллированной воды (5-8 смен) и в течение ночи против 20 объемов 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), затем центрифугируют.

Надосадочный раствор наносят на колонку (1,2 х 7 см) DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Швеция), предварительно уравновешенную 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5). После нанесения РбСБ виден в виде желтой зоны в верхней части колонки. Колонку промывают буфером нанесения до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не становится ниже 0,010. Флавопротеин элюируют 0,4 М NaCl, приготовленным на 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5). При элюции с колонки собирают визуально видимые ярко окрашенные фракции, содержащие флавопротеин. Фракции флавопротеина в замороженном состоянии при -20°C могут храниться до 6 мес. Полное отделение рибофлавина от флавопротеина можно проводить двумя способами: диализом против 6 мМ НСl до полного обесцвечивания диализата и хроматографией на колонке КМ-целлюлозы. Для этого элюированные с DEAE-Sephadex A-50 фракции флавопротеина диализируют против 20 объемов 25 мМ Na-ацетатного буфера (рН 3,2) с трехкратной заменой диализирующего буфера в течение 16 ч. Затем наносят на колонку (1 х 10 см) КМ-целлюлозы (Reanal, Венгрия), предварительно уравновешенную 25 мМ Na-ацетатным буфером (рН 3,2). После нанесения РбСБ также виден на колонке в виде желтой зоны, так как не весь рибофлавин диссоциирован от РбСБ. Для удаления рибофлавина колонку промывают буфером нанесения до полного исчезновения желтой окраски на колонке и уменьшения экстинкции в элюируемом растворе до величины меньше 0,010 при ламбда = 455 нм. Апопротеин элюируют 25 мМ Na-ацетатным буфером (рН 5,8), измеряя поглощение элюата при 280 нм. Фракции с экстинкцией, превышающей 0,1, собирают. Фракции апопротеина, полученные с помощью диализа или хроматографии диализируют против 100 объемов дистиллированной воды в течение ночи, хранят при - 20°C в течение 12 мес. Из белков двух яиц получают 30-40 мг апобелка. В лиофилизованном состоянии его активность сохраняется в течение нескольких лет. По данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия полученный обоими способами препарат апобелка содержит не менее 80% пептида с кажущейся молекулярной массой около 36 000.

II. Методы определения минеральных веществ

Метод включает подготовку проб и непосредственно проведение количественного определения.

Методы подготовки проб

1.1. Способ сухой минерализации

1.1.1. Способ основан на полном разложении органических веществ путем сжигания пробы в электропечи при контролируемом температурном режиме и предназначен для БАД, кроме содержащих 60% жира и более.

1.1.2. Подготовка к минерализации

Фарфоровые чашки или тигли после обычной мойки дополнительно обрабатывают раствором уксусной кислоты на кипящей водяной бане в течение 1 ч или промывают горячим раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Кварцевые чаши и тигли моют раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной и ополаскивают дистиллированной водой.

В чашу (чашку, тигель) в зависимости от определяемого элемента берут навеску продукта из подготовленной к испытаниям пробы, взвешенную с погрешностью 0,01 г при массе навески до 10 г и с погрешностью 0,1 г при массе навески 10 г и более. Масса навески пробы указана в табл. 1 (более подробно см. ГОСТ 26929-94).

1.1.3. Минерализация проб сырья и пищевых продуктов

1.1.3.1. Навеску средней пробы замачивают в 96% этиловом спирте из расчета 5 см3 спирта на 1 г сухого вещества. Чашки (тигли) с навеской, покрываются часовыми стеклами или чашками Петри, выдерживают при комнатной температуре в течение 12-48 ч.

1.1.3.2. Чашки переносят на электроплитку, осторожно высушивают и, постепенно увеличивая нагрев, выдерживают на плитке до начала обугливания.

1.1.3.3. БАД с высоким содержанием сахаров перед обугливанием обрабатывают 20%-ным раствором серной кислоты из расчета 5 см3 кислоты на 1 г сухого вещества. Далее - по п. 1.1.3.2.

1.1.3.4. Чашки с высушенными пробами помещают в холодную электропечь. Минерализацию проб проводят постепенно, повышая температуру электропечи на 50°C через каждые 30 мин и доводя ее до 450°C - продолжают минерализацию при этих условиях до получения серой золы.

Чашу с золой вынимают из электропечи, охлаждают до комнатной температуры и серую золу смачивают водой и 0,5-1 см3 раствора азотной кислоты (1:1). Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь, постепенно доводя температуру до 300°C, и выдерживают 0,5 ч. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета, без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку золы раствором азотной кислоты или водой, снова доозоляют.

1.1.4. Полученную золу растворяют при нагревании в азотной кислоте (1:1) из расчета 1-5 см3 кислоты на навеску в зависимости от зольности продукта. Раствор выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1%-ной азотной или соляной кислоте до объема 15-20 см3.

1.1.5. При неполном растворении золы полученной по п. 1.1.4 азотнокислый раствор с осадком упаривают досуха и перерастворяют в минимальном объеме (5-10 см3) соляной кислоты (1:1), снова упаривают до влажных солей. Полученные соли растворяют в 1% соляной кислоте до объема 15-20 см3.

1.1.6. Если растворы золы, полученные по п. 1.1.4 или 1.1.5 содержат нерастворимый осадок, объем растворителя можно довести до 25-30 см3, пробу подогреть до растворения. Если и в этом случае полного растворения не наблюдается, раствор отфильтровывают через промытый растворителем фильтр и осадок отбрасывают.

1.2. Способ мокрой минерализации

1.2.1. Способ основан на полном разрушении органических веществ пробы при нагревании с серной и азотной концентрированными кислотами с добавлением перекиси водорода и предназначен для всех видов БАД, кроме содержащих сливочное масло и животные жиры.

1.2.2. Подготовка к минерализации

1.2.2.1. Стеклянную посуду после обычной мойки дополнительно промывают раствором азотной кислоты, ополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой.

1.2.2.2. Навеску жидких и пюреобразных БАД по п. 1.2.2 взвешивают в стакане, переносят в колбу Кьельдаля или плоскодонную колбу, стараясь не попасть на стенки колбы.

1.2.2.3. Навеску БАД по п. 1.2.2 берут на обеззоленный фильтр, заворачивают в него и стеклянной палочкой помещают на дно колбы Кьельдаля или плоскодонной колбы.

1.2.2.4. Навеску сухих БАД (желатиноподобных) помещают в колбу Кьельдаля, добавляют 15 см3 воды, перемешивают. Желатин затем оставляют на 1 ч для набухания.

1.2.3. Минерализация проб сырья и продуктов

1.2.3.1. Кислотная минерализация проб сырья и продуктов, кроме растительного масла, маргарина, пищевых жиров

В колбу с пробой БАД, подготовленной к минерализации по п. 1.2.2, вносят азотную кислоту из расчета 10 см3 на каждые 5 г продукта и выдерживают не менее 15 мин. Затем в колбу вносят 2-3 стеклянных шарика для равномерности кипения, закрывают грушевидной пробкой и начинают нагревать на электроплитке слабо, затем сильнее, упаривая содержимое колбы до объема 3-5 см3.

Колбу охлаждают, вносят 10 см3 азотной кислоты, содержимое упаривают до объема 5 см3, после чего охлаждают. Эту процедуру повторяют 2-4 раза.

В колбу вносят 10 см3 азотной кислоты, 2 см3 серной кислоты, 2 см3 перекиси водорода из расчета на каждые 5 г образца. Минерализацию БАД на молочной основе проводят без добавления серной кислоты. Содержимое колбы упаривают до объема 5 см3, не допуская образования коричневой окраски жидкости. При появлении коричневой окраски нагревание прекращают.

Колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 см3 азотной кислоты и 2 см3 перекиси водорода и снова нагревают до появления белых паров серного ангидрида. Если при этом раствор не обесцветился, эту процедуру повторяют. Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным.

Для удаления остатков кислот в охлажденную колбу добавляют 10 см3 воды и кипятят 10 мин с момента выделения белых паров, затем охлаждают. Добавление воды и нагревание повторяют еще 2 раза.

Если при этом образуется осадок, в колбу вносят 20 см3 дистиллированной воды, 2 см3 серной кислоты, 5 см3 соляной кислоты и кипятят до растворения осадка, постоянно дополняя испаряющуюся воду. Полученный минерализат после охлаждения используют для анализа полностью или количественно переносят водой в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки водой и перемешивают.

1.2.3.2. Кислотная минерализация проб с высоким содержанием жира

Исследуемую пробу в колбе Кьельдаля, подготовленную к минерализации по п. 1.2.2, нагревают на электроплитке 7-8 ч до образования вязкой массы, охлаждают, добавляют 25 см3 азотной кислоты и вновь осторожно нагревают, избегая бурного вспенивания. После прекращения вспенивания колбу с содержимым охлаждают, добавляют еще 25 см3 азотной кислоты и 12 см3 хлорной кислоты и нагревают до получения бесцветной жидкости. Если во время сжигания жидкость темнеет, то к ней добавляют периодически по 5 см3 азотной кислоты и продолжают нагревание до завершения минерализации. Минерализации.# Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным. Затем продолжают процедуру по п. 1.2.3.1.

1.3. Способ кислотной экстракции (неполной минерализации)

1.3.1. Способ основан на экстракции элементов из пробы продукта кипячением с разбавленной соляной или азотной кислотой и предназначен для жиросодержащих БАД

1.3.2. Экстракция и подготовка экстрактов к анализу

1.3.2.1. Экстракция проб БАД

В термостойкую колбу с навеской образца, отобранного по п. 1.2.2, вносят цилиндром 40 см3 раствора соляной кислоты (1:1) и такой же объем раствора азотной кислоты (1:2).

В колбу добавляют несколько стеклянных шариков, вставляют в нее холодильник, помещают на электроплитку, покрытую асбестом, и кипятят в течение 1,5 ч с момента закипания. Затем содержимое колбы медленно охлаждают до комнатной температуры, не вынимая холодильника.

В колбу с экстракционной смесью жиросодержащих БАД с кислотой помещают в холодную водяную баню для затвердевания жира. Затвердевший жир прокалывают стеклянной палочкой, фильтруют через фильтр, смоченный кислотой, затем промывают фильтр 5-7 см3 дистиллированной водой. Оставшийся в колбе жир расплавляют на водяной бане, добавляют 10 см3 раствора кислоты, встряхивают, охлаждают, после охлаждения жир прокалывают и промывную жидкость сливают в тот же сосуд через тот же фильтр, затем фильтр промывают 5-7 см3 дистиллированной воды.

Экстракционную смесь масла с кислотой переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают 10 см3 кислоты, которую сливают в ту же воронку. После разделения слоев нижний водный слой сливают через фильтр, смоченный кислотой, в кварцевую или фарфоровую чашку, затем фильтр промывают 5-7 см3 дистиллированной воды.

Чашу с экстракционной смесью осторожно выпаривают и обугливают на электроплитке. Затем помещают в электропечь и озоляют до исчезновения обугленных частиц.

1. Атомно-абсорбционный метод определения содержания натрия, калия, кальция, магния, железа, марганца, меди, цинка, свинца, кадмия, кобальта, никеля, хрома

Сущность метода

Метод основан на распылении раствора минерализата испытуемой пробы в воздушно-ацетиленовом пламени. Металлы, находящиеся в растворе минерализата, попадая в пламя, переходят в атомное состояние. Величина адсорбции света с длиной волны соответствующей резонансной линии, пропорциональна значению концентрации металла в испытуемой пробе.

Контрольный (холостой) опыт

При проведении деструкции проб любым способом обязательно проведение контрольного (холостого) опыта для учета уровня загрязнений, которые могут возникнуть на любой стадии подготовки проб. В каждой подготавливаемой серии проб контрольный тигель (чашка, стакан и пр.) обязательно проводят через все стадии подготовки вместе с тиглями, содержащими навески БАД, при одинаковом времени нахождения на электроплитке, в муфеле, при использовании тех же реактивов в том же количестве, той же мерной посуды и т. д. Полученный в холостом опыте раствор анализируют в той же серии измерений, что и растворы проб. Если пробы БАД обычно анализируют в двух повторностях, то контрольный опыт также целесообразно проводить в двух повторностях.

Подготовка к испытанию

Приготовление растворов

Определение содержания элементов в испытуемых растворах проводят методом градуировочного графика, который строится по значениям сигналов абсорбции растворов сравнения.

Головные стандартные растворы (эталоны) готовят из чистых металлов (более 99,9%) или чистых (х. ч., ос. ч.) устойчивых соединений элементов при использовании растворителей, обеспечивающих устойчивость растворов при хранении (допускается использование коммерческих растворов). Концентрация металла в головном растворе должна быть равна 1 г/дм3 (1 000 мкг/см3) (табл. 26). Срок их хранения обычно не превышает 2-3 лет, если растворы хранятся в герметичной посуде из стекла твердых сортов, полиэтилена высокой плотности, полистирола, кварца, т.е. материалов, наименее склонных к ионному обмену и абсорбции. Разбавленные растворы с концентрацией порядка 100 мкг/см3 обычно могут храниться до 1 мес, с концентрацией 10 мкг/см3 - 2-3 дня. Необходимо избегать применения резиновых пробок, которые могут быть источником загрязнения для ряда микроэлементов, а также избегать хранения растворов в местах, куда попадает прямой солнечный свет. Для приготовления головных стандартных растворов не рекомендуется использовать кристаллогидраты, которые могут не отвечать предполагаемому составу, и нестойкие реактивы, например перманганат калия.

Стандартные растворы сравнения (рабочие эталоны) готовят путем разбавления головных стандартных растворов до концентрации, которая должна соответствовать рабочему диапазону концентраций и быть близка к концентрации элемента в анализируемом растворе. Разбавление производят тем же бланковым раствором, который применяется для приготовления анализируемых растворов проб.

Обычно для построения градуировочного графика в области рабочих концентраций достаточно 3-5 растворов сравнения, при работе в линейной области - 2 раствора. При большой и особенно знакопеременной кривизне градуировочного графика необходимо увеличивать число стандартных растворов сравнения или ограничивать область рабочих концентраций более узким диапазоном (табл. 27).

Приготовление растворов и проб к испытанию

Раствор золы может анализироваться непосредственно или после дополнительной подготовки, которая необходима в следующих случаях.

а) Концентрация элемента в растворе значительно превышает верхний предел интервала рабочих концентраций. Производят разбавление исходного раствора бланковым раствором до необходимого уровня концентрации.

б) Концентрация элемента в исходном растворе ниже предела его обнаружения. Если необходима количественная, а не односторонняя ("не более"...) оценка, производят концентрирование элемента методом экстракции. Экстракция применяют также при определении микроэлементов на приборах, которые не имеют автоматической коррекции неселективного поглощения.

Для проведения экстракции рассматриваемых элементов могут быть применены разнообразные экстракционные системы, в частности, система диэтилдитиокарбамат натрия (или аммония) - n-бутилацетат (или метилизобутилкетон). Эти системы при регулировании pH позволяют провести экстракцию железа, цинка, меди, марганца, кадмия, свинца, кобальта, никеля и хрома.

