Глава 2. Методы определения микронутриентов

Глава 2
Методы определения микронутриентов

I. Методы определения витаминов

1. Одновременное определение витаминов А, Е и каротиноидов в БАД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Метод определения витаминов А, Е и каротиноидов, включая (бета-каротин, альфа-каротин, ликопин, криптоксантин, лютеин, зеаксантин, при совместном присутствии в биологически активных добавках (витаминное драже, таблетки, порошки и кристаллические витаминные препараты, их растворы или суспензии в жирах) основан на экстракции микронутриентов органическим растворителем после щелочного омыления субстрата (1) или непосредственного растворения, упаривании полученного экстракта и переводе сухого остатка в другой растворитель, введении экстракта на ВЭЖХ колонку для хроматографического разделения и последующего определения с помощью флуоресцентного и спектрофотометрического детекторов (2). Определение массовой концентрации витаминов и каротиноидов основано на измерении площади (или высоты) пика при соответствующей каждому соединению длине волны детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации жирорастворимых витаминов А, Е и каротиноидов в биологически активных добавках с вероятностью Р = 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +-15% во всем диапазоне измерений.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Спектрофотометр, например, "СФ-46" с диапазоном измерения от 190 нм до 700 нм с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1% по ТУ 3-3.1841-84; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.

Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско 870-UV", Япония) с проточной кюветой объемом 8 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более 2% с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра (от 190 до 600 нм).

Спектрофлуориметрический детектор для ВЭЖХ (типа "Джаско" 821-FP) с проточной кварцевой кюветой объемом 16 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения интенсивности флуоресценции не более 2% с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра возбуждения и эмиссии (от 220-650 нм).

Насос для ВЭЖХ (типа "Джаско" 880-PU), позволяющий осуществлять расход элюента 0,5-1,0 см3/мин с возможностью работы при давлении не менее 300 кг/см2, погрешностью поддержания скорости подачи растворителя 0,6 см3/мин не более 2,5%.

Микрошприц (типа "Гамильтон", США) вместимостью 100 мм3 для ввода проб в жидкостный хроматограф.

Регистрирующее устройство: интегратор (типа "Шимадзу C-R6A", Япония) или самописец, позволяющий проводить измерение с погрешностью не более 0,5%.

Дозатор автоматический типа ПЛ-01-200.

Колбы мерные 2-100-2, 2-50-2 по ГОСТ 1770-74 Е.

Цилиндры вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770-74 Е.

Пробирки П-4-10-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427-75.

Вспомогательные устройства и материалы

Встряхиватель типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.

Центрифуга ОПн-8-У4.2 по ТУ 5.375-4261-76.

Баллон с газообразным азотом квалификации "ос.ч" по ГОСТ 9293-74.

Реактивы

Метанол (СН3ОН) для жидкостной хроматографии "ос. ч" по ТУ 6-09-2192-85.

Ацетонитрил (CH3CN) для жидкостной хроматографии "ос. ч" по ТУ 6-09-14-2167-84.

Метилен хлористый (СН2Сl2), "ос. ч" по ТУ 6-09-14-2149-83.

Гексан (С6Н6), "хч" для хроматографии по ТУ 6-00-4521.

Спирт этиловый (С2Н5ОН) ректификованный технический по ГОСТ 18300-87.

Полностью транс-ретинол (С20Н30О) кристаллический, номер по каталогу 124769 фирмы "Мерк" (Германия).

Ретинола ацетат (С22Н32О2) по Госфармакопея, X изд., ст.578.

Ретинола пальмитат (С26Н60O2) по ФС 42-2229-84

DL-aльфа-Токоферол (С29Н50О2), номер по каталогу Т3251 фирмы "Сигма".

aльфа-Токоферола ацетат (С31Н52О2) по ФС 42-2495-87.

Каротиноиды: лютеин (C40H56O2), ликопин (С40Н56), aльфа-каротин (C40H56), бета-каротин (С40Н56), соответствующие номера Х6250, L9879, С0251, С9750 по каталогу фирмы "Сигма" (США), зексантин С40Н56O2, бета-криптоксантин (С40Н56O) фирмы "Рош" (Швейцария).

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч. д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Средства измерения должны быть поверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерения, вспомогательного оборудования и реактивов, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

Условия выполнения измерений

Для предотвращения разрушения витаминов и каротиноидов анализ БАД и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление растворов

1. Приготовление раствора гидроокиси калия с массовой долей 50%.

50 г гидроокиси калия растворяют в 50 см3 дистиллированной воды.

2. Подвижная фаза для хроматографии

В мерную колбу на 500 см3 помещают 250 см3 ацетонитрила, 25 см3 дихлорметана и доводят объем смеси до метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения в темноте при 2-8°C - 1 год.

Количественное определение витаминов А, Е и бета-каротина

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, для чего проводят определение градуировочного коэффициента.

Для определения градуировочного коэффициента готовят несколько (не менее 4) калибровочных растворов витамина А (полностью транс-ретинол кристаллический; ретинола ацетат по Госфармакопея, X изд., ст. 578; ретинола пальмитат по ФС 42-2229-84) с концентрацией от 0,3 до 3 мкг/см3, витамина Е с концентрацией от 2 до 20 мкг/см3 (DL-aльфа-токоферол; aльфа-токоферола ацетат по ФС 42-2495-87), бета-каротина с концентрацией от 0,2 до 1,5 мкг/см3.

Приготовление градуировочных растворов витамина А

Для приготовления градуировочных растворов из ретинола 0,01 г витамина А количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 этанола. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов ретинола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см3 аликвоты раствора витамина А в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см3) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления калибровочных растворов из ацетата ретинола (пальмитата ретинола) 0,01 г витамина А помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, прибавляют 30 см3 этанола, 3 см3 50% раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63-68°C. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 см3 воды в делительную воронку и извлекают 150 см3 гексана (3 раза по 50 см3) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 см3 и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 1, 2, 3, 4, 5 см3 раствора в мерные колбы вместимостью 100 см3, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в этаноле и доводят объемы до метки тем же растворителем.

Приготовление градуировочных растворов витамина Е

Для приготовления градуировочных растворов из aльфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 2 см3 дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения токоферола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см3 аликвоты раствора витамина Е в этаноле (1, 3, 5, 7, 10 см3) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления градуировочных растворов из ацетата aльфа-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в коническую колбу вместимостью 100 см3, добавляют 0,2 г аскорбиновой кислоты, 30 см3 этанола, 3 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63-68°C. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 см3 воды в делительную воронку и извлекают 150 см3 гексана (3 раза по 50 см3) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 см3 и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 2, 4, 6, 8, 10 см3 раствора в мерные колбы вместимостью 100 см3, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в 1 см3 дихлорметана и доводят объемы до метки этанолом.

Приготовление градуировочных растворов каротиноидов

Для приготовления градуировочных растворов бета-каротина 5 мг кристаллического бета-каротина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавляют 1 мл дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов, после чего объем в колбе доводят до метки этанолом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см3 аликвоты раствора бета-каротина в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см3) добавляют растворитель до метки.

Градуировочные растворы других каротиноидов (aльфа-каротина, ликопина, бета-криптоксантина, лютеина, зеаксантина) готовят аналогично раствору бета-каротина.

Полученные растворы хранят в холодильнике при 2-8°C не более 6 месяцев.

Массовую концентрацию витаминов и каротиноидов в градуировочных растворах (С, мкг/см3) уточняют спектрофотометрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность (D) слоя градуировочного раствора толщиной 1 см по отношению к растворителю при длине волны, указанной в таблице, и рассчитывают по формуле:

                          D x 10

                     C = ----------,  где

1%

                          E    х l

                           1см

1%

     E    - коэффициент светопоглощения, см3 х мкг(-1) х см(-1);

      1см

     l - толщина слоя раствора, см;

     10  - коэффициент пересчета.

Таблица 11

Условия проведения спектрофотометрических измерений

Витамин (каротиноид)	Растворитель	Дельта макс., HM	Е(1%)_1 см	Литературный источник
Ретинол	этанол	325	1832	/2/
альфа-Токоферол	этанол	292	75,8	/2/
бета-Каротин	этанол	453	2620	/3/
альфа-Каротин	гексан	445	2710	/3/
Ликопин	гексан	474	3470	/3/
бета-Криптоксантин	гексан	451	2460	/3/
Зеаксантин	этанол	452	2480	/3/
Лютеин	этанол	447	2560	/3/

Градуировка прибора

Градуировка хроматографической системы проводится с целью убедиться, что область определяемых концентраций лежит в пределах линейного участка градуировочного графика, построенного по площадям (высотам) пиков. Она проводится в следующих случаях:

- на этапе освоения методики;

- при смене колонки и/или предколонки;

- при замене стандартного образца;

- в других случаях, когда есть основания полагать, что изменилась эффективность хроматографической системы или чувствительность детектора.

Градуировку хроматографа проводят, строя градуировочный график по серии градуировочных растворов. Аналитический сигнал (площадь, мм2 или высота пика, мм) фиксируют на интеграторе или самописце, соблюдая условия и продолжительность хроматографического разделения и детектирования (табл. 12).

Таблица 12

Условия детектирования витаминов А, Е и каротиноидов

Детектор	Условия детектирования
Детектор	Витамины (каротиноиды)	Длина волны детектирования	Продолжительность, мин
Флуориметрический	Витамин А	ламбда_возб = 325 нм ламбда_эмисс = 480 нм	0-6
Флуориметрический	Витамин Е	ламбда_возб = 295 нм ламбда_эмисс = 330 нм	6,1-16
Спектрофотометрический	Каротиноиды	ламбда = 450 нм	0-30

Ориентировочные времена удерживания и последовательность выхода витаминов из хроматографической колонки: ретинол - 4,0-4,5 мин, альфа-токоферол - 10,5-11,0 мин (флуориметрическое детектирование), бета-каротин > альфа-каротин > ликопин > бета-криптоксантин > лютеин > зеаксантин (спектрофотометрическое детектирование).

