Методические указания МУК 4.2.999-00 "Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ - Первым заместителем Министра здравоохранения РФ 8 ноября 2000 г.)

Методические указания МУК 4.2.999-00
"Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ - Первым заместителем Министра здравоохранения РФ 8 ноября 2000 г.)

Дата введения: 8 февраля 2001 г.

Введены впервые

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методику проведения лабораторных исследований (испытаний) по определению количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах.

1.2. Методические указания разработаны в соответствии с федеральным законом "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.

1.3. Методические указания предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности (далее - организации), осуществляющих производственный контроль качества при разработке, постановке на производство и в процессе промышленного выпуска кисломолочных продуктов; в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологических служб федеральных органов исполнительной власти, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения испытаний указанной продукции.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2. Закон РФ "О защите прав потребителей" от 07.02.92.

2.3. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.4. "Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации", утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.5. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов".

ГАРАНТ:

В соответствии с приказом Росстандарта от 30 ноября 2010 г. N 596-ст. ГОСТ 26668-85 не применяется на территории РФ с 1 января 2012 г. и введен в действие ГОСТ Р 54004-2010

2.6. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка к испытаниям".

2.7. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".

ГАРАНТ:

Приказом Ростехрегулирования от 27 ноября 2009 г. N 520-ст ГОСТ 9225-84 не применяется на территории РФ с 1 января 2011 г. и введен в действие ГОСТ Р 53430-2009 "Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа"

3. Методы отбора проб

3.1. Отбор проб - по ГОСТу 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка к испытанию", ГОСТу 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа", ГОСТу 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов".

3.2. Для анализа отбирают 3 единицы потребительской упаковки методом случайной выборки.

3.3. Посуду с пробой или пробу в потребительской таре снабжают этикеткой, на которой указывают:

- номер пробы;

- наименование продукта;

- номер и объем партии;

- дату и час отбора пробы;

- должность и подпись лица, отбиравшего пробу;

- обозначение действующей нормативной документации, по которой вырабатывался продукт.

3.4. Пробу, отправляемую в лабораторию вне данного предприятия, пломбируют или опечатывают и снабжают этикеткой, на которой указывают:

- номер пробы;

- наименование предприятия-изготовителя;

- наименование продукта;

- номер и объем партии;

- дату и час выработки продукта с момента окончания технологического процесса;

- дату и час отбора пробы;

- должность и подпись лица отбиравшего пробу;

- объем необходимых анализов;

- обозначение действующей нормативной документации, по которой вырабатывался продукт;

- должность и подпись должностного лица предприятия, на котором осуществляется контроль продукта.

3.5. Микробиологические анализы продукта проводят не более, чем через 4 часа с момента отбора проб.

3.6. Пробы должны храниться и транспортироваться до начала исследований при температуре продуктов не выше 6 °С, не допуская подмораживания.

3.7. При оценке количества бифидобактерий специалистами центра Госсанэпиднадзора и других организаций, упомянутых в п. 1.3 настоящих методических указаний, отбор проб производится в присутствии должностного лица предприятия, на котором осуществляется контроль продукта.

4. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда и реактивы

4.1. Средства измерения

Весы лабораторные общего назначения, 2-го и 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г (или получаемые по импорту)

ГОСТ 24104-80Е

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания", утвержденный приказом Ростехрегулирования от 25 декабря 2008 г. N 739-ст

Иономер универсальный ЭВ-74 или потенциометр рН-340		ГОСТ 9245-79
Колбы исполнения 2,2-го класса точности, номинальной вместимостью 50, 100, 200, 500, 1000 (см3)		ГОСТ 1770-74Е
Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3 (или полученный по импорту с иммерсионной системой)		ГОСТ 8284-78
Пипетки исполнения 5, 1, 2-го классов точности, вместимостью 1 см3		ГОСТ 29227-91
Термометр (ртутный) с диапазоном измерения от 0 до 100°С, с ценой деления шкалы 1°С		ГОСТ 13646-68
Термометр жидкостный (нертутный) с диапазоном измерения от 0 до 100°С, с ценой деления шкалы 1°С		ГОСТ 28498-90
Цилиндры исполнения 1, вместимостью 100, 500 (см3)		ГОСТ 1770-74Е
Часы механические сигнальные		ГОСТ 3145-84
Часы песочные настольные на 1,5 и 10 мин