Подготовка спектрофотометра к работе и условия измерения

Юстировку прибора проводят в соответствии с технической инструкцией завода (фирмы)-изготовителя. Рекомендуемые условия измерений, а также значения предела определения по данным авторов методики приведены в табл. 27.

Альтернативные длины волн резонансных линий натрия и калия, указанные в табл. 27, могут использоваться для определения в разных областях концентраций, если позволяют технические характеристики лампы и прибора. Для свинца и хрома измерение на указанных альтернативных линиях может отличаться не только чувствительностью, но и отношением сигнал/шум, скоростью дрейфа сигнала. Поэтому выбор резонансной линии в этих случаях проводится для каждого прибора после предварительных сравнительных испытаний.

Указанные в табл. 27 номинальные значения ширины щели монохроматора отвечают отсутствию перекрывания резонансной полосы поглощения с соседними линиями спектра. Тем не менее настройку монохроматора по максимуму излучения источника рекомендуется проводить при минимально возможной щели. Измерения абсорбции таких элементов, как железо, свинец, кадмий, кобальт, никель и хром, при концентрациях, близких к пределу обнаружения, могут проводиться при максимальной щели монохроматора, если для данного прибора это дает улучшение отношения сигнал/шум.

Таблица 26

Рекомендуемые способы приготовления головных стандартных растворов, концентрация металла - 1000 мкг/см3

Элемент	Исходный реактив, навеска, г	Схема приготовления головного стандартного раствора объемом 1000 см3	Концентрация кислоты в конечном растворе
1	2	3	4
Натрий	NaCl, прокаленный при 500°C, 2,542 г	+ Н2О + HCl	0,02 н. HCl
Калий	КС1, прокаленный при 500°C, 1,907 г	+ Н2О + HCl	0,02 н. HCl
Кальций	СаСОз, высушенный при 110°C, 2,497 г	+ HCl (2 н), нагрев + Н2О
Магний	Металл, 1,000 г	+ 100 см3 разбавленной (1:100) HCl, осторожно, по каплям (!) + Н2О
Магний	MgO, прокаленный при 500°C, 1,658 г	+ 25 см3 HCl (25%) + Н2О
Железо	Металл, 1,000 г	+ 20 см3 HCl (5 н) + 5 см3 концентрированной HNO3 (окисление до Fe(3+)) + Н2О	0,1 н. HCl
Цинк	Металл, 1,000 г	+ HCl (1:1) + Н2О	1 н. HCl
Цинк	ZnO, 1,245 г	+ HNO3 (40%) + Н2О	0,1 н. HNO3
Медь	Металл, 1,000 г	+ 50 см3 НNO3 (5 н), упарить досуха на водяной бане + 5 см3 HCl, упарить досуха + разбавленную HCl + Н2О	0,1 н. HCl
Марганец	Металл, 1,000 г	+ 10 см3 HNO3 упаривают досуха на водяной бане + 5 см3 концентрированной HCl, упарить досуха + несколько капель концентрированной HCl + Н2О	0,02 н. HCl
Свинец	Металл, 1,000 г	+ минимальный объем HNO3 (6 н.) + Н2О + HCl	1 н. HCl
Свинец	Pb(NO3)2, высушенный при 110°C, 1,599 г	+ разбавленную HNO3 (1:100)	1% HNO3
Кадмий	Металл, 1,000 г	+ разбавленная HNO3, упарить досуха и выдержать при 80-90°C на водяной бане, добавить 5 см3 HCl (1 н.), упарить досуха + разбавленную HCl + Н2О	1 н. HCl
Кадмий	CdO, 1,142 г	+ 20 см3 HCl (5 н.) +Н2О + HCl	1 н. HCl
Кобальт	Металл, 1,000 г	+ минимальный объем HNO3, упарить досуха, растворить в разбавленной HCl + Н2О	1 н. HCl
Никель	Металл, 1,000 г	+ минимальный объем HNO3, упарить досуха на водяной бане + 5 см3 HCl, упарить досуха + Н2О + HCl	0,1 н. HCl
Хром	Металл, 1,000 г, или	+ HCl + Н2О	1 н. HCl
Хром	К2Cr2О7, высушенный при 150°C, 2,830 г	+ разбавленная HCl + Н2О	0,02 н. HCl

Таблица 27

Условия атомно-абсорбционных измерений в воздушно-ацетиленовом пламени

Элемент	Длина волны, нм	Щель, нм	Пламя	Высота горелки, мм	Оптимальный диапазон рабочих концентраций, мкг/см3	Предел определения мкг/см3
1	2	3	4	5	6	7
Натрий	330,2	3,0	Окислительное	7-8	10-100	1
	589,6	0,4		7-8	2-30	0,1
	589,0	0,4		7-8	0,5-5	0,005
Калий	404,5	0,4	Стехиометрическое	7-8	50-1000	8
	769,9	1,5		7-8	5-50	0,5
	766,5	1,5		7-8	0,5-10	0,005
Магний	285,2	3,0	Окислительное	10-15	0,1-10	0,001
Кальций	422,7	3,0	Окислительное	15-20	5-30	0,01
Железо	248,3	0,2	Стехиометрическое	7-8	1-10	0,01
Цинк	213,9	1,5	Окислительное	6-7	1-10	0,002
Медь	324,8	1,5	Стехиометрическое	7-8	0,005-5	0,003
Марганец	279,5	0,7		7-8	0,1-2	0,003
Свинец	283,3	2,0		7-8	0,1-2	0,02
Свинец	217,0	2,0		7-8	0,1-2	0,01
Кадмий	228,8	1,0	Окислительное	6-7	0,02-1	0,001
Кобальт	240,7	0,2	Стехиометрическое	6-7	0,05-2	0,01
Никель	232,1	0,2	Стехиометрическое	6-7	0,1-5	0,01
Хром	357,9	1,3	Восстановительное	6-7	0,1-5	0,005
Хром	359,4	1,3	Восстановительное	6-7	0,05-5	0,005

Три вида воздушно-ацетиленового пламени, указанные в табл. 27, устанавливают приближенно и, как правило, визуально. Восстановительное пламя соответствует соотношению потоков воздух/ацетилен (примерно 4:1), при котором появляется слабое белесое свечение в нижней части факела. Окислительное пламя требует вдвое меньшего расхода ацетилена при том же воздушном потоке. Стехиометрическим пламенем считается промежуточный вариант. При определении микроэлементов, особенно кобальта, никеля и хрома условия измерения могут быть дополнительно улучшены при юстировке соотношения газов и высоты горелки до получения максимального сигнала поглощения (с учетом смещения нулевой линии).

Предел определения соответствовал тройному стандартному отклонению шума измеряемого сигнала прибора у авторов методики

Особенности определения отдельных элементов

Натрий и калий

Может измеряться как абсорбция, так и эмиссия этих элементов.

В отличие от атомно-абсорбционного измерения эмиссия натрия при длине волны дублетной линии 589 нм может давать завышенные результаты вследствие наложения излучения кальция. Поэтому при атомно-эмиссионных измерениях натрия подготовка проб должна включать отделение кальция посредством осаждения его оксалатом аммония.

При концентрациях калия менее 100 мкг/см3 необходимо согласовывать примерное соотношение калия и натрия в пробах и смешанных растворах сравнения. Это соотношение может устанавливаться как на основе ожидаемых результатов, так и путем предварительных приближенных определений. При концентрациях калия более 100 мкг/см3 влиянием натрия можно пренебречь.

Кальций

Бланковый раствор, растворы проб и растворы сравнения должны содержать 0,5% стронция (в расчете на металл) в виде хлорида.