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см3". Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времен удерживания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций микронутриентов. Коэффициент градуировочного графика (k_гр) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых формуле:

                          k = ------, где

                           i   S

     С  - массовая   концентрация  микронутриентов    в    градуировочном

      i   растворе,  мкг/см3;

     S  - площадь (высота) аналитического сигнала.

Описание хроматографической системы

Подготовку к работе хроматографической системы, состоящей из последовательно соединенных насоса высокого давления, спектрофотометрического и флуориметрического детекторов и интеграторов проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.

Используется система для ВЭЖХ следующей конфигурации:

- аналитическая хроматографическая колонка (типа картридж "Элсикарт" фирмы "Элсико", Россия) из нержавеющей стали, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4 мм, с обращеннофазным сорбентом, например Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим, аналогичным по свойствам, с эффективностью по бета-каротину не ниже 5000 теоретических тарелок;

- предколонка из нержавеющей стали длиной 50 мм, внутренним диаметром 4 мм с сорбентом типа "Нуклеосил" 100 С18, 7 мкм или аналогичным по свойствам;

- петлевой кран-дозатор (инжектор ввода пробы типа "Реодайн 7125", США) с рабочим объемом петли 50 мм3;

- объемная скорость подачи подвижной фазы - 0,6 см3/мин.

Подготовка пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Взвешивают не менее 10 таблеток (драже, порошкообразное содержимое капсул) и определяют вес одной штуки, затем материал тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,05-0,20 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 15 см3 воды и нагревают на водяной бане при температуре от 60°C до 70°C при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 30 см3 этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 3 см3 50%-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре кипения смеси. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в делительную воронку и экстрагируют неомыляемые вещества 150 см3 гексана (3 раза по 50 см3) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 см3 до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу объемом V_1 (200 см3) и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Аликвоту V_2 (2 см3) полученного раствора переносят в мерную пробирку на 10 см3, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в точно измеренном объеме V_3 (1 см3) подвижной фазы.

Измерение концентрации витаминов и каротиноидов в экстракте пробы

Полученный раствор анализируют дважды с помощью хроматографической системы.

Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и спектральные отношения с временами удерживания и спектральными отношениями растворов соответствующих стандартов (табл. 13).

Таблица 13

Идентификация пиков витаминов и каротиноидов

Витамин	Время удерживания, мин	Условия детектирования - 1	Условия детектирования - 2	Соотношения аналитических сигналов (1:2)
Ретинол	4,0-4,5	ламбда_возб = 325 нм ламбда_эмисс. = 480 нм	ламбда_возб = 340 НМ ламбда_эмисс. = 95 НМ	1,2-1,3
альфа-токоферол	10,5-11,0	ламбда_возб = 295 нм ламбда_эмисс. = 330 НМ	ламбда_возб = 305 нм ламбда_эмисс. = 340 НМ	1,9-2,0
бета-каротин	28-30	450 нм	470 нм	1,1-1,2
альфа-каротин	24-26	450 нм	470 нм	1,2-1,3
Ликопин	17-18	450 нм	470 нм	0,7-0,8
бета-криптоксантин	11-12	450 нм	480 нм	1,0-1,1
Лютеин	5,0-5,5	450 нм	480 нм	1,2-1,3
Зеаксантин	5,6-6,5	450 нм	480 нм	1,2-1,3

Концентрацию витаминов и бета-каротина в растворе пробы (С_пр, мкг/см3) определяют по формуле:

                             C   = k   S  , где

                              пр    гр  пр

     S   - площадь (высота) пика витамина или каротиноида в растворе

      пр   пробы;

     k   - коэффициент градуировочного графика

      гр

За окончательный результат определения концентрации микронутриентов в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Представление результатов

Содержание микронутриентов (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки, рассчитывают по формуле:

                          0,001 x C   x V  x V

                                   пр    1    3

                     X = ----------------------- , где

                                 V  х m

     С   - концентрация  витамина  или  каротиноида    в    анализируемом

      пр   растворе  (мкг/ см3);  коэффициент  0,001  учитывает  пересчет

           содержания витаминов и бета-каротина в мг.

Минимально детектируемое количество ретинола и aльфа-токоферола - 0,1 мкг/мл, каротиноидов - 0,05 мкг/мл.

Погрешность измерения вычисляется по формуле:

                                дельта х Х

                      Дельта = ------------ , где

     дельта - характеристика погрешности измерений (п. 2), %.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации витаминов А, Е и бета-каротина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок.

Производят измерение концентрации витаминов и бета-каротина в экстракте пробы в соответствии с п. 5.7 (С_пр, мкг/см3), а затем с введенной в него добавкой (C_д, мкг/см3), который также анализируют (С', мкг/см3). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация микронутриентов в экстракте увеличилась на 50-150%. Для добавки используют градуировочные растворы микронутриентов.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

                   |С'- С   - С | <= 0,01-С  х К , где

                         пр    д           д    д

     К  - норматив оперативного контроля погрешности, составляющий 15%;

д

     С  - расчетное значение величины добавки, мкг/см3.

д

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

2. Определение витамина В-6 (пиридоксина) в БАД

Сущность метода

В биологически активных добавках витамин В-6 содержится в основном в виде пиридоксина гидрохлорида, действующим началом которого выступает пиридоксин (витамин В-6). Пиридоксин определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме со спектрофлуориметрическим детектированием. Массовую концентрацию пиридоксина определяют по площади (высоте) пика при соответствущих пиридоксину длинах волн флуориметрического детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями +- 15% во всем диапазоне измерений.

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ с спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220-650 нм) и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали, длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по пиридоксину не ниже 8 000 теоретических тарелок. (США) Р7949.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения пиридоксина под действием света подготовку проб и приготовление стандартных растворов пиридоксина проводят в посуде темного стекла, либо, обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1М.

К дистиллированной воде добавляют 4 см3 концентрированной соляной кислоты (ро = 1,19 г/см3), объем доводят до 500 см3.

Раствор фосфорной кислоты с массовой долей 30%.

41,3 г 85%-ной фосфорной кислоты (ро = 1,698 г/см3) растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 100 см3.

Приготовление 0,03 М калий фосфатный буфер, pH 3,0.

4,08 г дигидроортофосфата калия растворяют в 500 см3 дистиллированной воды, доводят pH потенциометрически с помощью раствора фосфорной кислоты с массовой долей 30% до значения 3,0 и объем доводят до 1000 см3.

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе.

40 г винной кислоты растворяют в 800 см3 дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 см3.

Подвижная фаза для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 500 см3 добавляют 100-150 см3 0,03 М калий фосфатного буфера, 20 см3 ацетонитрила, 326 мг гептилсульфоната натрия и доводят объем до метки фосфатным буфером. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение пиридоксина (витамина В-6)

Количественное определение пиридоксина проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) с концентрациями пиридоксина в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/см3.

Приготовление градуировочных растворов пиридоксина

Приготовление стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида с концентрацией пиридоксина 500 мкг/см3

Точную навеску 61 мг пиридоксина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в 0,1М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 7 000 М(-1) x см(-1) в 0,1М растворе едкого натра при длине волны 308 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес.

Градуировочные растворы пиридоксина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см3 аликвоты 1 см3 приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 см3 и получают раствор с концентрацией 5 мкг/см3. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают аликвоты раствора пиридоксина с концентрацией 5 мкг/см3 (0,2; 0,6; 1,0; 4,0 см3) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1. Аналитический сигнал (площадь в мм2 или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 290 нм, эмиссии 395 нм. Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0-15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/см3". Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций пиридоксина. Коэффициент градуировочного графика (k_гр) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых по формуле:

                             k  = ------, где

                              i     S

     С  - массовая концентрация пиридоксина в градуировочном растворе,

      i   мкг/см3,

     S  - площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2-1,5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 0,1М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3-5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 мин, периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3-5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колб# вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помешают# на УЗ-баню на 5 мин, доводят экстрагирующей смесью объем до 50 см3 и фильтруют через бумажный фильтр.

При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентрации пиридоксина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрацией пиридоксина в растворах для построения градуировочного графика (0,03-0,05 мкг/см3).

Полученные из экстрактов растворы анализируют дважды с помощью хроматографической системы, вводя на колонку с помощью крана-дозатора (петля 0,1 см3).

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя времена удерживания и спекральное отношение с временами удерживния и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 14).

Таблица 14

Идентификация пиков пиридоксина

Витамин

Время удерживания, мин

Условия детектирования - 1

Условия детектирования - 2

Соотношение аналитических сигналов (1:2)

Пиридоксин

15,0-15,6

ламбда_возб = 290 нм

ламбда_эмисс = 395 нм

ламбда_возб = 305 нм ламбда_эмисс = 410 нм

1,11

Концентрацию пиридоксина в растворе пробы (С_пр, мкг/см3) определяют по формуле:

                       C   = k   - S   , где

                        пр    гр    пр

     S   - площадь (высота) пика пиридоксина в растворе пробы;

      пр

     k   - коэффициент градуировочного графика.

      гр

За окончательный результат определения концентрации пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5% от среднего значения.

Обработка результатов

Содержание пиридоксина в 1 таблетке (драже) (мг):

                        k   х S   х V x k     х M

                         гр    пр        разв

                    C = -------------------------- , где

                     пр       m х 1000

     S      - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

      пр

     k      - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V      - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k      - конечное разведение гидролизата;

      разв

     m      - навеска таблеток, взятая на анализ;

     М      - масса таблетки;

     1000   - коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание пиридоксина в 1 капсуле (мг):

                        k   х S   х V x k     х M

                         гр    пр        разв

                 C   = --------------------------- , где

                  пр         n х 1000

     S     - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

      пр

     k     - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V     - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k     - конечное разведение гидролизата;

      разв

     n     - количество капсул, взятых на анализ;

     1000  - коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в гидролизат.