4.2. Вспомогательное оборудование

Аппарат универсальный типа АВУ-6С для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (шуттель-аппарат)		ТУ 64-1-2451-78
Баня водяная		ТУ 46-22-608-75
Микрокалькулятор типа "Электроника БЭ-0914М", "БЭ-14", "БЭ-21" или др. типов		ГОСТ 27201-87
Ножницы медицинские		ГОСТ 21239-89
Облучатель бактерицидный настенный
ОБН-150 или других видов		ТУ 16-535-84
Осветители к микроскопу типа ОИ-7, ОИ-9, ОИ-18, ОИ-19 или других марок
Пинцет медицинский		ГОСТ 21241-89
Скальпель хирургический, 15 см		ГОСТ 21240-89
Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные		ГОСТ 19569-89
Стерилизаторы медицинские паровые и воздушные		ГОСТ 27437-87
Термостат, позволяющий поддерживать температуру (15-65)°С с отклонением от заданной 1°С		ТУ 64-1-1382-72
Холодильник бытовой электрический		ГОСТ 16317-87
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80 П или др. видов, позволяющий поддерживать температуру (160 +- 5)°С		ТУ 64-1-9009-74
Шпатели металлические или фарфоровые 15-20 см
Штативы металлические, пластмассовые или деревянные
Электроплитка		ГОСТ 14919-83

4.3. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная		ГОСТ 12026-76
Бутылки стеклянные для химических реактивов		ГОСТ 15844-92
Вата медицинская гигроскопическая		ГОСТ 5556-81
Воронки стеклянные		ГОСТ 25336-82
Карандаш по стеклу
Кастрюли эмалированные		ГОСТ 24778-81
Марля медицинская		ГОСТ 9412-77
Палочки стеклянные
Пергамент		ГОСТ 1341-84

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 1341-84 постановлением Госстандарта РФ от 13 октября 1997 г. N 349 с 1 января 1998 г. введен в действие ГОСТ 1341-97

Петли бактериологические
Пробирки типов П1, П2, диаметром 16 мм, высотой 150 мм и диаметром 21 мм, 200 мм		ГОСТ 25336-82
Спиртовки лабораторные стеклянные		ГОСТ 23932-90
Стаканы типа ВН, вместимостью 100 и 200 (см3)		ГОСТ 19908-90
Стекла предметные для микропрепаратов		ГОСТ 6672-75
Сумки-холодильники
Чашки биологические (Петри)		ГОСТ 23932-90
Шпагат		ГОСТ 16266-70

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 16266-70 постановлением Госкомстата СССР от 25 марта 1988 г. N 731 с 1 июля 1989 г. введен в действие ГОСТ 17308-88

4.4. Реактивы, питательные среды

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-84

ГАРАНТ:

Постановлением Госстандарта России от 13 августа 1997 г. N 274 взамен ГОСТ 17206-84 с 1 января 1998 г. введен в действие ГОСТ 17206-96 "Агар микробиологический. Технические условия" с правом досрочного введения для применения в РФ

Бромтимоловый синий		ТУ 6-09-20-86-77
Вода дистиллированная		ГОСТ 6709-72
Вода питьевая		ГОСТ 51232-98
Глюкоза, ч.		ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная		ТУ 6-09-22-98-79
Калий двухромовокислый (бихромат калия)		ГОСТ 4220-75
Калия гидроксид (гидроокись)		ГОСТ 4328-77
Калий фосфорно-кислый двузамещенный 3-водный		ГОСТ 2493-75
Кислота аскорбиновая		Государственная Фармакопея издание X, стр.43
Кислота молочная пищевая		ГОСТ 490-79