Железо и цинк

Растворы проб для анализа во многих случаях требуют разбавления, которое уменьшает межэлементные и матричные влияния. Превышение границ диапазона рабочих концентраций, указанных в табл. 26, может дать смещенные результаты.

Проведение измерений и обработка результатов

Измерения проводят в соответствии с технической инструкцией, прилагаемой к прибору, с учетом следующих особенностей. Потенциальная возможность появления дрейфа или измерения чувствительности вследствие частичного засорения системы распылителя в процессе работы требует более или менее частого контроля, т.е. проведения повторных градуировок. Частота переградуировок определяется скоростью дрейфа и требованиями точности. При отсутствии дрейфа или для кратковременной серии измерений достаточно проведения двух градуировок - в начале и в конце измерений. В других случаях целесообразно проводить измерения по следующей схеме: 1-я градуировка - 1-я серия замеров абсорбции 5-10 анализируемых растворов - 2-я градуировка - 2-я серия замеров абсорбции тех же растворов в обратном порядке - 3-я градуировка. Результаты, полученные в двух сериях, усредняют.

Таблица 28

Метрологические характеристики унифицированных атомно-абсорбционных методов анализа БАД

Элемент	X, мг/кг	r, мг/кг	R, мг/кг	Интерполяционные уравнения типа S = аХ(в)
				S_r		S_R
				а	в	а	в
1	2	3	4	5	6	7	8
Натрий	100	22	95
	1000	191	524	0,104	0,94	1,17	0,74
	10000	1658	2848
Калий	100	27	54
	1000	148	361	0,317	0,74	0,443	0,82
	10000	809	2386
Кальций	100	29	55
	1000	178	512	0,267	0,79	0,223	0,97
	10000	1106	4808
Магний	100	26	53
	1000	235	384	0,107	0,96	0,365	0,86
	10000	2164	2755
Железо	10	3,8	15	0,362	0,57	1,47	0,57
	50	9,3	38
	100	14	57
	200	20	84
Цинк	1	0,34	0,73
	10	2,4	4,3
	50	9,6	15	0,120	0,86	0,260	0,78
	100	17	26
Медь	0,5	0,22	0,40
	1	0,31	0,64	0,106	0,41	0,228	0,67
	10	0,76	3,01
	30	1,2	6,3
Марганец	0,1	0,056	0,12
	1	0,22	0,84	0,081	0,62	0,296	0,84
	10	0,92	5,7
	30	1,8	14
Свинец	0,01	0,005	0,014
	0,1	0,025	0,073	0,047	0,71	0,140	0,73
	0,5	0,081	0,24
	1,0	0,13	0,39
Кадмий	0,01	0,0034	0,011
	од	0,017	0,056	0,032	0,72	0,094	0,69
	0,5	0,055	0,17
	1,0	0,090	0,27
Кобальт	0,02	0,027	0,053
	0,1	0,045	0,11	0,032	0,31	0,121	0,47
	1,0	0,090	0,34
	5,0	0,15	0,72
Никель	0,02	0,028	0,050
	0,1	0,084	0,14	0,134	0,66	0,210	0,63
	1	0,36	0,59
	10	1,7	2,49
Хром	0,01	0,011	0,018
	0,1	0,045	0,11	0,070	0,63	0,243	0,77
	0,5	0,13	0,39
	1,0	0,20	0,67

Обработка результатов

Пересчет концентрации элемента в растворе (С, мкг/см3) на содержание его в БАД (X, мг/кг) проводят по формуле:

                        C x Y x K - C  x Y

                                     к    к

                   X = ---------------------, где

     C  - уровень загрязнения в контрольном опыте, мкг/см3;

к

     К  - коэффициент разбавления или концентрирования исходного раствора

          пробы, равный отношению  объема  анализировавшегося  раствора к

          объему аликвоты, взятой для разбавления или концентрирования;

     Y  - объем исходного раствора пробы, см3;

     Y  - объем раствора в контрольном опыте,см3;

к

     m  - навеска пробы, г.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории (r) и е# допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), а также внутрилабораторное среднеквадратичное отклонение (s_r) и межлабораторное среднеквадратичное отклонение (S_r) приведены в табл. 28, где X - средний уровень концентрации элемента в продукте, мг/кг; а, в - безразмерные эмпирические коэффициенты.

2. Молибдено-ванадиевый метод определения фосфора

Метод предназначен для определения массовой доли фосфора в БАД основан на образовании желтого фосфорно-молибдено-ванадиевого комплекса. Метод заключается в сухой минерализации пробы, растворении золы, проведении цветной реакции с молибдено-ванадиевым реактивом и измерении интенсивности желтого окрашивания раствора.

1. Аппаратура, реактивы и материалы

Калий фосфорнокислый однозамещенный, х. ч., по ГОСТ 4198.

Аммоний ванадиевокислый, мета, х. ч., по ГОСТ 9336.

Аммоний молибденовокислый, ч. д. а., по ГОСТ 3765.

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление раствора соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/дм3

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 67,4 см3 концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

2.2. Приготовление основного стандартного раствора фосфора с массовой концентрацией 1 г/дм3

Раствор готовят по ГОСТ 4212.

Раствор готовят из калия фосфорнокислого однозамещенного, предварительно высушенного до постоянной массы в сушильном шкафу при 104°C или в эксикаторе над концентрированной серной кислотой. Навеску 4,3930 г КН2РО4, взвешенную с погрешностью не более 0,001 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 дм3, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и перемешивают.

2.3. Приготовление раствора аммония ванадиевокислого с массовой концентрацией 2,5 г/дм3 (раствор А)

2,5 г аммония ванадиевокислого растворяют в мерной посуде вместимостью 1 дм3 в 500 см3 кипящей дистиллированной воды. После охлаждения раствора до комнатной температуры в него вносят 20 см3 концентрированной азотной кислоты. Объем раствора доводят до 1 дм3 дистиллированной водой, перемешивают.

2.4. Приготовление раствора аммония молибденовокислого с массовой концентрацией 100 г/дм3 (раствор Б)

100 г аммония молибденовокислого растворяют в мерной посуде вместимостью 1 дм3 в 500 см3 дистиллированной воды, подогретой до 50°C. Раствор охлаждают до комнатной температуры, затем осторожно при перемешивании стеклянной палочкой вносят 100 см3 концентрированной серной кислоты. Перемешивание продолжают до достижения раствором комнатной температуры, доводят его объем до 1 дм3 дистиллированной водой, перемешивают.

2.5. Приготовление молибдено-ванадиевого реактива

Реактив готовят смешиванием равных объемов растворов А и Б. Составной реактив годен в течение месяца.

2.6. Минерализация

Минерализацию проводят сухим способом по ГОСТ 26929-86.

ГАРАНТ:

Постановлением Комитета РФ по стандартизации, метрологии и сертификации от 21 февраля 1995 г. N 78 взамен ГОСТ 26929-86 с 1 января 1996 г. введен в действие ГОСТ 26929-94

Рекомендуемые величины массы навески указаны в табл. 29.

Таблица 29

Масса навески БАД при определении массовой доли фосфора

Сырье и продукция	Масса навески, г
БАД на зерновой основе	3-5
БАД на основе морепродуктов	5
БАД на фруктово-овощной основе	25
БАД на жировой основе	1-2

2.7. Измерения проводят на спектрофотометре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм при длине волны 436 нм или на фотоэлектроколориметре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 20 мм со светофильтром ламбда = 440.5 нм.

2.8. Приготовление растворов сравнения

2.8.1. В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 5 см3 основного стандартного раствора фосфора с массовой концентрацией 1 г/дм3, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают. Раствор готовят в день построения градуировочного графика.