Производят измерение концентрации пиридоксина в гидролизате пробы (С_пр, мкг/см3), а затем с введенной в него добавкой (С_д, мкг/см3), который также анализируют (С', мкг/см3). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация пиридоксина в гидролизате увеличилась на 50-150%. Для добавки используют калибровочные растворы пиридоксина.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

                   |С'- С   - С | <= 0,01 x С  x К , где

                         пр    д             д    д

     К  - норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20%);

д

     С  - расчетное значение величины добавки, мкг/см3.

д

Таблица 15

Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения пиридоксина	0,005 мкг в 1 см3 гидролизата
Воспроизводимость, %	2,0
Правильность, %	98,6
Относительная сходимость, %	5,0

3. Одновременное определение витаминов в-1 и в-2 в бад методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Витамин В-1 (тиамин) под действием красной кровяной соли превращается в тиохром, который флуоресцирует в щелочной среде. В данном варианте методики происходит постколоночная дериватизация, то есть после отделения тиамина от пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме, а окисляющий агент смешивается с выходящим из колонки элюатом, и образующийся тиохром детектируется флуориметрическим методом [1] при соответствующих длинах волн. Массовую концентрацию рибофлавина определяют по площади (высоте) пика при соответствущих ему длинах волн, так как это соединение способно флуоресцировать в нативном состоянии в растворе.

Характеристика погрешности измерений

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220-650 нм), двухходовым смесителем, в котором происходит реакция образования тиохрома из витамина В-1; и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали, длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по тиамину и рибофлавину не ниже 8 000 теоретических тарелок.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения рибофлавина и тиамина под действием света подготовку проб и приготовление их стандартных растворов, а также растворов гексацианоферрата (III) калия проводят в посуде темного стекла, либо, обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1М

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе

40 г винной кислоты растворяют в 800 см3 дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1 000 см3.

3,75 М раствор гидроксида натрия: К 75 г гидроксида натрия добавить 500 см3 дистиллированной воды.

0,04 М раствор гексаноцианоферрата(III) калия: 1,0 г гексаноцианоферрата(III) калия растворить в воде в мерной колбе вместимостью 100 см3 и довести дистиллированной водой до метки.

1,6 10(3)М щелочной раствор гексаноцианоферрата(III) калия

2,0 см3 раствора с содержанием гексаноцианоферрата(III) калия 10 г/1000 мл смешать в мерной колбе вместимостью 50 см3 с 3,75 М раствором гидроксида натрия и довести до метки этим же раствором.

Подвижная фаза для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 500 см3 добавляют примерно 50 см3 дистиллирбванной воды, 60 см3 метанола, 100 мг гептилсульфоната натрия, 10 см3 ледяной уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение витаминов В-1 и В-2

Количественное определение витаминов проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) тиамина с концентрациями в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/см3,

Рибофлавина с концентрациями от 0,02 до 0,100 мкг/мл.

Приготовление градуировочных растворов тиамина

Приготовление стандартного раствора тиамина гидрохлорида с концентрацией тиамина 1000 мкг/см3.

Точную навеску 62,5 мг тиамина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 14200 М(-1) x см(-1) в 0,1 М растворе едкого натра при длине волны 247 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы тиамина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см3 аликвоты 1 см3 приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 см3 и получают раствор с концентрацией 10 мкг/см3. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/см3 (0,1; 0;2# 0,5; 1,0; 2,0 см3) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Приготовление градуировочных растворов рибофлавина

Приготовление стандартного раствора рибофлавина с концентрацией тиамина 100 мкг/см3.

Точную навеску 10,0 мг рибофлавина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют примерно 70 см3 воды и нагревают в течение 20 мин до полного растворения, после охлаждения и доводят объем водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 12500 М(-1) x см(-1) в 0,1М фосфатном буфере (рН = 7,0) при длине волны 255 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы рибофлавина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см3 аликвоты 1 см3 приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 50 см3 и получают раствор с концентрацией 2 мкг/см3. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/см3 (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 см3) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленны по п. 5.1-5.2. Аналитический сигнал (площадь в мм2 или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 375 нм, эмиссии 435 нм для тиамина и при длине волны возбуждения 450 нм, эмиссии - 521 нм (для рибофлавина). Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0-15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах "аналитический сигнал" - "концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/см3". Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5% от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций витаминов. Коэффициент градуировочного графика (k_гр) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых по формуле:

С

                           k  = -----, где

                            i    S

     С  - массовая концентрация витамина в градуировочном растворе,

      i   мкг/см3,

     S  - площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом. Подготовка проб аналогична таковой при определении пиридоксина, поэтому можно использовать один и тот же гидролизат.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2-1,5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 0,1 М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин. При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3-5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 минут, периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3-5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колб# вместимостью 100 см3, добавляют 50 см3 экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помешают на УЗ-баню на 5 мин, доводят экстрагирующей смесью объем до 50 см3 и фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентрации тиамина и рибофлавина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрациями витаминов в растворах для построения градуировочного графика.

Аликвоту фильтрата 0,1 см3 вводили в аналитическую хроматографическую колонку. Витамин В-1 определяли после окисления его в тиохром путем послеколоночной дериватизации 0,06%-ным раствором калия гексацианоферрата (III) в 3 N гидроокиси калия со скоростью подачи реагента 0,1 см3 в течение 5 мин после ввода пробы. Длина волны возбуждения для тиохрома составляла 375 нм, длина волны флуоресценции - 435 нм. Время удерживания витамина В-1 - 4,0-4,5 мин. После 6-й минуты длины волн автоматически переключались для определения витамина В-2. Длина волны возбуждения для рибофлавина (витамина В-2) составляла 450 нм, длина волны флуоресценции - 521 нм. Время удерживания витамина В-2 составляло 10,0-10,3 мин. Идентификацию пиков проводили, сопоставляя времена удерживания с временами удерживания растворов соответствующих стандартов.

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя времена удерживания и спектральное отношение с временами удерживния и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 16).

Таблица 16

Идентификация пиков тиамина рибофлавина

Витамин

Время удерживания, мин

Условия детектирования - 1

Условия детектирования - 2

Соотношение аналитических сигналов

(1:2)

Рибофлавин

10,0-10,3

ламбда_возб = 450 нм

ламбда_эмисс = 521нм

ламбда_возб = 465 нм

ламбда_эмисс = 535 нм

1,12

Тиамин

4,0-4,5

ламбда_возб = 375 нм

ламбда_эмисс = 435 нм

ламбда_возб = 395 нм

ламбда_эмисс = 450 нм

1,01

Концентрацию витаминов в растворе пробы (С_пр, мкг/см3) определяют по формуле:

                          C   = k   х S  , где

                           пр    гр    пр

     S   - площадь (высота) пика витаминов в растворе пробы;

      пр

     к   - коэффициент градуировочного графика.

      гр

Обработка результатов

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 таблетке (драже) (мг):

                      k   х S   х V x k

                       гр    пр        разв

               C   = -----------------------, где

                пр         m х 1000

     S     - площадь (высота) пика витамина в пробе;

      пр

     k     - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V     - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k     - конечное разведение гидролизата;

      разв

     m     - навеска таблеток, взятая на анализ;

     М     - масса таблетки;

     1000  - коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 капсуле (мг):

                        k   х S   х V x k

                         гр    пр        разв

                 C   = -----------------------, где

                  пр         n х 1000

     S     - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

      пр

     k     - коэффициент градуировочного графика;

      гр

     V     - первоначальный объем гидролизата, см3;

     k     - конечное разведение гидролизата;

      разв

     n     - количество капсул, взятых на анализ;

     1000  - коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Производят измерение концентрации тиамина или рибофлавина в гидролизате пробы (С_пр, мкг/см3), а затем с введенной в него добавкой (С_д, мкг/см3), который также анализируют (С', мкг/см3). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация данного витамина в гидролизате увеличилась на 50-150%. Для добавки используют калибровочные растворы.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

                    |С'- С   - С | <= 0,01 x С  x К , где

                          пр    д             д    д

     К  - норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20%);

д

     С  - расчетное значение величины добавки, мкг/см3.

д

Таблица 17

Метрологические характеристики метода

Характеристика	Тиамин	Рибофлавин
Предел обнаружения	0,005 мкг в 1 мл гидролизата	0,006 мкг в 1 мл гидролизата
Воспроизводимость, %	3	3
Правильность, %	98,1	98,7

4. Флуориметрический метод определения рибофлавина (витамин В2) титрованием рибофлавинсвязывающим апобелком

Принцип метода основан на способности рибофлавинсвязывающего апобелка при связывании с рибофлавином полностью тушить его флуоресценцию.

Реактивы и их приготовление

0,1 н. соляная кислота (HCl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 см3 концентрированной (ро = 1,19 г/см3) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 см3.

Стандартный раствор рибофлавина (C17H20N4O6) концентрацией 100 мкг/см3.

5 мг рибофлавина растворяют при нагревании на водяной бане при 70°C в 45 см3 0,1 н. соляной кислоты (раствор 1). После охлаждения объем доводят до 50 см3. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции (прилож. 3). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 мес.

Рабочий стандартный раствор (концентрация рибофлавина 2 мкг/см3).

Перед определением к 1 см3 стандартного раствора добавляют дистиллированную воду в мерной колбе до объема 50 см3.

4 М фосфат калия однозамещенный (К2НРО4).

54,4 г К2НРО4 растворяют в дистиллированной воде, объем доводят до 100 см3.

Рибофлавинсвязывающий апобелок (РбСБ) со связывающей способностью 5-15 мкг рибофлавина на 1 мг белка.

Можно использовать коммерческий препарат (Sigma, США, R 8628) или выделить его из белка куриного яйца по методу, изложенному в прилож. 3.