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 490-79 приказом Ростехрегулирования от 21 ноября 2006 г. N 259-ст с 1 ноября 2007 г. введен в действие ГОСТ 490-2006

Кислота серная, ч.		ГОСТ 4204-77
Кислота соляная, х. ч.		ГОСТ 3118-77
L-цистин соляно-кислый или цистин соля-но-кислый, получаемый по импорту		ТУ 6-093252-80
Магний серно-кислый, 7-водный		ГОСТ 4165-78
Метиленовый голубой, индикатор, получаемый по импорту
Натрия гидрокарбонат		ГОСТ 4201-79
Натрия гидроокись, ч. д. а. (натрий гидроксид)		ГОСТ 4328-77
Натрий лимонно-кислый трехзамещенный		ГОСТ 22280-87
Натрий хлористый (натрий хлорид), ч. или х. ч., или ч.д. а.		ГОСТ 4233-77
Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей		ГОСТ 13805-76
Печеночный отвар
Спирт этиловый ректификованный технический		ГОСТ 18300-87
Среда кукурузно-лактозная (ГМК-1) для количественного учета бифидобактерий		ТУ 10-02-02-789-176-94
Экстракт кукурузы сгущенный		ТУ 10-04.08.14-88
Эфир для наркоза		рег. N 64/228/321

5. Подготовка к анализу

5.1. Подготовка проб к анализу

5.1.1. Перед вскрытием поверхность упаковки продукта обмывается, протирается, чтобы удалить грязь, которая может загрязнить продукт. Затем поверхность упаковки протирается 70%-ным этиловым спиртом. Вскрытие упаковхи производится в асептических условиях.

5.1.2. Продукт в вскрытых упаковках тщательно перемешивается.

5.1.3. Каждую отобранную пробу (упаковку) анализируют отдельно.

5.1.4. Из каждой упаковки после тщательного перемешивания пипеткой отбирается 10 см3 кисломолочного продукта, помещается в стерильную посуду и затем нейтрализуется. Для этого на 10 см3 исследуемого продукта в стерильную посуду добавляется 1,0 см3 стерильного раствора натрия гидрокарбоната с массовой концентрацией 100 г/дм3; содержимое перемешивается с использованием стерильных приспособлений или шуттель-аппарата.

5.1.5. К нейтрализованному образцу продукта добавляется физиологический раствор до достижения общего объема пробы 100 см3, после чего смесь опять тщательно перемешивают. Таким образом получают первое разведение продукта (1 х 10(-1)). Пипетку промывают до 10 раз полученной смесью до верхнего уровня имеющихся на ней делений.

5.1.6. Последующие десятикратные разведения продукта готовят, добавляя в 9 см3 физиологического раствора по 1 см3 предыдущего разведения продукта. При этом смесь каждый раз тщательно перемешивают. Таким образом, в седьмой пробирке продукт будет разведен в 10(8) раз. Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку.

5.2. Подготовка посуды и материалов

5.2.1. Всю новую посуду, предназначенную для контроля количества бифидобактерий, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты с объемной долей 1-2%) в течение (15 +- 5) мин и затем ополаскивают дистиллированной водой.

Посуду, бывшую в употреблении, моют 0,5%-ным щелочным раствором с помощью ершей и щеток и ополаскивают водопроводной водой. Сильно загрязненную посуду со следами жира, красок и иммерсионного масла опускают на 2 часа в хромовую смесь, подогретую до 40-45°С, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой.

Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или горячим воздухом.

Предметные стекла после мойки и ополаскивания вытирают чистой салфеткой или помещают в склянку с притертой пробкой в смесь этилового спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1.

5.2.2. Лабораторную посуду перед использованием обязательно стерилизуют. Стерилизацию осуществляют сухим жаром в сушильном шкафу при (160 +- 5)°С в течение 2 ч или паром в стерилизаторе при 1 атм (121 +- 1)°С в течение (30 +- 1) мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу. Перевод давления, показываемого монометром стерилизатора, в значение температуры проводится следующим образом:

0,5 атм - 112°С

0,7 атм - 116°С

0,8 атм - 118°С

1,0 атм - 121°С

2,0 атм - 134°С

Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновым колечком.

Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют отдельно завернутыми в бумагу.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды - не более 30 суток при ненарушенной завертке или невскрытых пеналах.

6. Приготовление питательных сред и реактивов

6.1. Изотонический (физиологический) 0,85%-ный раствор хлористого натрия. Для приготовления изотонического раствора активной кислотностью (7,0 +-0,1) ед рН используют дистиллированную воду, рН которой проверяют индикатором бромтимоловый синий. При его добавлении цвет воды должен быть бутылочно-зеленым. В иных случаях воду не используют.

В 1,0 дм3 воды растворяют 8,5 г натрия хлорида, разливают раствор в чистые пробирки диаметром 18-20 мм по 10,0 см3, а в колбы - по 93,0 см3 и стерилизуют в течение (15 +- 1) мин при (121 +- 1)°С.

6.2. Раствор натрия гидрокарбоната для нейтрализации

10 г натрия гидрокарбоната помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют дистиллированной водой, доводят объем раствора до метки. Раствор разливают в пробирки и стерилизуют при (121 +- 1)°С в течение (30 +- 1) мин.

6.3. Приготовление реактивов из метиленового голубого

Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого. 10 г метиленового голубого смешивают со 100 см3 96%-ного этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре (37 +- 1)°С на (24 +- 1) ч, а затем фильтруют в термостате при той же температуре.

Срок хранения основного раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37 + 1)°С - не более 3-х месяцев при условии герметичной укупорки.

Приготовление рабочего раствора метиленового голубого

Основной раствор помещают в водяную баню при температуре (45 +- 1)°С на (8 +- 2) мин, перемешивают до полного растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры (20 +- 1)°С и 5,0 см3 этого раствора прибавляют к 195,0 см3 дистиллированной кипяченой воды. Смесь хорошо перемешивают.

Срок хранения рабочего раствора метиленового голубого - не более 7 суток при температуре от 8 до 10°С.

Приготовление раствора метиленового голубого для окраски препаратов

К 30,0 см3 основного спиртового раствора метиленового голубого прибавляют 100,0 см3 дистиллированной воды и 1,0 см3 раствора калия гидроксида с массовой концентрацией 10 г/дм3.

6.4. Модифицированная печеночная среда Блаурокка

0,5 кг свежей говяжьей печени очистить от пленок и протоков, измельчить, залить 1 дм3 дистиллированной воды и кипятить в течение 1,5-2 ч. Отвар профильтровать, довести до 1 дм3. Добавить на 1 дм3: натрия хлорида - 5,0 г, пептона - 10,0 г; установить активную кислотность (8,15 +-0,5) ед рН с помощью 10%-ного раствора натрия гидроксида. Кипятить 10 мин. Стерилизовать при (121 +- 1)°С (15 +- 1) мин и при (112 +- 1)°С (30 +- 1) мин. На следующий день печеночный бульон декантировать, долить дистиллированной водой до 1 дм3. Внести на 1 дм3 бульона: глюкозу - 5,0 г, агар-агар - 0,8 г, цистеин - 0,3 г. Кипятить 10 мин, довести до (7,7 +-0,1) ед рН. Разлить в пробирки по 10 см3 и стерилизовать при (121 +- 1)°С в течение (15 +- 1) мин и при (112 +- 1)°С (20 +- 1) мин.

Среду проверяют на стерильность путем выдержки при температуре (37 +- 1)°С в течение 2-х суток.

Хранят среду не более одного месяца при температуре (20 +- 2)°С и не более 2-х месяцев при температуре (4 +- 2)°С.

Ростовые качества каждой серии среды Блаурокка контролируют высевом лиофилизированной биомассы бифидобактерий.

6.5. Кукурузно-лактозная среда (плотная)

В небольшом объеме дистиллированной воды расплавляют агар в количест