2.8.2. При проведении измерений на спектрофотометре в мерные колбы вместимостью 50 см3 вносят 1, 2, 3, 4, 5, 6 см3 рабочего стандартного раствора фосфора, приготовленного по п. 2.8.1, соответственно 100, 200, 300, 400, 500 и 600 мкг фосфора, добавляют воду до объема 10 см3. В каждую колбу вносят 10 см3 разбавленной (1:9) серной кислоты, 10 см3 составного молибдено-ванадиевого реактива, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

2.8.3. При проведении измерений на фотоэлектроколориметре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 20 мм в мерные колбы вместимостью 50 см3 вносят 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 см3 рабочего стандартного раствора фосфора, приготовленного по п. 3.8.1, соответственно 50, 100, 150, 200, 250 и 300 мкг фосфора, и далее по п. 2.8.2.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "п. 3.8.1" следует читать "п. 2.8.1"

2.8.4. Растворы выдерживают 30 мин при температуре 20-30°C и измеряют оптическую плотность против контрольного раствора.

2.8.5. Построение аналитического градуировочного графика

Градуировочный график строят, откладывая на оси абцисс введенные в растворы сравнения массы фосфора в мкг, на оси ординат - соответствующие им значения оптической плотности.

3. Проведение испытания

3.1. Золу, полученную по п. 2.6, растворяют в 5 см3 раствора соляной кислоты (1 + 1) при нагревании на кипящей водяной бане и раствор упаривают до влажных солей, к осадку в тигле добавляют 20 см3 раствора соляной кислоты (25 г/дм3) и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин. После охлаждения содержимое тигля количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят до метки раствором соляной кислоты 25 г/дм3. Раствор перемешивают.

3.2. В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают аликвотный объем от 1 до 4 см3 раствора, приготовленного по п. 3.1, добавляют воду до объема 10 см3, 10 см3 разбавленной (1:9) серной кислоты, 10 см3 составного молибдено-ванадиевого реактива, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

Оптическую плотность раствора измеряют по п. 2.8.4.

3.3. По полученному значению оптической плотности с помощью градуировочного графика находят массу фосфора, содержащуюся в аликвотном объеме минерализата.

4. Обработка результатов

4.1. Массовую долю фосфора в мг/100 г вычисляют по формуле:

                                m x V

                         X = -------------, где

                              V  x M х 10

     m  - масса фосфора, найденная по градуировочному графику, мкг;

     V  - общий объем минерализата, см3;

     V  - аликвотный объем минерализата, взятый для испытания, см3;

     10 - коэффициент пересчета в мг/100 г;

     М  - навеска образца, г.

4.2. Результаты определений рассчитывают до третьей значащей цифры.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

4.3. Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), приведены в табл. 30.

Таблица 30

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

Содержание фосфора, мг/100 г	Rr, %	RR, %
До 100	20	40
От 100 до 300	15	30
Свыше 300	10	20

3. Комплексонометрический метод определения кальция и магния

Метод предназначен для определения массовой доли кальция и магния в БАД основан на образовании в щелочной среде малодиссоциированных комплексных соединений катионов кальция и магния с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б). При pH 12-13,5 образуются комплексные соединения кальция, при pH 10,0 - кальция и магния. Метод заключается в сухой минерализации пробы при 450°C, растворении золы, титровании раствора золы раствором трилона Б в присутствии индикатора кислотного хромового темно-синего.

1. Специфические реактивы

Индикатор хромовый темно-синий кислотный по ТУ 6-09-3870, 5 г/дм3 в растворе этилового спирта (1:5).

Индикатор метилрот по ГОСТ 5853, 1 г/дм3 в растворе этилового спирта (5:3).

Гидроксиламин солянокислый по ГОСТ 5459, х.ч., раствор 100 г/дм3.

Калия или натрия гидроокись по ГОСТ 24363 и ГОСТ 4328, соответственно, х. ч., раствор 200 г/дм3.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч., раствор 25 г/дм3 и разбавленная (1:1).

Натрий сернистый по ГОСТ 2053, ч. д. а., раствор 20 г/дм3.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280, х. ч., раствор 100 г/дм3.

Соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты двуводная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х. ч., или стандарт-титр.

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление растворов для проведения испытания

2.1.1. Приготовление основного раствора кальция с молярной концентрацией 0,01 моль/дм3. Кальций углекислый высушивают до постоянной массы при 100-105°C. Навеску соли 1,009 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1 000 см3, приливают 20 см3 концентрированной соляной кислоты, доводят объем раствора до 1 000 см3 водой, тщательно перемешивают.

2.1.2. Приготовление буферного раствора с pH 10,0

20 г хлористого аммония растворяют в небольшом количестве воды, переносят в мерную колбу вместимостью 1 000 см3, приливают 80 см3 аммиака 250 г/дм3, доводят объем раствора до 1 000 см3.

2.1.3. Приготовление раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,01 моль/дм3

Раствор трилона Б готовят из стандарт-титра. При отсутствии стандарт-титра навеску 3,72 г трилона Б, взвешенную с погрешностью не более 0,01 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1 000 см3, растворяют в воде, доводят объем раствора до 1 000 см3 бидистиллированной водой, перемешивают. Мутный раствор фильтруют. Срок хранения 6 мес.

2.1.4. Определение точной концентрации раствора трилона Б

Пипеткой отбирают 10 см3 основного раствора кальция в коническую колбу вместимостью 100 см3. Вносят 5-10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего и 6 см3 раствора гидроокиси натрия с массовой концентрацией 200 г/дм3. Быстро титруют из бюретки раствором трилона Б до перехода окраски из малиново-фиолетовой в синюю, не исчезающую в течение 1 мин. Молярную концентрацию раствора трилона Б рассчитывают по формуле:

                                0,01 x 10

                           С = ------------, где

     С    - молярная концентрация раствора трилона Б, моль/дм3;

     0,01 - молярная    концентрация    стандартного  раствора   кальция,

             моль/дм3;

     10   - объем стандартного раствора  кальция,  взятый для титрования,

            см3;

     V    - объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование, см3.

2.2. Минерализация

2.2.1. Минерализацию сухим способом проводят по ГОСТ 26929-86.

2.2.2. В табл. 31 указаны рекомендуемые величины массы навесок для некоторых продуктов.

3. Проведение испытаний

3.1. К золе, полученной по п. 2.2, добавляют 20 см3 раствора соляной кислоты с массовой концентрацией 250 г/дм3 и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5-10 мин до полного растворения золы, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

3.2. Перед проведением анализа необходимо приготовить микробюретку для титрования.

3.3. Определение массовой доли кальция

3.3.1. В коническую колбу вместимостью 100 см3 помещают аликвотный объем раствора золы, равный 10 см3, добавляют 3 см3 раствора гидроксиламина и 3 см3 раствора натрия лимоннокислого. Вносят 5-10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего. Приливают 6 см3 раствора гидроокиси с массовой концентрацией 200 г/дм3 и тотчас быстро титруют раствором трилона Б до перехода окраски из малиново-фиолетовой в синюю, сравнивая с оттитрованной контрольной пробой.

Таблица 31

Масса навески БАД при определении массовой доли кальция и магния

Сырье и продукция	Масса навески, г
БАД на зерновой основе	5-10
БАД на основе морепродуктов	10-20
БАД на фруктово-овощной основе	25-50

3.3.2. В конце титрования замечают объем трилона Б, пошедшего на титрование, и прибавляют еще каплю трилона. Если окраска раствора не меняется, титрование считают законченным.

