Методические указания МУК 4.1.769-99 "Количественное определение формальдегида в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Методические указания МУК 4.1.769-99
"Количественное определение формальдегида в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Дата введения: 6 сентября 1999 г.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений", ГОСТа Р1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа аттестована и обеспечивает определение формальдегида в диапазоне концентраций 0,001-2,0 мкг/см3.

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 1.5-2012 "Стандартизация в Российской Федерации. Стандарты национальные. Правила построения, изложения, оформления и обозначения", утвержденный приказом Росстандарта от 23 ноября 2012 г. N 1147-ст

НСНО                                                 Мол. масса - 30,03

Формальдегид (муравьиный альдегид, метаналь) - газ с резким запахом. 35-40%-ный водный раствор формальдегида называется формалином или формолем. Растворы выделяют газообразный формальдегид при комнатной температуре. Т_кип - минус 19,3°С, Т_плавл - минус 118,3°С. Формальдегид растворим в воде и органических растворителях (бензол, толуол, ацетон, этанол, этилацетат и др.). Формальдегид - раздражающий газ, вызывает дегенеративные процессы в паренхиматозных органах, сенсибилизирует кожу, действует на ЦНС. Относится ко 2 классу опасности.

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений 20,0% при доверительной вероятности 0,95.

Сущность метода

Методика основана на предварительном переводе формальдегида в 2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, концентрировании продукта дериватизации из биологического материала экстракцией гексаном, упаривании гексанового экстракта, растворении упаренного остатка в ацетонитриле и анализе на жидкостном хроматографе.

Измерение концентрации формальдегида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.

Нижний предел измерения в объеме пробы - 0,05 мкг.

Определению не мешают метанол, этанол, уксусный альдегид, ацетон, муравьиная кислота и другие карбонильные соединения.

Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 40 мин.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Средства измерений

Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления (ЧССР) и ультрафиолетовым детектором LCD 2563 (ЧССР)
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические		ТУ 25-06113-79
Разновесы Г_2-210		ГОСТ 73208-82
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2, пределы 0-100°С, цена деления ГС		ТУ 25-2021- 003-88
Секундомер "Агат"		ГОСТ 5072-792.2
Микрошприцы МШ-10		ТУ5 Е2.833.106
Лупа измерительная		ГОСТ 25706-83
Линейка металлическая измерительная, цена деления 1 мм		ГОСТ 17435-72
Цилиндр мерный вместимостью 50 см3		ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные вместимостью 1, 5 и 10 см3		ГОСТ 20292-74
Пробирки центрифужные мерные вместимостью 10 см3
Колбы мерные вместимостью 50, 100 см3		ГОСТ 1770-74
Стандартные образцы:
Формальдегид в воде с концентрацией 1,0 мг/см3		ГСО 6263-91.2.1

Вспомогательные устройства

Колонка из кварцевого стекла длиной 15 см и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon С 18 с размером частиц 5 мкм
Центрифуга СМ-4 (2750 об/мин)
Дистиллятор		ТУ 61-1-721-79
Сушильный шкаф ШСС-80 П УХЛ 4.2 ИК-лампа		ТУ 16.531.743-83
Дефлегматор длиной 300 мм		ГОСТ 9425-60
Холодильник шариковый ХШ-300 (6 шар.)		ГОСТ 1770-74
Холодильник прямой ХПТ-3-300		ГОСТ 1770-74
Воронка Шотта (пор 16)		ГОСТ 25336-82
Воронки делительные вместимостью 250 см3		ГОСТ 23932-79
Бюксы вместимостью 10 см3 с притертой крышкой		ГОСТ 25336-82
Стакан термостойкий вместимостью 2 дм3		ГОСТ 25336-82
Колба для перегонки круглодонная вместимостью 2 дм3		ГОСТ 25336-82

ГАРАНТ:

См. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры", утвержденный постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670

Реактивы

Гексан, х. ч., очищенный для хроматографии		ГОСТ 6-09-4521-77
Ацетонитрил, ч., очищенный для хроматографии		ТУ 6-09-3534-87
Вода дистиллированная 2,4-динитрофенилгидразин, ч., очищенный перекристаллизацией из ацетонитрила, чистота не менее 99,0%.		ГОСТ 6709-72
2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, перекристаллизованный из метанола или этанола, чистота не менее 99,0%		ТУ 6-09-2394-77
Кислота соляная (плотность 1,19), х. ч.		ГОСТ 3118-77
Перманганат калия, ч.		ГОСТ 20490-75
Калий двухромовокислый, ч. д. а.		ГОСТ 4220-75

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 12.1.004-85 постановлением Госстандарта СССР от 14 июня 1991 г. N 875 с 1 июля 1992 г. введен в действие ГОСТ 12.1.004-91

При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М.,1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации оператора

К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.

Условия измерений

При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +- 10)°С;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 80% при температуре 25°С.

Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды и растворителей, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

Подготовка посуды

Используемую посуду необходимо тщательно вымыть хромовой смесью, тщательно ополоснуть водопроводной и дистиллированной водой и просушить при температуре 120°С.

Подготовка растворителей

Очистка ацетонитрила от примесей. В колбу вместимостью 2 дм3 помещают 1 дм3 ацетонитрила и 20 г KMnO4, кипятят с обратным холодильником в течении 1 ч, затем перегоняют сдефлегматором, отбирая фракции по 200 см3. Когда в колбе останется около 200 см3 продукта, перегонку прекращают. Остаток можно смешивать с новой порцией растворителя. Первую фракцию отбрасывают, а остальные проверяют на поглощение в УФ-области.