Средства измерений

Спектрофлуориметр F-2000 (Hitachi, Япония) или аналогичный по оптическим характеристикам

Условия измерения

Интенсивность флуоресценции измеряют в кварцевой кювете объемом 3 см3 с длиной оптического пути 1 см при длине волны возбуждающего света ламбда_возб = 465 нм, испускаемого ламбда_фл = 525 нм.

Приготовление кислотного гидролизата

3 таблетки (драже) или содержимое 3 капсул растирают и тщательно перемешивают в ступке. При расчете массы навески исходят из того, чтобы в 1 см3 гидролизата содержалось не более 5 мкг рибофлавина. К навеске (100-500 мг в зависимости от содержания витамина) добавляют 100 см3 0,1 н. HCl и помещают на кипящую водяную баню на 40 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до 100 см3 и при необходимости фильтруют.

В случае необходимости разводят гидролизат до концентрации рибофлавина около 0,5 мкг/см3 или уменьшают количество гидролизата, взятого на анализ, с таким расчетом, чтобы интенсивность флуоресценции опытной пробы (о - к) была сопоставима с интенсивностью флуоресценции добавленного в пробу стандарта (с - о).

Ход определения

К 0,1 см3 кислотного гидролизата добавляют равный объем 4М К2НРО4 и дистиллированную воду до 3 см3, измеряют флуоресценцию (о), добавляют 0,03 см3 стандартного раствора рибофлавина концентрацией 2 мкг/см3. После перемешивания повторяют измерение (с). Затем добавляют по 0,03 см3 раствора РбСБ, перемешивают, измеряют флуоресценцию после каждой добавки белка. Добавление белка продолжают до тех пор, пока флуоресценция после двух добавок перестает снижаться (к). Разница интенсивности флуоресценции (о - к) пропорциональна количеству рибофлавина в гидролизате. Необходимое количество РбСБ подбирают эмпирически.

Обработка результатов

Содержание рибофлавина в 1 таблетке (мг):

                        (о - к) x 0,06 x V x M

                 C   = ------------------------- , где

                  рб    (c - о) x V  x m х 1000

     0,06 - количество рибофлавина, внесенное в кювету, мкг;

     V    - исходный объем гидролизата, см3;

     М    - масса таблетки БАД, г;

     V    - объем гидролизата, внесенного в пробу, см3;

     m    - навеска измельченных таблеток, взятая на анализ, г;

     1000 - перевод мкг в мг.

Таблица 18

Метрологические характеристики метода

Предел обнаружения	0,03 мкг в 1 мл гидролизата
Воспроизводимость, %	6,4
Правильность, %	97,1
Относительная сходимость, %	18

5. Метод определения аскорбиновой кислоты (витамин С)

Определение витамина С в биологически активных добавках к пище основано на определении непосредственно аскорбиновой кислоты (АК) без учета окисленной формы витамина С - дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК).

Для целей рутинного анализа наиболее легко и доступно определение методом визуального титрования с использованием количественного окисления АК раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Однако этот метод применим только для объектов исследования, дающих светлоокрашенные экстракты. В других случаях используют метод потенциометрического титрования, спектрофотометрические и флуорометрический методы анализа, которые применимы для любых объектов исследования.

Аппаратура, материалы и реактивы

Спектрофотометр с диапазоном измерения от 220 до 1 100 нм или фотоэлектроколориметр с диапазоном измерения от 364 до 2 980 нм с диапазоном измерения коэффициента пропускания от 100 до 1%.

Флуориметр типа "Квант" с набором светофильтров или спектрофлюориметр.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Секундомер 2-го класса или часы 2-го класса.

РН-метр-милливольтметр лабораторный для измерения pH и окислительно-восстановительных потенциалов с диапазонами от минус 1 до плюс 14 мВ и погрешностью не более +-0,05 при измерении pH и диапазонами от минус 100 до плюс 1 400 мВ и погрешностью не более +-5 мВ при измерении окислительно-восстановительных потенциалов. При измерении окислительно-восстановительных потенциалов используют электроды: измерительный - платиновый, вспомогательный - хлорсеребряный.

Термостат с поддержанием заданного режима от 0 до 60°C с погрешностью +-0,8°C.

Термометр жидкостный с диапазоном измерения от 0 до 100°C с ценой деления шкалы 1°C.

Мешалка магнитная с плавным регулированием частоты вращения.

Воронки стеклянные лабораторные типа В по ГОСТ 25336.

Колбы мерные лабораторные стеклянные номинальной вместимостью 50, 100, 500, 1000 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы типа Кн исполнения 2 номинальной вместимостью 50, 100, 250, 750 см3 по ГОСТ 25336.

Микробюретка по ГОСТ 20292 с ценой деления не более 0,01 см3.

Палочки стеклянные.

Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 20292 номинальной вместимостью 1, 2, 5, 10 см3 ценой деления шкалы 0,1 см3.

Стаканы типа В исполнения 1 номинальной вместимостью 50, 100, 400, 1000 см3 по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250 см3 по ГОСТ 1770.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Бумага масштабно-координатная (миллиметровая) по ГОСТ 334.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Кислота азотная по ГОСТ 4461 плотностью 1,41 г/см3, раствор с объемной долей 25%.

Кислота аскорбиновая по ГФ XI изд., растворы массовых концентраций 1,0 и 0,1 г/дм3.

Кислота борная, ч.

Кислота серная о. с. ч. или ч. д. а. (предпочтительней по Савалю).

Кислота соляная плотностью 1,19 г/см3, х. ч., раствор с массовой долей 2%.

Кислота трихлоруксусная, х. ч., раствор с массовой долей 3%.

Кислота фосфорная (мета), ч. по ГОСТ 841, растворы с массовой долей 3 и 6%.

Кислота уксусная ледяная, ч. д. а. или х.ч. по ГОСТ 61, раствор с массовой долей 3%.

Кислота хлорная, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм3. Готовят перед обработкой электродов.

Кислота щавелевая, раствор с массовой долей 2%.

Ксилол.

Натрий 2,6-дихлорфенолиндофенолят, х. ч., Serva

Натрий уксуснокислый, 3-водный, ч. д. а. по ГОСТ 199.

О-Фенилендиамин, раствор 0,2 г/дм3.

Формальдегид, 36-40%-ный раствор.

Уголь активированный.

L-цистеин солянокислый или L-цистеин, 50 мг в 1 см3 2%-ного раствора соляной кислоты.

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) или трилон Б (динатриевая соль этилендиаминa-N,N',N'-тетрауксусной кислоты, 2-водная, ч. д. а.).

Эфир уксусной кислоты бутиловый (бутилацетат), х. ч.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

Хранение растворов по ГОСТ 4212.

Методы отбора проб

Подготовка средней пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Выделение витамина необходимо осуществлять возможно быстрее, без использования повышенной температуры, не на ярком свету и при минимальном контакте образца с кислородом воздуха.

Дражированная форма

Из средней пробы драже отбирают 10-15 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Таблетированная форма

Из средней пробы таблеток отбирают 3-7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Капсулированная форма

Из средней пробы капсул с порошкообразным содержимым отбирают 3-7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки за вычетом массы оболочки, затем содержимое капсул тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Из средней пробы "жировых" капсул отбирают 3-7 шт., взвешивают их, затем осторожно вскрывают, содержимое капсул тщательно перемешивают. Оболочки капсул отмывают органическим растворителем (ацетоном, гексаном и др.), высушивают и взвешивают. Затем высчитывают массу содержимого одной капсулы.

Кристаллические витаминные препараты (субстанции и премиксы)

Пробу витаминных препаратов отбирают в количестве 5-10 г и тщательно перемешивают.

Порошкообразная форма

Среднюю пробу порошкообразных веществ (сухие напитки, сухие молочные смеси и каши для детского питания и т.д.) отбирают в количестве 25-50 г. Перед взятием пробы порошок тщательно перемешивают.

Примечание. При исследовании равномерности перемешивания сыпучих продуктов, расфасованных в порционные упаковки, целесообразно при проведении анализа использовать порционную упаковку исследуемого образца целиком.

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты в количестве 50-100 см3 осторожно, избегая аэрации, перемешивают путем многократного переворачивания склянки, содержащей пробу.

Витаминизированные кондитерские изделия (конфеты, вафли, батончики, бисквиты и др.)

Пробу штучных изделий берут в количестве не менее 100-200 г (в зависимости от содержания витамина), взвешивают, определяют вес единицы изделия, а затем подвергают размельчению и растиранию в ступке.

Подготовка аналитической пробы

Из измельченной и перемешанной пробы берут навеску не менее 0,5-1 г, взвешанную с погрешностью + 0,0001 г. При расчете массы необходимой навески можно пользоваться следующей формулой:

                              10 x V

                                    общ

                         m = --------------, где

                              V   x B

                               пр    заявл

     m      - навеска исследуемого образца, г

     V      - общий объем экстракта, мл

      общ

     V      - объем экстракта, взятого на титрование, мл

      пр

     B      - заявленное содержание АК в исследуемом образце, мг/100 г.

      заявл

Навески жидких проб (витаминизированные соки, напитки и т.п.) отбирают пипеткой. Навески проб густой консистенции (сиропы, концентраты и пр.), плохо стекающие из пипетки, берут весовым путем подобно твердым продуктам. Затем в этих пробах определяют по общим правилам плотность для пересчета содержания витамина на единицу объема.

5.1 Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты

Сущность метода

Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты основано на экстрагировании аскорбиновой кислоты или ее солей раствором кислоты (соляной, щавелевой, трихлоруксусной, метафосфорной или смесью уксусной и метафосфорной) с последующим визуальным титрованием раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски.

Подготовка к выполнению измерения (испытанию)

Выбор экстрагирующего раствора

Таблица 19

Экстрагирующие агенты

Экстрагирующий агент	Область применения
1	2
2% соляная кислота	Дражированные, таблетированные, капсулированные, кристаллические формы БАД, обогащенные продукты питания, без длительного хранения экстрактов. Исключая продукты с высоким содержанием белка
2% щавелевая кислота	То же, но возможно хранение экстрактов в течение 4-5 ч
3% трихлоруксусная кислота	Для всех видов БАД и обогащенных продуктов питания, включая продукты с высоким содержанием белка
Смесь уксусной и метафосфорной кислот	То же
6% метафосфорная кислота	То же, возможно хранение экстракта в течение 4-5 ч

При выборе экстрагирующего агента также следует учитывать влияние мешающих определению компонентов исследуемой матрицы (табл. 20).