3.3.3. Во время титрования можно ориентироваться на синий ореол, образующийся в месте падения капли трилона. Титрование считают законченным, если синий ореол больше не образуется.

3.3.4. Окраску раствора необходимо смотреть на фоне белого экрана. Окраска оттитрованного раствора устойчива длительное время.

3.3.5. Перед определением кальция оттитровывают контрольную пробу, которую готовят по п. 3.3.1, но вместо раствора золы приливают 4 см3 соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/дм3.

3.3.6. В том случае, если на титрование аликвоты раствора золы уходит больше 3 см3 трилона либо конец титрования затягивается, испытуемый раствор следует разбавить.

3.3.7. Если на титрование уходит меньше 0,5 см3 трилона Б, необходимо увеличить массу навески анализируемой БАД либо аликвотный объем, взятый для анализа. Можно уменьшить концентрацию трилона, разбавив его в 2 раза.

3.4. Определение массовой доли магния

3.4.1. Другие 10 см3 раствора золы, в которых определяют сумму кальция и магния, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, вносят 1-2 капли метилрота и нейтрализуют из бюретки гидроокисью натрия с массовой концентрацией 50 г/дм3. Добавляют 0,5 см3 раствора сернистого натрия, разбавляют водой до 100 см3, добавляют 5 см3 буферного раствора. pH полученного раствора равен 10,0. Вносят 5-10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего и медленно титруют трилоном Б до устойчивой голубой окраски, сравнивая с оттитрованной контрольной пробой. При титровании раствор интенсивно перемешивают. Замечают объем, пошедший на титрование, прибавляют еще несколько капель трилона Б. Если окраска не меняется, титрование считают законченным.

3.4.2. Перед определением магния оттитровывают контрольную пробу, которую готовят по п. 3.4.1, но вместо раствора золы приливают 4 см3 соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/дм3.

3.4.3. Объем трилона Б, пошедший на титрование магния, определяют по разности объемов трилона, пошедшего на титрование, суммы кальция и магния и одного кальция.

Примечание. Метод неприменим для определения массовой доли магния в БАД, в которых массовая доля кальция в 20 раз и более превышает массовую долю магния.

4. Обработка результатов

4.1. Массовую долю кальция (X_1) в % вычисляют по формуле:

                   C x V  x (V  - V ) x 40,08 x 100

                        0     2    1

             X  = ----------------------------------- , где           (1)

              1            V  x m x 1000

     С     - молярная концентрация раствора трилона Б, моль/дм3;

     V     - объем исходного раствора золы, см3;

     V     - объем   раствора   трилона  Б, израсходованный на титрование

      1      контрольной пробы, см3;

     V     - объем  раствора трилона  Б,  израсходованный  на  титрование

      2      кальция, см3;

     V     - объем исследуемого раствора, взятый для титрования, см3;

     m     - навеска БАД, г;

     100   - коэффициент пересчета в 100 г образца;

     40,08 - атомная масса кальция, г;

4.2. Массовую долю магния (X_2) в% вычисляют по формуле:

               C x V  x ((V  - V ) - (V  - V )) x 24,305 x 100

                    0      5    4      2    1                         (2)

         X  = --------------------------------------------------, где

          2                V  x m x 1000

     V      - объем раствора  трилона  Б,  израсходованный  на титрование

      4       контрольной пробы, см3;

     V      - объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование суммы

      5       кальция и магния, см3;

     24,305 - атомная масса магния, г;

     остальные обозначения те же, что и в формуле (1).

4.3. Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до целого числа. Минимальная массовая доля кальция, определяемая данным методом в аликвотном объеме минерализата, составляет 10 мкг. Минимальная массовая доля магния, определяемая данным методом в аликвотном объеме минерализата, составляет 6 мкг.

4.4 Метрологические характеристики

Относительно допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднеарифметическому значению Rr, и относительно допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднеарифметическому значению RR в зависимости от содержания Са и Mg в продукте приведены в табл. 32.

Таблица 32

Относительно допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

Содержание Са или Mg, мг на 100 г продукта	Сходимость, Rr, %		Воспроизводимость, RR, %
Содержание Са или Mg, мг на 100 г продукта	Са	Mg	Са	Mg
До 10	30	25	60	55
10-100	20	20	40	40
Свыше 100	15	15	20	20

4. Определение свинца и кадмия методом инверсионной вольтамперометрии

Метод основан на использовании инверсионной вольтамперометрии.

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Полярограф марки ПЛС-1 или аналогичный по техническим характеристикам.

Азот газообразный по ГОСТу 9293-74, о. ч., или "0", или другой инертный газ с массовой долей кислорода не более 0,001%.

Кадмий, ч. д. а.

Дитизон по ГОСТ 10165-79, ч. д. а., растворы в хлороформе 0,01; 0,30 г/дм3.

Кислота азотная, о. ч., по ГОСТ 11135-78 или кислота азотная, х. ч., по ГОСТ 4461-77, плотностью 1,40 г/см3 и разбавленная бидистиллированной водой (1 + 1) и (1 + 2).

Кислота соляная, о. ч., по ГОСТ 14261-77 или кислота соляная по ГОСТ 3118-77, плотностью 1,19 г/см3, разбавленные бидистиллированной водой растворы HCl концентрации 2,0 и 0,1 моль/дм3.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч. д. а., гранулированная и раствор NaOH, 0,02 моль/дм3.

Пирогаллол А по ГОСТ 6408-75, ч. д. а., раствор 250 г/дм3.

Ртуть по ГОСТ 4658-73, РО или PI.

Свинец азотнокислый, х. ч., по ГОСТ 4236-77.

Подготовка к испытанию

Подготовка проб

Подготовку проб и минерализацию БАД путем сухого озоления проводят по ГОСТу 26926-86.

Подготовка лабораторной посуды

Лабораторную стеклянную посуду промывают хромовой смесью, водой, азотной кислотой плотностью 1,4 г/см3, несколько раз дистиллированной и дважды бидистиллированной водой и высушивают. Затем промывают раствором дитизона 0,01 г/дм. Даже при незначительном изменении окраски проводят несколько раз обработку дитизоном: заполняют посуду раствором дитизона 0,30 г/дм3 и выдерживают каждый раз по 30 мин, после чего промывают хлороформом и повторяют обработку, используя раствор дитизона 0,01 г/дм3. Промывают хлороформом и высушивают на воздухе в вытяжном шкафу.

Очистка инертного газа от кислорода

При наличии примеси кислорода более 0,001% газ пропускают через поглотительную смесь, состоящую из растворов пирогаллола и гидроокиси натрия в соотношении 1:5.

Приготовление основного раствора кадмия

Основной раствор кадмия готовят следующим образом: 1,000 г металлического кадмия помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3 и растворяют при нагревании на электроплитке в 25 см3 разбавленной (1:1) азотной кислоты. Раствор выпаривают на электроплитке со слабым нагревом до объема 3 см3, приливают 15 см3 соляной кислоты плотностью 19 г/см3 и вновь выпаривают до того же объема. Выпаривание повторяют еще раза два, добавляя каждый раз по 5 см3 соляной кислоты. После охлаждения добавляют 50 см3 соляной кислоты плотностью 1,19 г/см3, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 1 000 см3 и доводят бидистиллированной водой до метки. Раствор хранят на более 1 года. Концентрация кадмия в основном растворе равна 1 мг/см3. Стандартные растворы необходимой концентрации готовят последовательным разбавлением в 10, 100 и 1 000 раз основного раствора кадмия соляной кислотой 0,1 моль/дм3.