Приготовление растворов

Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 дм3 насыпают 50 г хромовокислого калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм3 концентрированной серной кислоты.

Элюент для хроматографии. 50 см3 очищенного ацетонитрила смешивают с 50 см3 дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия или азота в течение 5-10 мин со скоростью 50-60 об3/мин.

Соляная кислота, 2 моль/дм3. 163,0 см3 концентрированной HCl (плотность 1,19 г/см3) вносят в мерную колбу вместимостью 1 дм3 доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 2М соляной кислоте. 0,2 г 2,4-динитрофенилгидразина вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки 2М раствором соляной кислоты.

Исходный раствор формальдегида для калибровки (раствор А). 1 см3 ГСО формальдегида с концентрацией 1,0 мг/см3 переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора - 36 ч.

Рабочий раствор для градуировки УФ-детектора. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 10 см3 раствора А и доводят дистиллированной водой до метки (раствор Б). Срок хранения раствора - 36 ч.

Идентификация хроматографического пика 2,4-динитрофенил-гидразона формальдегида. Готовят раствор 2,4-динитрофенил-гидразона формальдегида в ацетонитриле с концентрацией 0,01-0,02 мг/см3, вводят в колонку хроматографа 1-2 мм3 раствора. Снимают хроматограмму в условиях хроматографического анализа и определяют время удерживания 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида.

Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость (ацетонитрил : вода = 1 : 1) со скоростью 1 см3/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации формальдегида в моче, устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из шести растворов, готовят из растворов А и Б.

Растворы для установления градуировочной характеристики готовят в мерных колбах вместимостью 50 см3. Для этого в каждую колбу вносят раствор А (или раствор Б) в соответствии с таблицей, доводят объем до метки мочой, не содержащей формальдегид, и тщательно перемешивают. Растворы готовят непосредственно перед определением.

Таблица

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации формальдегида в моче (фрагмент шкалы)

Номер раствора	1	2	3	4	5	6
Объем раствора А (конц. 10 мкг/см3), см3	-	-	-	-	2,50	6,00
Объем раствора Б (конц. 1 мкг/см3), см3	0,05	0,25	1,00	5,0	-	-
Массовая концентрация формальдегида, мкг/см3	0,001	0,005	0,020	0,100	0,500	1,200

50 см3 каждого рабочего раствора помещают в делительную воронку, добавляют 2,5 см3 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенил-гидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см3 гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и мочи верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 2 см3 гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,5 см3 ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мм3). Проводят по пять параллельных вводов обработанных экстрактов каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:

подвижная фаза	ацетонитрил: вода =1:1
скорость движения элюента	0,6 см3/мин,
скорость диаграмной ленты	0,3 см/мин,
длина волны УФ-детектора	365 нм,
шкала детектора	2,
время удерживания :
2,4-динитрофенилгиразина	4 мин 20 с,
2,4-динитрофенилгидразона фopмaльдегида	5 мин 50 с.

По средним для каждой точки значениям аналитического сигнала (площади пика) строят градуировочную характеристику S = f (С), где S - площадь пика, мм2 (или усл. ед); С - концентрация градуировочного раствора, мкг/см3. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.

Отбор проб

Для отбора проб мочи используют чистую стеклянную посуду объемом 100 см3 с плотно закрывающейся крышкой. Срок хранения пробы мочи в холодильнике - не более суток.

Выполнение измерений

50 см3 анализируемой пробы помещают в делительную воронку, добавляют 2,5 см3 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см3 гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и мочи верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 2 см3 гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,5 см3 ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мм3). Анализ проводят при вышеуказанных условиях работы хроматографа. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.

Вычисление результатов измерения

Вычисляют значение площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида по формуле:

                             S = h х L, мм2, где

     h - высота пика, мм;

     L - ширина пика на половине высоты, мм.

По значению площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида из градуировочных характеристик находят массовую концентрацию формальдегида в моче, мкг/см3.

Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

ГАРАНТ:

Взамен МИ 2335-95 Госстандартом России введена в действие с 1 октября 2003 г. рекомендация МИ 2335-2003

Оперативный контроль сходимости

Периодичность контроля сходимости измерений зависит от количества рабочих измерений (2 параллельные пробы). Отбирают 2 пробы мочи и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики.

Результаты признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                    |C -C | <= 0,01d x C  , где

                      1  2              гр

     С  и С - результаты анализа 1 и 2 проб;

      1    2

     d - допустимое  расхождение  между двумя результатами одной и той же

пробы (d = 55%);

     С  - среднее значение между двумя определениями.

      ср

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50-150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                  |Х' - Х - С| < К , где

                                  д

     С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией, мкг/см3;

     К  - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см3.

      д

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают

                                     2           2

                К  = кв.корень Дельта х' + Дельта х, где

                 д

           2           2

     Дельта х' и Дельта х - характеристики   погрешностей   для  исходной

пробы и пробы с добавкой, мкг/см3.

            Дельта х' = 0,165 х Х' и Дельта х  = 0,165 х X

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что

                   К'  = 0,84 х К

                    д            д

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.