Таблица 20

Компоненты, мешающие определению АК

Компоненты, мешающие определению	Устранение влияния мешающих компонентов
Диоксид серы (SO2)	В экстракт добавляют объем ацетона, равный 1/5 части массы навески.
Наличие ионов двухвалентных металлов (Fe(2+), Cu(2+), Sn(2+) и др.)	Экстрагирование проводят смешивая равные объемы 0,18% раствора ЭДТА и 6% раствора метафосфорной кислоты (3% раствора ТХУ).
Высокое содержание жира	Использование в качестве экстрагирующего агента смеси 6% раствора метафосфорной кислоты и ацетона в соотношении 1:3
Жирорастворимые витамины в составе "жировых" капсул	Аналитическую пробу исследуемого БАД перед проведение# экстракции следует предварительно растворить в небольшом объеме органического растворителя (эфир, хлороформ, гексан)
Восстанавливающие сахара (редуктоны)	Обработка экстракта формалином при pH 3,5 приводит к полной дезактивации АК, при pH 0 - редуктонов.
Сульфгидрильные соединения (цистеин, глутатион восстановленный, белки, танин и т.п.)	Обработка экстракта 5% раствором уксуснокислого свинца.
Наличие в исследуемом образце большого количества зерновых	В процессе экстрагирования следует добавить к объекту исследования 2-5 см3 метанола.

Приготовление экстрагирующего раствора

Приготовление водного раствора соляной кислоты массовой концентрации 20 г/дм3 (2%)

47,5 см3 36%-ной соляной кислоты доводят до метки в 1 000 см3 мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3 (3%)

30 г кристаллической трихлоруксусной кислоты доводят до метки в 1 000 см3 мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3

Взвешивают 60,00 г растертой в ступке метафосфорной кислоты на весах 4-го класса точности, растворяют без нагревания в 100-200 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1 000 см3, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Раствор хранят при (6 +- 2)°C не более 7 сут.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3

Необходимый для измерения объем водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3 смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:1. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм3

Взвешивают 1,8 г трилона Б на весах 2 класса точности и растворяют в 100-300 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1 000 см3, доливая дистиллированную воду до метки.

Приготовление смеси водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм3 и раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3 или раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3 (раствор осадителя)

Отмеряют цилиндром 300 см3 водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм3 (или водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм3) и 300 см3 раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм3 в коническую колбу объемом 750 см3 и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление смеси уксусной и метафосфорной кислот

К раствору 15 г метафосфорной кислоты в 200 см3 дистиллированной воды добавляют 40 см3 ледяной уксусной кислоты и доводят дистиллированной водой до 500 см3. Хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение 7 дней.

Приготовление стандартного раствора АК

Растворяют 0,1000 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты, отвечающей требованиям ГФ XI, в мерной колбе емкостью 100 см3 в выбранном экстрагирующем растворе и доводят тем же раствором до метки, 10 см3 полученного раствора АК помещают в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки раствором, используемым в качестве экстрагирующего. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (раствор красителя) и определение его титра

Взвешивают 0,100 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия на весах 2 класса точности, растворяют, тщательно перемешивая, в 250 см3 свежекипяченой дистиллированной воды температурой (90 +- 5)°C содержащей около 50 мг бикарбоната натрия. После охлаждения раствора до (20 +- 5)°C, доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 500 см3, затем фильтруют через складчатый фильтр в склянку из темного стекла. Раствор хранят при (6 +- 2)°C не более 1 месяца.

Определение титра

К 1 мл стандартного раствора АК добавляют 9 см3 выбранного экстрагирующего раствора и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 15-20 с (V_m). Таким же образом титруют 10 см3 экстрагирующего раствора (V_K). Поправку к титру раствора (Т), в мг АК, эквивалентных 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, вычисляют по формуле:

К

                         Т = ----------, где

                              (V  - V )

                                m    k

     К - количество АК в 1 мл стандартного раствора, мг.

Приготовление раствора ацетатного буфера с pH 4,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 см3 дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 100 см3), потенциометрически доводят pH до 4,0.

Приготовление раствора ацетатного буфера с pH 5,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 см3 дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 50 см3), потенциометрически доводят pH до 5,0.

Приготовление 1,0 М раствора соляной кислоты

17,2 мл 36% соляной кислоты разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе емкостью на 200 см3 и доводят до метки дистиллированной водой.

Приготовление 1,0 М раствора ацетата натрия

82,0 г безводного ацетата натрия растворяют в мерной колбе емкостью 1 000 см3 дистиллированной водой и доводят до метки.

Приготовление солянокислого буфера с pH 5,2

К 40 см3 1,0 М раствора соляной кислоты приливают 200 см3 1,0 М раствора ацетата натрия и доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе емкостью 1 000 см3.

Проведение испытания

Экстрагирование

Для приготовления экстракта расчитанную массу навески взвешивают с погрешностью +- 0,0001 г. Затем гомогенизируют ее с небольшим количеством выбранного экстрагирующего агента. После чего полученный гомогенат количественно переносят в мерную колбу или мерный цилиндр объемом V_общ, доводят до метки экстрагирующим агентом, тщательно перемешивают, настаивают 5-10 мин и фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Для жидких пищевых добавок необходимое количество материала отмеривают пипеткой и доводят до метки экстрагирующим агентом в соответствующей мерной колбе.

Визуальное титрование

Для определения АК 1-10 мл экстракта с общим содержанием АК около 0,1 мг вносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50 или 100 см3, доводят объем экстрагентом до 10 см3 и титруют раствором 2,6-дихлор-фенолиндофенолята натрия до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 15-20 с. Аналогично титруют равный объем экстрагирующего агента (контроль на реактивы)*.

Обработка результатов измерения

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки вычисляют по формуле:

                              Т x (V  - V ) x V

                                    m    к     общ

                         X = ----------------------, где

                                  V   х m

                                   пр

     Т  - титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, мг/см3;

     V  - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший  на

      m   титрование исследуемого раствора, см3;

     V  - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший  на

      к   контрольное испытание, см3;

     остальные обозначения см. выше.

Для пищевых добавок, содержащих редуцирующие примеси вместо контроля на реактивы проводят контрольное испытание на присутствие этих примесей. Для этого в колбу помещают такой же объем экстракта, как для определения АК, прибавляют равный ему объем ацетатного буферного раствора с pH 4,0, 36-40%-ный раствор формальдегида в объеме, равном половине объема буферного раствора, перемешивают и выдерживают в течение 10 мин, закрыв предварительно колбу пробкой. Затем содержимое титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений и не менее, чем с двумя различными навесками, различающимися не более, чем на 10%. Чувствительность визуального титрования составляет 5 мкг/см3.

5.2 Определение витамина С в образцах, дающих окрашенные экстракты

Флуориметрический метод определения

Этот метод рассмотрен в "Руководстве по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов", 1998 г.

Метод индофенол-ксилольной экстракции

Этот метод рассмотрен в сборнике научных трудов "Теоретические и клинические аспекты науки о питании" т. VIII, 1987, с. 178-180.

Колориметрический анализ АК в водной среде

Приготовление экстракта и реактивов см. в п. 5.2.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "п. 5.1"

Проведение анализа. Готовят растворы в следующей последовательности (табл. 21).

Таблица 21

Последовательность добавления реагентов в колориметрическом методе

N операции	Реагент	N раствора (колбы)
		1	1*	2	3	3*
		контроль	проба сравнения	стандарт	экстракт	проба сравнения экстракта
1	Ацетатный буфер pH 5,0*	2,5 мл	2,5 мл	2,5 мл	2,5 мл	2,5 мл
2	Экстракт	-	-	-	5 мл	5 мл
3	Стандартный раствор АК	-	-	0,5 мл	-	-
4	Экстрагирующий агент (3% HPO3 или 2% HCl)	5 мл	5 мл	4,5 мл	-	-
5	Дистиллированная вода	-	2 мл	-	-	2 мл
6	Фенолят	2 мл	-	2 мл	2 мл	-

При экстракции 2% HCl на анализ берут по 5 см3 ацетатного буфера.

При большой концентрации АК или интенсивной окраске экстракта берут меньше 5 см3 экстракта, добавляя в растворы N 3 и 3* количество экстрагирующего агента равное 5 см3 минус объем пробы. Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах N 1-3 при ламбда = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 100 г исследуемого образца рассчитывают по формуле:

                          K x (D  - D ) x V    х 100

                                1    3     общ

                     X = ----------------------------, где

                          D    x V   x m

                           1-2    пр

     К    - количество АК  в  0,5  см3  стандартного раствора, взятого на

            определение, мг;

     D    - поглощение фенолята  в  контрольном  растворе  (N 1)  против

      1-2   поглощения фенолята в растворе стандарта (N 2);

     D    - поглощение фенолята   в  контрольном  растворе  N 1  (кювета

      1     сравнения - раствор N 1*);

     D    - поглощение фенолята в растворе экстракта N 3 (кювета сравнения

      3   - раствор N 3*);

     остальные обозначения приведены выше.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух определений

5.3. Спектрофотометрическое определение витамина С в напитках

Проведение анализа

После дегазации и, если необходимо, фильтрования исследуемых напитков готовят три раствора, добавляя реагенты в следующей последовательности (табл. 22).

Таблица 22

Последовательность добавления реагентов при спектрофотометрическом определении витамина С

Реагенты	Раствор N, см3
	1	2	3
	контроль на реактивы	стандарт	исследуемый раствор
Солянокислый буфер (рН 5,2)	5,0	4,5	4,5
Напиток	-	-	0,5
Стандартный раствор аскорбиновой кислоты	-	0,5	-
Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия	1,0	1,0	1,0

Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах N 2-3 при ламбда = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 л напитка рассчитывают по формуле:

                 K x  D  -  x V         K x D    x 1000

                       1-3     общ           1-3

            X = ----------------------- = -----------------, где

                    D    x V                  D    x 0,5

                     1-2    пр                 1-2

     К    - количество АК в  0,5 см3  стандартного  раствора,  взятого на

            определение, мг;

     D    - величина     поглощения   исследуемого  раствора  N 3  против

      1-3   поглощения фенолята в контроле на реактивы;

     V    - общий объем исследуемого напитка, обычно его принимают равным

      общ   1000 см3;

     D    - величина      поглощения  стандартного  раствора  N 2  против

      1-2   поглощения фенолята в контроле на рективы;

     V    - объем     исследуемого          напитка,        взятый    для

      пр    спектрофотометрирования, в данном случае - 0,5 см3.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое двух определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 3% от среднего арифметического.

Чувствительность - 3 мкг АК в пробе.

Для одной партии буфера и одного и того же раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия величину (K/D_1-2), характеризующую качество реактива Тильманса, можно определять один раз в течение одной - двух недель, считая ее постоянной.

5.4. Потенциометрическое титрование

Этот метод описан в "Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов", 1998.

Приложение 1

Некоторые физико-химические свойства витаминов

Аскорбиновая кислота

Белые кристаллы. Устойчива в твердом состоянии. Водные растворы имеют pH 3. Водные растворы устойчивы только в отсутствие кислорода, на воздухе устойчивы при pH 5-6, очень неустойчивы при щелочных pH. Окисление катализируют Сu, Fe. Хорошо растворима в воде - 33,3 г в 100 см3 при комнатной температуре.

Тиаминхлорид гидрохлорид

Белые кристаллы. Гигроскопичен. Устойчив в твердом состоянии на воздухе. Водные растворы при pH > 5 не устойчивы к нагреванию, при pH > 7,0 не устойчивы при комнатной температуре. Хорошо растворим в воде - 100 г в 100 см3 при комнатной температуре.

Рибофлавин

Желтые кристаллы. Сухое твердое вещество устойчиво к рассеянному свету. Чрезвычайно фотолабилен в растворах, особенно щелочных. Нейтральные и кислые водные растворы устойчивы в темноте, за 1 мес. разлагается 3% при 27°C и pH 6,0. Быстро разлагается в щелочных растворах. Мало растворим в воде - 0,01 г в 100 см3 при 25°C и 0,23 г в 100 см3 при 100°C. Растворимость в кислых растворах: в 3%-ной соляной кислоте при 15°C - 0,026%.

Пиридоксингидрохлорид

Белые кристаллы. Устойчив в твердом состоянии на свету. Нейтральные и щелочные растворы фотолабильны. Хорошо растворим в воде - 22 г в 100 см3 при комнатной температуре.

Альфа-токоферол

Светло-желтые масла. Хорошо растворим в этаноле. Медленно окисляется на воздухе, быстро - в присутствии щелочи или при нагревании. Устойчив к действию кислот (до 100°C). Постепенно темнеет на свету, чувствителен к УФ-свету.

Альфа-токоферилацетат

Желтые кристаллы. Эфиры (ацетат и др.) гораздо более устойчивы к свету и кислороду.

Ретинол

Желтые кристаллы. Легко окисляется на воздухе. Разрушается под действием УФ-света. Устойчив в щелочной среде, неустойчив - в кислой. Хорошо растворим в этаноле.

Бета-каротин

Темно-фиолетовые кристаллы. Окисляется на воздухе, фотолабилен. Растворим в этаноле.

Приложение 2

Определение концентрации растворов витаминов, используемых в качестве стандартов

Таблица 23

Коэффициенты молярной экстинкции витаминов для уточнения концентрации стандартных растворов

Витамин	Молекулярная масса	Условия измерения	ламбда, нм	E_1 см
Аскорбиновая кислота	176	вода	265	7000
Аскорбиновая кислота	176	кислота	245	7500
Тиамин	265	0,1 М трис-HCl pH 7,5	267	8300
Рибофлавин	376	0,1 М фосфат pH 7,0	266	32500
Пиридоксин	169	0,05 М фосфат pH 6,8	324	7100
Пиридоксин	169	0,1 M NaOH	308	7000

Таблица 24

Коэффициенты экстинкции 1%-ных растворов витаминов для уточнения концентрации стандартных растворов

Витамин	Условия измерения	ламбда, нм	Е(1%)_1 см
Ретинол	Этанол	325	1832
альфа-Токоферол	Этанол	292	75,8
бета-Каротин	Этанол	453	2650

Таблица 25

Уточнение концентрации стандартных растворов витаминов

Витамин	Молекулярная масса	Объем стандартного раствора, см3	Растворитель	Объем растворителя, см3
Аскорбиновая кислота	176	1,0 (рабочий)	2%-ная HCl	2,0
Тиамин гидрохлорид	337	0,3	0,1 М трис-HCl рН 7,5	2,7
Рибофлавин	376	0,1	0,1 М фосфат pH 7,0	2,9
Пиридоксингидрохлорид	206	0,1	0,05 М фосфат pH 6,8	2,9

Концентрацию стандартного раствора витамина (мкг/см3) рассчитывают по формуле:

                                  D x M x V

                             X = ----------- , где

                                   E x V

     D  - поглощение раствора;

     Е  - коэффициент молярной экстинкции;

     М  - молекулярная масса;

     V  - объем раствора в кювете (3 см3), см3;

     V  - объем стандартного раствора, взятого на анализ, см3.

Приложение 3

Выделение рибофлавинсвязывающего апобелка из белка куриных яиц

Получение препарата рибофлавинсвязывающего апобелка (РбСБ) проводят при комнатной температуре по компилятивной методике Tillotson J.A., Bashor M.M., White Н.В. с небольшими изменениями.

Реактивы и их приготовление

5%-ный водный раствор фенола (С6Н5ОН).

5 г фенола растворяют при постоянном перемешивании в дистиллированной воде, доводят объем до 100 см3. Фенол относится к 2 классу опасности.

0,1 н. соляная кислота (HCl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 см3 концентрированной (ро = 1,19 г/ см3) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 см3.

500 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5).

60,5 г трис(гидроксиметил)аминометана (C4H11NO3) растворяют в 500 см3 дистиллированной воды, доводят pH до 7,5 потенциометрически с помощью 1 н. соляной кислоты (примерно 400 см3). Объем буфера доводят дистиллированной водой до 1000 см3.

50 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5).

Готовят разведением в 10 раз, добавляя к 100 см3 500 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5) дистиллированную воду до 1 000 см3.

0,4 М хлорид натрия (NaCl), приготовленный на 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5).

4,37 г NaCl растворяют в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5), доводят объем до 200 см3.

6 мМ соляная кислота (HCl).

К дистиллированной воде добавляют 0,5 см3 концентрированной (ро = 1,19 г/см3) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 900 см3.

250 мМ Na-ацетатный буфер (рН 3,2).

17 г ацетата натрия (СН3СООКа) растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, доводят потенциометрически pH до 3,2 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/см3), доводят объем дистиллированной водой до объема 500 см3.

25 мМ Na-ацетатный буфер (рН 3,2).

К 100 см3 250 мМ Na-ацетатного буфера (рН 3,2) добавляют дистиллированную воду, доводят объем до 1 000 см3.

25 мМ Na-ацетатный буфер (рН 5,8).

340 мг уксуснокислого натрия (CH3COONa) растворяют в 40 см3 дистиллированной воды, доводят потенциометрически pH до 5,8 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/см3). Доливают дистиллированную воду до объема 100 см3.

Выделение

Белки 2-10 свежих куриных яиц гомогенизируют вручную в гомогенизаторе Поттера (стекло-тефлон) до получения массы однородной вязкости. Добавляют сухой NaCl до концентрации 20% (вес/объем) при постоянном перемешивании механической мешалкой. К полученной суспензии приливают равный объем 5%-ного водного раствора фенола и центрифугируют 10 мин при 1 500 g. С помощью ваты снимают верхнюю пленку. Супернатант желтого цвета диализируют 5 ч против 100 объемов дистиллированной воды (5-8 смен) и в течение ночи против 20 объемов 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), затем центрифугируют.

Надосадочный раствор наносят на колонку (1,2 х 7 см) DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Швеция), предварительно уравновешенную 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5). После нанесения РбСБ виден в виде желтой зоны в верхней части колонки. Колонку промывают буфером нанесения до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не становится ниже 0,010. Флавопротеин элюируют 0,4 М NaCl, приготовленным на 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5). При элюции с колонки собирают визуально видимые ярко окрашенные фракции, содержащие флавопротеин. Фракции флавопротеина в замороженном состоянии при -20°C могут храниться до 6 мес. Полное отделение рибофлавина от флавопротеина можно проводить двумя способами: диализом против 6 мМ НСl до полного обесцвечивания диализата и хроматографией на колонке КМ-целлюлозы. Для этого элюированные с DEAE-Sephadex A-50 фракции флавопротеина диализируют против 20 объемов 25 мМ Na-ацетатного буфера (рН 3,2) с трехкратной заменой диализирующего буфера в течение 16 ч. Затем наносят на колонку (1 х 10 см) КМ-целлюлозы (Reanal, Венгрия), предварительно уравновешенную 25 мМ Na-ацетатным буфером (рН 3,2). После нанесения РбСБ также виден на колонке в виде желтой зоны, так как не весь рибофлавин диссоциирован от РбСБ. Для удаления рибофлавина колонку промывают буфером нанесения до полного исчезновения желтой окраски на колонке и уменьшения экстинкции в элюируемом растворе до величины меньше 0,010 при ламбда = 455 нм. Апопротеин элюируют 25 мМ Na-ацетатным буфером (рН 5,8), измеряя поглощение элюата при 280 нм. Фракции с экстинкцией, превышающей 0,1, собирают. Фракции апопротеина, полученные с помощью диализа или хроматографии диализируют против 100 объемов дистиллированной воды в течение ночи, хранят при - 20°C в течение 12 мес. Из белков двух яиц получают 30-40 мг апобелка. В лиофилизованном состоянии его активность сохраняется в течение нескольких лет. По данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия полученный обоими способами препарат апобелка содержит не менее 80% пептида с кажущейся молекулярной массой около 36 000.

II. Методы определения минеральных веществ

Метод включает подготовку проб и непосредственно проведение количественного определения.

Методы подготовки проб

1.1. Способ сухой минерализации

1.1.1. Способ основан на полном разложении органических веществ путем сжигания пробы в электропечи при контролируемом температурном режиме и предназначен для БАД, кроме содержащих 60% жира и более.

1.1.2. Подготовка к минерализации

Фарфоровые чашки или тигли после обычной мойки дополнительно обрабатывают раствором уксусной кислоты на кипящей водяной бане в течение 1 ч или промывают горячим раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Кварцевые чаши и тигли моют раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной и ополаскивают дистиллированной водой.

В чашу (чашку, тигель) в зависимости от определяемого элемента берут навеску продукта из подготовленной к испытаниям пробы, взвешенную с погрешностью 0,01 г при массе навески до 10 г и с погрешностью 0,1 г при массе навески 10 г и более. Масса навески пробы указана в табл. 1 (более подробно см. ГОСТ 26929-94).

1.1.3. Минерализация проб сырья и пищевых продуктов

1.1.3.1. Навеску средней пробы замачивают в 96% этиловом спирте из расчета 5 см3 спирта на 1 г сухого вещества. Чашки (тигли) с навеской, покрываются часовыми стеклами или чашками Петри, выдерживают при комнатной температуре в течение 12-48 ч.

1.1.3.2. Чашки переносят на электроплитку, осторожно высушивают и, постепенно увеличивая нагрев, выдерживают на плитке до начала обугливания.

1.1.3.3. БАД с высоким содержанием сахаров перед обугливанием обрабатывают 20%-ным раствором серной кислоты из расчета 5 см3 кислоты на 1 г сухого вещества. Далее - по п. 1.1.3.2.

1.1.3.4. Чашки с высушенными пробами помещают в холодную электропечь. Минерализацию проб проводят постепенно, повышая температуру электропечи на 50°C через каждые 30 мин и доводя ее до 450°C - продолжают минерализацию при этих условиях до получения серой золы.

Чашу с золой вынимают из электропечи, охлаждают до комнатной температуры и серую золу смачивают водой и 0,5-1 см3 раствора азотной кислоты (1:1). Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь, постепенно доводя температуру до 300°C, и выдерживают 0,5 ч. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета, без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку золы раствором азотной кислоты или водой, снова доозоляют.

1.1.4. Полученную золу растворяют при нагревании в азотной кислоте (1:1) из расчета 1-5 см3 кислоты на навеску в зависимости от зольности продукта. Раствор выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1%-ной азотной или соляной кислоте до объема 15-20 см3.

1.1.5. При неполном растворении золы полученной по п. 1.1.4 азотнокислый раствор с осадком упаривают досуха и перерастворяют в минимальном объеме (5-10 см3) соляной кислоты (1:1), снова упаривают до влажных солей. Полученные соли растворяют в 1% соляной кислоте до объема 15-20 см3.

1.1.6. Если растворы золы, полученные по п. 1.1.4 или 1.1.5 содержат нерастворимый осадок, объем растворителя можно довести до 25-30 см3, пробу подогреть до растворения. Если и в этом случае полного растворения не наблюдается, раствор отфильтровывают через промытый растворителем фильтр и осадок отбрасывают.

1.2. Способ мокрой минерализации

1.2.1. Способ основан на полном разрушении органических веществ пробы при нагревании с серной и азотной концентрированными кислотами с добавлением перекиси водорода и предназначен для всех видов БАД, кроме содержащих сливочное масло и животные жиры.

1.2.2. Подготовка к минерализации

1.2.2.1. Стеклянную посуду после обычной мойки дополнительно промывают раствором азотной кислоты, ополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой.

1.2.2.2. Навеску жидких и пюреобразных БАД по п. 1.2.2 взвешивают в стакане, переносят в колбу Кьельдаля или плоскодонную колбу, стараясь не попасть на стенки колбы.

1.2.2.3. Навеску БАД по п. 1.2.2 берут на обеззоленный фильтр, заворачивают в него и стеклянной палочкой помещают на дно колбы Кьельдаля или плоскодонной колбы.

1.2.2.4. Навеску сухих БАД (желатиноподобных) помещают в колбу Кьельдаля, добавляют 15 см3 воды, перемешивают. Желатин затем оставляют на 1 ч для набухания.

1.2.3. Минерализация проб сырья и продуктов

1.2.3.1. Кислотная минерализация проб сырья и продуктов, кроме растительного масла, маргарина, пищевых жиров

В колбу с пробой БАД, подготовленной к минерализации по п. 1.2.2, вносят азотную кислоту из расчета 10 см3 на каждые 5 г продукта и выдерживают не менее 15 мин. Затем в колбу вносят 2-3 стеклянных шарика для равномерности кипения, закрывают грушевидной пробкой и начинают нагревать на электроплитке слабо, затем сильнее, упаривая содержимое колбы до объема 3-5 см3.

Колбу охлаждают, вносят 10 см3 азотной кислоты, содержимое упаривают до объема 5 см3, после чего охлаждают. Эту процедуру повторяют 2-4 раза.

В колбу вносят 10 см3 азотной кислоты, 2 см3 серной кислоты, 2 см3 перекиси водорода из расчета на каждые 5 г образца. Минерализацию БАД на молочной основе проводят без добавления серной кислоты. Содержимое колбы упаривают до объема 5 см3, не допуская образования коричневой окраски жидкости. При появлении коричневой окраски нагревание прекращают.

Колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 см3 азотной кислоты и 2 см3 перекиси водорода и снова нагревают до появления белых паров серного ангидрида. Если при этом раствор не обесцветился, эту процедуру повторяют. Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным.

Для удаления остатков кислот в охлажденную колбу добавляют 10 см3 воды и кипятят 10 мин с момента выделения белых паров, затем охлаждают. Добавление воды и нагревание повторяют еще 2 раза.

Если при этом образуется осадок, в колбу вносят 20 см3 дистиллированной воды, 2 см3 серной кислоты, 5 см3 соляной кислоты и кипятят до растворения осадка, постоянно дополняя испаряющуюся воду. Полученный минерализат после охлаждения используют для анализа полностью или количественно переносят водой в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят до метки водой и перемешивают.

1.2.3.2. Кислотная минерализация проб с высоким содержанием жира

Исследуемую пробу в колбе Кьельдаля, подготовленную к минерализации по п. 1.2.2, нагревают на электроплитке 7-8 ч до образования вязкой массы, охлаждают, добавляют 25 см3 азотной кислоты и вновь осторожно нагревают, избегая бурного вспенивания. После прекращения вспенивания колбу с содержимым охлаждают, добавляют еще 25 см3 азотной кислоты и 12 см3 хлорной кислоты и нагревают до получения бесцветной жидкости. Если во время сжигания жидкость темнеет, то к ней добавляют периодически по 5 см3 азотной кислоты и продолжают нагревание до завершения минерализации. Минерализации.# Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным. Затем продолжают процедуру по п. 1.2.3.1.

1.3. Способ кислотной экстракции (неполной минерализации)

1.3.1. Способ основан на экстракции элементов из пробы продукта кипячением с разбавленной соляной или азотной кислотой и предназначен для жиросодержащих БАД

1.3.2. Экстракция и подготовка экстрактов к анализу

1.3.2.1. Экстракция проб БАД

В термостойкую колбу с навеской образца, отобранного по п. 1.2.2, вносят цилиндром 40 см3 раствора соляной кислоты (1:1) и такой же объем раствора азотной кислоты (1:2).

В колбу добавляют несколько стеклянных шариков, вставляют в нее холодильник, помещают на электроплитку, покрытую асбестом, и кипятят в течение 1,5 ч с момента закипания. Затем содержимое колбы медленно охлаждают до комнатной температуры, не вынимая холодильника.

В колбу с экстракционной смесью жиросодержащих БАД с кислотой помещают в холодную водяную баню для затвердевания жира. Затвердевший жир прокалывают стеклянной палочкой, фильтруют через фильтр, смоченный кислотой, затем промывают фильтр 5-7 см3 дистиллированной водой. Оставшийся в колбе жир расплавляют на водяной бане, добавляют 10 см3 раствора кислоты, встряхивают, охлаждают, после охлаждения жир прокалывают и промывную жидкость сливают в тот же сосуд через тот же фильтр, затем фильтр промывают 5-7 см3 дистиллированной воды.

Экстракционную смесь масла с кислотой переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают 10 см3 кислоты, которую сливают в ту же воронку. После разделения слоев нижний водный слой сливают через фильтр, смоченный кислотой, в кварцевую или фарфоровую чашку, затем фильтр промывают 5-7 см3 дистиллированной воды.

Чашу с экстракционной смесью осторожно выпаривают и обугливают на электроплитке. Затем помещают в электропечь и озоляют до исчезновения обугленных частиц.

1. Атомно-абсорбционный метод определения содержания натрия, калия, кальция, магния, железа, марганца, меди, цинка, свинца, кадмия, кобальта, никеля, хрома

Сущность метода

Метод основан на распылении раствора минерализата испытуемой пробы в воздушно-ацетиленовом пламени. Металлы, находящиеся в растворе минерализата, попадая в пламя, переходят в атомное состояние. Величина адсорбции света с длиной волны соответствующей резонансной линии, пропорциональна значению концентрации металла в испытуемой пробе.

Контрольный (холостой) опыт

При проведении деструкции проб любым способом обязательно проведение контрольного (холостого) опыта для учета уровня загрязнений, которые могут возникнуть на любой стадии подготовки проб. В каждой подготавливаемой серии проб контрольный тигель (чашка, стакан и пр.) обязательно проводят через все стадии подготовки вместе с тиглями, содержащими навески БАД, при одинаковом времени нахождения на электроплитке, в муфеле, при использовании тех же реактивов в том же количестве, той же мерной посуды и т. д. Полученный в холостом опыте раствор анализируют в той же серии измерений, что и растворы проб. Если пробы БАД обычно анализируют в двух повторностях, то контрольный опыт также целесообразно проводить в двух повторностях.

Подготовка к испытанию

Приготовление растворов

Определение содержания элементов в испытуемых растворах проводят методом градуировочного графика, который строится по значениям сигналов абсорбции растворов сравнения.

Головные стандартные растворы (эталоны) готовят из чистых металлов (более 99,9%) или чистых (х. ч., ос. ч.) устойчивых соединений элементов при использовании растворителей, обеспечивающих устойчивость растворов при хранении (допускается использование коммерческих растворов). Концентрация металла в головном растворе должна быть равна 1 г/дм3 (1 000 мкг/см3) (табл. 26). Срок их хранения обычно не превышает 2-3 лет, если растворы хранятся в герметичной посуде из стекла твердых сортов, полиэтилена высокой плотности, полистирола, кварца, т.е. материалов, наименее склонных к ионному обмену и абсорбции. Разбавленные растворы с концентрацией порядка 100 мкг/см3 обычно могут храниться до 1 мес, с концентрацией 10 мкг/см3 - 2-3 дня. Необходимо избегать применения резиновых пробок, которые могут быть источником загрязнения для ряда микроэлементов, а также избегать хранения растворов в местах, куда попадает прямой солнечный свет. Для приготовления головных стандартных растворов не рекомендуется использовать кристаллогидраты, которые могут не отвечать предполагаемому составу, и нестойкие реактивы, например перманганат калия.

Стандартные растворы сравнения (рабочие эталоны) готовят путем разбавления головных стандартных растворов до концентрации, которая должна соответствовать рабочему диапазону концентраций и быть близка к концентрации элемента в анализируемом растворе. Разбавление производят тем же бланковым раствором, который применяется для приготовления анализируемых растворов проб.

Обычно для построения градуировочного графика в области рабочих концентраций достаточно 3-5 растворов сравнения, при работе в линейной области - 2 раствора. При большой и особенно знакопеременной кривизне градуировочного графика необходимо увеличивать число стандартных растворов сравнения или ограничивать область рабочих концентраций более узким диапазоном (табл. 27).

Приготовление растворов и проб к испытанию

Раствор золы может анализироваться непосредственно или после дополнительной подготовки, которая необходима в следующих случаях.

а) Концентрация элемента в растворе значительно превышает верхний предел интервала рабочих концентраций. Производят разбавление исходного раствора бланковым раствором до необходимого уровня концентрации.

б) Концентрация элемента в исходном растворе ниже предела его обнаружения. Если необходима количественная, а не односторонняя ("не более"...) оценка, производят концентрирование элемента методом экстракции. Экстракция применяют также при определении микроэлементов на приборах, которые не имеют автоматической коррекции неселективного поглощения.

Для проведения экстракции рассматриваемых элементов могут быть применены разнообразные экстракционные системы, в частности, система диэтилдитиокарбамат натрия (или аммония) - n-бутилацетат (или метилизобутилкетон). Эти системы при регулировании pH позволяют провести экстракцию железа, цинка, меди, марганца, кадмия, свинца, кобальта, никеля и хрома.

Подготовка спектрофотометра к работе и условия измерения

Юстировку прибора проводят в соответствии с технической инструкцией завода (фирмы)-изготовителя. Рекомендуемые условия измерений, а также значения предела определения по данным авторов методики приведены в табл. 27.

Альтернативные длины волн резонансных линий натрия и калия, указанные в табл. 27, могут использоваться для определения в разных областях концентраций, если позволяют технические характеристики лампы и прибора. Для свинца и хрома измерение на указанных альтернативных линиях может отличаться не только чувствительностью, но и отношением сигнал/шум, скоростью дрейфа сигнала. Поэтому выбор резонансной линии в этих случаях проводится для каждого прибора после предварительных сравнительных испытаний.

Указанные в табл. 27 номинальные значения ширины щели монохроматора отвечают отсутствию перекрывания резонансной полосы поглощения с соседними линиями спектра. Тем не менее настройку монохроматора по максимуму излучения источника рекомендуется проводить при минимально возможной щели. Измерения абсорбции таких элементов, как железо, свинец, кадмий, кобальт, никель и хром, при концентрациях, близких к пределу обнаружения, могут проводиться при максимальной щели монохроматора, если для данного прибора это дает улучшение отношения сигнал/шум.

Таблица 26

Рекомендуемые способы приготовления головных стандартных растворов, концентрация металла - 1000 мкг/см3

Элемент	Исходный реактив, навеска, г	Схема приготовления головного стандартного раствора объемом 1000 см3	Концентрация кислоты в конечном растворе
1	2	3	4
Натрий	NaCl, прокаленный при 500°C, 2,542 г	+ Н2О + HCl	0,02 н. HCl
Калий	КС1, прокаленный при 500°C, 1,907 г	+ Н2О + HCl	0,02 н. HCl
Кальций	СаСОз, высушенный при 110°C, 2,497 г	+ HCl (2 н), нагрев + Н2О
Магний	Металл, 1,000 г	+ 100 см3 разбавленной (1:100) HCl, осторожно, по каплям (!) + Н2О
Магний	MgO, прокаленный при 500°C, 1,658 г	+ 25 см3 HCl (25%) + Н2О
Железо	Металл, 1,000 г	+ 20 см3 HCl (5 н) + 5 см3 концентрированной HNO3 (окисление до Fe(3+)) + Н2О	0,1 н. HCl
Цинк	Металл, 1,000 г	+ HCl (1:1) + Н2О	1 н. HCl
Цинк	ZnO, 1,245 г	+ HNO3 (40%) + Н2О	0,1 н. HNO3
Медь	Металл, 1,000 г	+ 50 см3 НNO3 (5 н), упарить досуха на водяной бане + 5 см3 HCl, упарить досуха + разбавленную HCl + Н2О	0,1 н. HCl
Марганец	Металл, 1,000 г	+ 10 см3 HNO3 упаривают досуха на водяной бане + 5 см3 концентрированной HCl, упарить досуха + несколько капель концентрированной HCl + Н2О	0,02 н. HCl
Свинец	Металл, 1,000 г	+ минимальный объем HNO3 (6 н.) + Н2О + HCl	1 н. HCl
Свинец	Pb(NO3)2, высушенный при 110°C, 1,599 г	+ разбавленную HNO3 (1:100)	1% HNO3
Кадмий	Металл, 1,000 г	+ разбавленная HNO3, упарить досуха и выдержать при 80-90°C на водяной бане, добавить 5 см3 HCl (1 н.), упарить досуха + разбавленную HCl + Н2О	1 н. HCl
Кадмий	CdO, 1,142 г	+ 20 см3 HCl (5 н.) +Н2О + HCl	1 н. HCl
Кобальт	Металл, 1,000 г	+ минимальный объем HNO3, упарить досуха, растворить в разбавленной HCl + Н2О	1 н. HCl
Никель	Металл, 1,000 г	+ минимальный объем HNO3, упарить досуха на водяной бане + 5 см3 HCl, упарить досуха + Н2О + HCl	0,1 н. HCl
Хром	Металл, 1,000 г, или	+ HCl + Н2О	1 н. HCl
Хром	К2Cr2О7, высушенный при 150°C, 2,830 г	+ разбавленная HCl + Н2О	0,02 н. HCl

Таблица 27

Условия атомно-абсорбционных измерений в воздушно-ацетиленовом пламени

Элемент	Длина волны, нм	Щель, нм	Пламя	Высота горелки, мм	Оптимальный диапазон рабочих концентраций, мкг/см3	Предел определения мкг/см3
1	2	3	4	5	6	7
Натрий	330,2	3,0	Окислительное	7-8	10-100	1
	589,6	0,4		7-8	2-30	0,1
	589,0	0,4		7-8	0,5-5	0,005
Калий	404,5	0,4	Стехиометрическое	7-8	50-1000	8
	769,9	1,5		7-8	5-50	0,5
	766,5	1,5		7-8	0,5-10	0,005
Магний	285,2	3,0	Окислительное	10-15	0,1-10	0,001
Кальций	422,7	3,0	Окислительное	15-20	5-30	0,01
Железо	248,3	0,2	Стехиометрическое	7-8	1-10	0,01
Цинк	213,9	1,5	Окислительное	6-7	1-10	0,002
Медь	324,8	1,5	Стехиометрическое	7-8	0,005-5	0,003
Марганец	279,5	0,7		7-8	0,1-2	0,003
Свинец	283,3	2,0		7-8	0,1-2	0,02
Свинец	217,0	2,0		7-8	0,1-2	0,01
Кадмий	228,8	1,0	Окислительное	6-7	0,02-1	0,001
Кобальт	240,7	0,2	Стехиометрическое	6-7	0,05-2	0,01
Никель	232,1	0,2	Стехиометрическое	6-7	0,1-5	0,01
Хром	357,9	1,3	Восстановительное	6-7	0,1-5	0,005
Хром	359,4	1,3	Восстановительное	6-7	0,05-5	0,005

Три вида воздушно-ацетиленового пламени, указанные в табл.

<< Глава 1. Методы определения макронутриентов		Глава 3. >> Минорные биологически активные компоненты БАД (методы определения подлинности БАД
	Содержание Руководство Р 4.1.1672-03 "Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище" (утв....

Глава 2. Методы определения микронутриентов

ГАРАНТ:

Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.