Приготовление основного раствора свинца

Основной раствор свинца готовят следующим образом: свинец азотнокислый перекристаллизовывают и высушивают при 104 +- 1°C до постоянной массы. 1,599 г высушенной соли растворяют в небольшом объеме бидистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1 000 см3. В колбу добавляют 5 см3 азотной кислоты плотностью 1,4 г/см3 и доводят объем раствора до метки бидистиллированной водой. Раствор хранят не более 1 года. Концентрация свинца в основном растворе равна 1 мг/см3. Стандартные растворы необходимой концентрации готовят последовательным разбавлением в 10, 100 и 1000 раз основного раствора свинца соляной кислотой с концентрацией 0,1 моль/дм3.

Приготовление контрольного раствора

Проверяют каждую новую партию реактивов.

Готовят, используя все реактивы и растворы, аналогично приготовлению испытуемого раствора. Если контрольный раствор содержит измеримое количество кадмия или свинца, его готовят ежедневно при каждой серии измерений.

Подготовка капилляра электрода

В стакан электролизера помещают около 20 см3 раствора соляной кислоты 2 моль/дм3 и проводят сначала накопление в течение 60 с, затем растворение при максимальной скорости развертки (10,5 х 10 mВ/с). Процедуру электрохимической очистки повторяют еще 2 раза. Ячейку многократно промывают бидистиллированной водой.

Приготовление испытуемого раствора

Золу, полученную по ГОСТ 26929-86, растворяют в тигле при нагревании на электроплитке в 5 см3 разбавленной (1:1) соляной кислоты, раствор выпаривают на электроплитке до объема около 1 см3 и затем досуха на водяной бане. Осадок растворяют в 15 см3 раствора соляной кислоты 0,1 моль/дм3 и количественно переносят в стакан электролизера, смывая тигель 5 см3 той же кислоты.

Проведение испытания

Стакан с пробой помещают в гнездо полярографического датчика, опускают в испытуемый раствор подводящую инертный газ или азот трубку и барбатируют раствор в течение 10-15 мин, затем конец поднимают, закрепляют над поверхностью раствора и несколько ослабляют ток газа. Записывают первую полярограмму. При этом измерение проводят инверсионной вольтамперометрией в 3 электродном режиме. Накопление проводят при начальном напряжении 1100 мВ, время накопления от 60 до 300°C в зависимости от концентрации металлов. Полярограмму записывают при напряжении от минус 1100 мВ до 200 мВ, развертка анодная. Детализацию условий измерений осуществляют в соответствии с инструкцией к прибору и спецификой измеряемой пробы. Затем в стакан с используемым раствором вносят добавку - необходимый стандартный раствор в таком количестве, чтобы высота пика кадмия или свинца примерно удвоилась по сравнению с первоначальной. При этом объем добавляемого стандартного раствора должен быть не более 0,5 см3. Снова пропускают через раствор азот, как указано выше, в течение 5 мин. Затем проводят в тех же режимах запись второй полярограммы.

Обработка результатов

Массовую долю кадмия или свинца (X) в мг/кг или массовую концентрацию (мг/дм3) вычисляют по высоте пиков, измеренных на полярограммах с помощью линейки с точностью до 1 мм.

Расчет проводят по формуле:

для массовой доли:

                         М  x H  х V

                          1    1    1

                 Х = [------------------- - X ] : M;

                       H  x V  - H  x V      к

                        2    2    1    1

для массовой концентрации:

                         М  x H  х V

                          1    1    1

                 Х = [------------------- - X ]:V , где

                       H  x V  - H  x V      к

                        2    2    1    1

     М  - масса свинца, добавленного  перед  вторым  полярографированием,

      1    мкг;

     Н  - высота пика свинца, полученного при первом  полярографировании,

      1   мм;

     H  - высота пика свинца, полученного при втором  полярографировании,

      2   мм;

     V  - объем   испытуемого   раствора,  приготовленного  из  озоленной

      1   навески, см3;

     V  - объем испытуемого раствора после внесения добавки, см3;

     М  - масса навески БАД, взятая для озоления, г;

     V  - объем БАД, взятый для озоления, см3;

     Х  - масса свинца в контрольном растворе, мкг.

к

Вычисление производят до четвертого десятичного знака.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Таблица 33

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

Показатель	Свинец	Кадмий
Относительная внутрилабораторная сходимость Rr, %	30	30
Относительное межлабораторное расхождение RR, %	60

III. Методы определения микроэлементов

1. Определение йода титрометрическим методом

Принцип метода

Метод основан на взаимодействии йодата калия с йодидом калия в кислой среде (1) и титровании выделившегося йода тиосульфатом натрия (2).

(1) IO3(-1) + 5I(-1) + 6Н+ (3I2+ 3Н2О (из соли) (из KI) (из H2SO4)

(2) 2Na2S2O3 + I2 (2NaI + Na2S4O6 (тиосульфат (иодат (тетратионат натрия) натрия) натрия)

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

1 Калий йодистый (KI) по ГОСТ 4232-74.

2 Кислота серная (H2SO4) по ГОСТ 4204-77.

3 Натрий серноватистокислый пятиводный (тиосульфат натрия, Na2S2O3(5H2O) по ГОСТ 27068-86 или фиксанал 0,1 г-экв.

4 Крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76.

5 Натрия хлорид, ЧДА, ГОСТ 4233-77.

Приготовление реактивов

0,005 М тиосульфат натрия (Na2S2O3(5H2O). 1,24 г Na2S2O3(5H2O) развести в 1 000 см3 дистилированной свежепрокипяченной воды. Т.к. кристаллический тиосульфат при хранении набирает влагу, что требует введения поправки на его титр, то в случае возникновения сомнений рекомендуется использовать фиксанал Na2S2O3(5H2O) 0,1 г-эквивалент, который растворяют в дистиллированной воде, доводя конечный объем до 1 000 см3 и полученный раствор разводят в 20 раз (50 см3 раствора + 950 см3 воды) до конечной концентрации 0,005М.

Полученный раствор хранят в прохладном темном месте. Его объем достаточен для анализа 100-200 проб в зависимости от содержания в них йода. При соблюдении условий хранения раствор стабилен не менее одного месяца.

2 Н серная кислота (H2SO4). 6 см3 концентрированной H2SO4 медленно доливают в 90 см3 воды, затем доводят раствор водой до конечного объема 100 см3. Полученное количество достаточно для анализа 100 проб. Раствор сохраняет свои свойства неопределенно долгое время.

Примечание. Во всех случаях кислоту надо наливать в воду, а не наоборот, во избежание чрезмерного повышения температуры смеси и разбрызгивания кислоты. Во время добавления кислоты раствор следует непрерывно перемешивать.

10%-ный йодид калия (KI) свежеприготовленный. 10 г KI растворяют в 100 см3 воды. Хранят в прохладном темном месте. Его количества достаточно для анализа 20 проб.

Насыщенный раствор хлорида натрия (NaCl). В колбу объемом 250 см3 с 80 см3 воды постепенно добавляют при перемешивании и/или нагревании NaCl до тех пор, пока не прекратится его растворение. Хранят под пробкой. Раствор сохраняет свои свойства по крайней мере в течение года.

Индикаторный раствор крахмала. В колбу объемом 250 см3 вносят 1 г растворимого крахмала, добавляют 10 см3 воды и нагревают до растворения крахмала. В полученную горячую смесь добавляют 90 см3 насыщенного раствора NaCl и перемешивают. Полученного объема достаточно для анализа 50 проб. Готовый раствор хранят в прохладном темном месте. Раствор остается стабильным на протяжении месяца.

Примечание. В день проведения анализа раствор необходимо прогреть (но не кипятить) для ресуспендирования возможного осадка.

Проведение анализа

Этап 1. Навеску исследуемой пробы массой 10 г растворяют в 100 см3 дистиллированной воды в конической колбе объемом 250 см3. Если полученный раствор мутный, его необходимо профильтровать.

Этап 2. К полученному раствору добавляют 1 см3 2 н. H2SO4, перемешивают, добавляют 5 см3 10%-ного раствора KI, перемешивают, закрывают колбу пробкой и помещают на 10 мин. в темное место.

Этап 3. К исследуемому раствору, приобретшему темно-желтую окраску, добавляют из бюретки при перемешивании 0,005 М Na2S2O3 до перехода окраски в светло-желтую. Добавляют в исследуемый раствор примерно 2 см3 индикаторного раствора крахмала, от чего смесь должна приобрести темно-синюю окраску, и продолжают титрование до тех пор, пока последняя не исчезнет.

Отмечают объем раствора тиосульфата, пошедший на титрование.

Требования к безопасности:

- до начала титрования реакционную смесь следует хранить в темном месте ввиду возможности побочного процесса под воздействием света, который вызывает окисление ионов йодида до йода;

- при использовании не вполне остывшего раствора крахмала точность определений понижается;

- если индикаторный раствор добавлен слишком рано, происходит образование прочного, очень медленно реагирующего комплекса йода с крахмалом, что приводит к завышению результатов анализа;

- реакция должна проходить при умеренной комнатной температуре (ниже 30°C), поскольку йод характеризуется повышенной летучестью, а индикаторный раствор при нагревании теряет чувствительность.

Обработка результатов

Количество йода, мг/кг исследуемой соли вычисляют по формуле:

                X = V х 0,1057 х 100/10 = V х 10,57, где

     V      - объем 0,005М Na2S2O3, пошедший на титрование, см3;

     10     - навеска соли, взятой на анализ, г;

     100    - пересчет на 100 г соли;

     0,1057 - количество йода из иодата калия исследуемого образца  соли,

              соответствующее    1  см3  пошедшего  на  титрование  этого

              образца 0,005 М Na2S2O3.

Примечание. Из уравнений реакций (1) и (2), лежащих в основе данного метода определения йода в соли, обогащенной KIO3, следует, что из общего количества йода, оттитровываемого тиосульфатом натрия в исследуемой пробе, на долю йода, происходящего из КIO3 приходится 1 /6 часть, т.е. не 0,6345, а 0,1057 мг.

2. Определение селена спектрофлуориметрическим методом

Принцип метода

Метод основан на флуориметрическом определении комплекса селенистой кислоты с 2,3-диаминонафталином - пиазоселенола, получаемого при мокром сжигании образца смесью азотной и хлорной кислот, с последующим воостановлением соляной кислотой шестивалентного селена до четырехвалентного и образованием комплекса с 2,3 -диаминонафталином.

Подготовка к испытанию

Рабочие растворы

0,1 М раствор соляной кислоты: 1 см3 36% HCL разбавляют до 100 см3 водой

0,6 М раствор соляной кислоты: 51 см3 36% HCL разбавляют до 100 см3 водой

Раствор аммиака: 25% раствор аммиака разбавляют водой 1:1)

Раствор тетранатриевой соли этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА): 1,25 г ЭДТА растворяют в 100 см3 воды.

Раствор 2,3-диаминонафталина(ДАН) - готовят в день определения: 0,1 г ДАН растворяют в 100 см3 0,1М соляной кислоты при слабом нагревании. Раствор трижды экстрагируют гексаном, фильтруют через складчатый фильтр и хранят под слоем гексана в темноте при температуре 0-4°C до момента флуориметрического определения. Не допускается облучение прямым светом и использование смазки для шлифов.

Основной стандартный раствор, содержащий 1 мкМ селена/см3:

0,01729 г Na2SeO3 растворяют в небольшом количестве 0,1 М соляной кислоты в мерной колбе на 100 см3, доводят объем до метки соляной кислотой этой же концентрации. Раствор хранят в темноте не более 1 месяца.

Рабочий стандартный раствор, содержащий 1 нМ селена/см3: пипеткой вносят 5 см3 основного стандартного раствора в мерную колбу на 500 см3 и доводят объем до метки 0,1М соляной кислотой. Раствор хранят в темноте не более 1 месяца.

Мокрое сжигание. Взвешивают и переносят в пробирки для сжигания от 50 до 100 мг БАД и соответствующий образец сравнения. Для построения калибровочного графика в 7 пробирок вносят: 0 (контроль), 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного рабочего раствора, что соответствует 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 нМ селена в пробе. Во все пробирки добавляют 1,5 мл смеси, содержащей азотную и хлорную (42%-ные) кислоты в соотношении 1:0,7 и оставляют при комнатной температуре на 12-18 час, затем пробирки помещают в блок для сжигания и минерализуют прои# 120°C - 1 час, 150°C - 1 час, 180-185°C - 1,5 часа. При наличии обугливания сжигание повторяют с новой навеской, увеличив количество хлорной кислоты до 1,0-1,4 см3.

Удаление следов азотной кислоты

Блок сжигания охлаждают до 150°C, добавляют к пробам 1-2 капои# перекиси водорода и выдерживают при указанной температуре в течение 10 мин. Затем пробы сразу же вынимают из болка# сжигания.

Восстановление селената

К пробам добавляют по 1 см3 6М соляной кислоты и выдерживают при 110°C в течение 10 мин. Затем сразу же вынимают из блока сжигания и добавляют 1 см3 дистиллированной воды.

Конденсация селенистой кислоты с ДАН

В каждую пробирку добавляют по 0,5 см3 раствора ЭДТА и по 1 см3 раствора аммиака, быстро доводят pH до 1-2 по универсальному индикатору, добавляя при необходимости по каплям раствор аммиака или 0,1 М соляную кислоту. К полученным растворам приливают по 1 см3 раствора ДАН и выдерживают 30 мин при 50-55°C, закрыв предварительно пробирки от прямого света. По окончании реакции пробы охлаждают до комн. Температуры и каждую интенсивно встряхивают с 2,5 см3 гексана в течение 50-60 сек.

Спектрофлуориметрический анализ

Определение интенсивности флуоресценции осуществляют при длине волны возбуждающего света 376 нм и эмиссионного света 519 нм. Дополнительный контроль за полнотой сжигания осуществляют по спектрам флуоресценции в диапазоне 450-600 нм. Полученный спектр должен иметь один максимум 519 нм

Обработка результатов

Содержание селена, мкг/кг или мкг/л (X) вычисляют по формуле

                      Х = 79 х С/альфа, где

     С     - количество селена, нМ, в пробе, определенное по калибровочному

             графику;

     79    - атомная масса селена;

     альфа - навеска образца, г или см3.

За окончательный результат принимается среднее арифметическое двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное стандартное отклонение в интервале 1-600 мкг/кг - не более 10%.

3. Определение токсичных элементов

Анализируют согласно методов главы 2, раздела II и согласно нормативным документам "Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения содержания токсичных элементов", межгосударственный стандарт ГОСТ 26929-94, ГОСТ 26927-86 "Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов", межгосударственный стандарт ГОСТ 30178-96 "Методические указания по обнаружению и определению общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции N 5178-90", ГОСТ 26930-86 "Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка".

<< Глава 1. Методы определения макронутриентов		Глава 3. >> Минорные биологически активные компоненты БАД (методы определения подлинности БАД
	Содержание Руководство Р 4.1.1672-03 "Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище" (утв....

Глава 2. Методы определения микронутриентов

ГАРАНТ:

ГАРАНТ:

ГАРАНТ:

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас