5.1.5. Отбор проб и методы подготовки образцов
5.1.5.2. Методы отбора проб и подготовки образцов для организмов теплокровных животных для экспериментальных исследований.
5.1.5.2.1. Выбор вида животных.
Для определения содержания наноматериалов в организмах животных используют различные виды лабораторных животных в соответствии с МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".
В зависимости от целей исследований могут использоваться также лемминги Lemmus sibiricus, Dicrostonyx torquatus, Myopus schisticolor; полевки Microtus arvalis, Microtus argestis, Arvicola oeconomus; крыса чёрная Rattus rattus; бурозубки Sorex auraneus, Sorex polustris, Sorex jacksoni; кролики, морские свинки, а также, в случае необходимости, крупные млекопитающие (копытные).
Для определения содержания наноматериалов в организмах лабораторных животных рекомендуется использовать мелких лабораторных грызунов, например, крыс линий Wistar, Sprage-Dawley или мышей Balb, CD1, СВА и др.
Исследования проводятся на здоровых животных. Требования к лабораторным животным, условиям их содержания, кормления установлены в МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".
5.1.5.2.2. Методы подготовки проб из организмов теплокровных животных для экспериментальных исследований.
Получение крови. Кровь у мелких лабораторных животных (мыши, крысы) можно получить из хвоста или из сердца в случае вскрытия животных (для электронной микроскопии оптимально иметь не менее 30 ![]()
сыворотки крови). После забора крови пробирки типа Эппендорф закрывают крышками и центрифугируют на небольшой скорости (до 2 000 g) в течение 10 с - 1 мин, чтобы сбросить капельки крови, осевшие на стенки пробирок, не дав им высохнуть.
Для получения сыворотки кровь следует поставить в термостат на 37°С на 30 мин, после чего центрифугировать в течение 10 мин на скорости 2 000 g. Отбирают сыворотку, не задевая тромба, в отдельную пробирку, которую маркируют соответствующим образом. Сыворотку следует получать не позже, чем через 2 ч после отбора крови, чтобы избежать гемолиза. Маркированные пробирки замораживают и хранят при температуре -20°С.
Для получения плазмы кровь отбирают в пробирки, куда предварительно внесен раствор гепарина (10 ![]()
). Пробирки центрифугируют в течение 10 мин на скорости
2 000 g. Отбирают плазму, не задевая клеток, в отдельную пробирку, которую маркируют (например, П - плазма) Пробирки с оставшимся осадком (клетками крови) маркируют КК - клетки крови. Маркированные пробирки замораживают и хранят при температуре -20°С.
Получение органов животных. При вскрытии животных выделяют последовательно почки, печень, желудок, кишечник, селезенку, легкие, сердце, брызжеечные, подмышечные и другие лимфатические узлы, после вскрытия черепной коробки животного - головной мозг. Выделенный орган с помощью пинцета немедленно помещают в чашку Петри с фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 и промывают от крови. Желудок и кишечник освобождают от содержимого и тщательно промывают фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4. В зависимости от цели исследования органы переносятся в соответствующие фиксирующие жидкости или замораживаются в жидком азоте или с помощью сухого льда.
По возможности органы одного и того же животного используются для проведения различных видов анализа.
Для приготовления срезов тканей для электронной микроскопии орган разрезают острой бритвой на куски размером 1 x 1 х 1 мм (6 кусков от одного органа одного животного). Куски пинцетом переносят в пенициллиновые флаконы с фиксатором (2,5% глутаровый альдегид на однократном 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 с добавлением 2% нейтрального формалина) из расчета 4 ![]()
на один флакон.
Из таких тканей и органов, как мышцы, печень и другие железистые органы, кусочки могут быть вырезаны произвольно. Из таких органов, как сердце, мозг, почка, кусочки вырезают из нужного отдела, например, отдельно из областей коркового и мозгового вещества почки, из областей предсердий или желудочков сердца и т.д. Такие органы, как желудочно-кишечный тракт и кожа, требуют ориентации при фиксации. Для этого поперечные срезы кожи и определенных отделов желудочно-кишечного тракта прикладывают на небольшие кусочки бумаги и в таком виде помещают в фиксатор. Пробы из одного органа от одного животного помещают в один флакон.
Из разных отделов желудка и кишечника вырезают кусочки площадью 1 ![]()
(объемом не более 1 ![]()
), переносят в пенициллиновые флаконы с фиксатором. У мелких грызунов берут фрагмент кишечника и заливают фиксатором в расправленном виде. Отношение объема фиксатора к фиксируемой ткани должно быть не менее 10 : 1. Пробы из одного органа от одного животного помещают в один пузырек.
Каждый флакон маркируют специальным химически стойким маркером либо восковым карандашом, либо приклеивают бумажную этикетку, запись на которой делают карандашом. На этикетке должен указываться номер животного и название органа, а также вид анализа, для которого подготовлена проба.
Пробы, направляемые в лабораторию, снабжают этикеткой и актом отбора проб, в котором указывают место, время отбора, объект, орган, подписи лиц, отбиравших пробу.
Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4°С. Нельзя допускать замораживание образцов, т.к. образующиеся кристаллы льда разрушают ткани.
Для приготовления тканевых гомогенатов для электронной микроскопии из органов вырезаются фрагменты размером от 5 х 5 х 5 мм до 10 х 10 х 10 мм, фрагменты большего размера предпочтительнее, небольшие органы или органы мелких животных можно фиксировать целиком. Органы или их фрагменты помещают в небольшие (порядка 1 ![]()
) открытые емкости (лунки блистеров) с однократным 0,1 М фосфатно-солевом буфером рН 7,2-7,4, каждая из которых маркируется отдельно путем погружения в заливочную среду этикетки (надпись выполняется карандашом). Замораживание производится жидким азотом в морозоустойчивом теплоизолированном сосуде с широким горлом. Пробы, направляемые в лабораторию, снабжают этикеткой и актом отбора проб, в котором указывают место, время отбора, объект, орган, подписи лиц, отбиравших пробу. Замороженные пробы быстро заворачивают в фольгу каждую в отдельности и погружают в сосуд Дьюара или термос с жидким азотом для долговременного хранения. Можно также использовать колотый сухой лед в морозоустойчивой термоизолирующей (например, пенопластовой) емкости. Емкость должна быть герметически закрыта. Для длительного хранения препараты извлекаются из жидкого азота и помещаются в низкотемпературный холодильник с температурой не выше -80°С. В таких условиях пробы могут храниться в течение длительного времени.
5.1.5.3. Методы подготовки образцов продукции животноводства.
Для определения содержания наноматериалов в мясе и субпродуктах скота или птицы из разных областей мышечной ткани, печени, сердца, почек, желудка и других органов скальпелем срезают наружный слой и вырезают кусочки размером примерно 2 х 2 х 2 см.
Для приготовления срезов тканей для электронной микроскопии разрезают полученные куски острой бритвой на кусочки размером 1 x 1 x 1 мм (6 кусочков от одной пробы), которые пинцетом переносят в пенициллиновые флаконы с фиксатором (2,5% глутаровый альдегид на 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 с добавлением 2%-го нейтрального формалина) из расчета 4 ![]()
на один флакон. Отношение объема фиксатора к фиксируемой ткани должно быть не менее 10:1. Кусочки от каждой пробы помещают в отдельный маркированный пузырек. На этикетке должен быть указан изготовитель продукции, название и номер партии, а также вид анализа, для которого подготовлена проба. Пробы, направляемые в лабораторию, снабжают этикеткой и актом отбора проб, в котором указывают место, время отбора, объект, органы, подписи лиц, отбиравших пробу. Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4°С. Нельзя допускать замораживание образцов, т.к. образующиеся кристаллы льда разрушают ткани!
Для приготовления тканевых гомогенатов для электронной микроскопии вырезаются фрагменты размером от 5 х 5 х 5 мм до 10 х 10 х 10 мм. Фрагменты помещают в небольшие (порядка 1 ![]()
) открытые емкости (лунки блистеров) с однократным 0,1 М фосфатно-солевом буфером рН 7,2-7,4, каждая из которых маркируется отдельно путем погружения в заливочную среду этикетки (надпись выполняется карандашом). Замораживание производится жидким азотом в морозоустойчивом теплоизолированном сосуде с широким горлом. Пробы маркируют так же, как и образцы тканей. Замороженные пробы быстро заворачивают в фольгу каждую в отдельности и погружают в сосуд Дьюара или термос с жидким азотом для долговременного хранения. Также можно использовать колотый сухой лед в морозоустойчивой термоизолирующей (например, пенопластовой) емкости. Емкость должна быть закрыта, чтобы уменьшить теплообмен. Для длительного хранения препараты извлекаются из жидкого азота и помещают в низкотемпературный холодильник с температурой не более -80°С. В таких условиях пробы могут храниться в течение длительного времени.
Гомогенаты тканей готовят для упрощения и ускорения детекции наночастиц в тканях в случае, если распределение наноматериалов в клетках и тканях не имеет значения.
Для приготовления образцов молока из транспортной тары или потребительской упаковки отбирают 15 ![]()
в пластиковую или стеклянную пробирку с герметично закрывающейся пробкой.
5.1.5.4. Приготовление образцов для электронной микроскопии.
Поступившие образцы разделяют на 2 группы. Первая группа образцов подвергается оптимизированной процедуре пробоподготовки, полностью исключающей контрастирование образцов, которое маскирует наличие наночастиц. Образцы из первой группы используются в дальнейшем для оценки наличия наночастиц и их морфологии, а также для статистического анализа частоты встречаемости наночастиц. Вторая группа подвергается стандартной процедуре проводки и контрастирования, чтобы можно было оценить состояние ткани в контроле и при действии наночастиц, а также выяснить локализацию наночастиц. Все процедуры проводят только в стеклянной посуде!
Важным пунктом подготовки образца к электронномикроскопическому исследованию является подготовка бленд (сеточек) и нанесение на них формваровой пленки. Следует учитывать, что попадание чужеродных частиц на пленку на этом этапе является существенным фактором, приводящим к артефактам в последующих измерениях.
Для нанесения формваровой пленки на сеточки и бленды может быть использована следующая методика.
Мытье бленд или сеток: поместить бленды или сетки в 30%-ю соляную кислоту на 1 мин при комнатной температуре; промыть бленды в дистиллированной воде 10 раз; промыть бленды в ацетоне (градация хч) 3 раза и высушить на воздухе; хранить бленды в герметично закрытой емкости, чтобы избежать попадания пыли.
В том случае, если сетки используют повторно, перед процедурой промывания их обрабатывают ультразвуком. Сетки помещают в стеклянную колбу с дихлорэтаном и погружают в ультразвуковую ванну, наполненную водой. При использовании ультразвуковой ванны с пьезокерамическим преобразователем с выходной мощностью 0,06 кВт обработку проводят при 37 или 44 кГц в течение 10-15 мин. При использовании ванн с большей мощностью время обработки можно снижать пропорционально мощности, но не меньше 5 мин.
Приготовление пленки:
- приготовить 0,3%-й раствор формвара в дихлорэтане (градация хч) в узкой стеклянной емкости с притертой крышкой. Полное растворение достигается за 3 дня. Хранить в темноте;
- чистое предметное стекло опустить в емкость с формваром, вынуть, поставить стекло ребром на фильтровальную бумагу для удаления излишков формвара и высушить. Процарапать препаровальной иглой прямоугольник по краю стекла. Подготовить широкую емкость с дистиллированной водой (удобно использовать кристаллизатор). Дистиллированная вода наливается в емкость до образования выпуклого мениска. Удалить пыль с поверхности воды с помощью стеклянной палочки или пипетки. Удаление пыли обязательно, иначе пыль попадет на формваровую пленку. Коротко подышать на стекло с формваровой пленкой и медленно погрузить его в емкость с водой. В процессе погружения формваровая пленка отделится от стекла.
Вымытые бленды помещаются на поверхность пленки с помощью пинцета. Пленка вылавливается на чистое предметное стекло, которое помещают в чашку Петри для последующего высушивания.
5.1.5.4.1. Подготовка срезов тканей для детекции наноматериалов методом ПЭМ (без контрастирования):
а) фиксатор отмывают 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 однократно 20-30 мин при комнатной температуре;
б) проводят обезвоживание образцов в водных растворах этилового спирта:
- обрабатывают образцы 50%-м этиловым спиртом 20 мин при 4°С;
- обрабатывают образцы 60%-м этиловым спиртом 2 раза по 20 мин при 4°С;
- обрабатывают образцы 70%-м этиловым спиртом в течение 12 ч при 4°С (оставляют на ночь в холодильнике);
- обрабатывают образцы 80 и 96%-м растворами этилового спирта по 20 мин;
- обезвоживают образцы ацетоном 3 раза по 45 мин при комнатной температуре;
в) проводят пропитку материала и последующую заливку в эпоксидные смолы. Используют смесь Эпон 812, DDSA (додецил янтарный ангидрид), MNA (метилэндиковый ангидрид) в соотношении 13:8:7. Для полимеризации добавляется катализатор DMP-30 (тридиметиламинофенол);
г) для пропитки образцы при комнатной температуре помещают на 2 ч в смесь смолы и ацетона 1:3, затем на 2 ч в смесь смолы и ацетона 1 : 1 и на ночь (12 ч) в смесь смолы и ацетона 3:1. Перед окончательной заливкой материал помещают на 2 ч в смолу. Для заливки используют специальные тефлоновые платы с лунками для заливки (допустимо использование блистеров от таблеток);
д) полимеризацию материала проводят в течение 24 ч при 37°С, затем в течение 48 ч при 60°С. Окончательная твердость блока может быть подобрана изменением соотношения смолы и катализатора;
е) из полученного блока с помощью лобзика выпиливают прямоугольный участок, размером 2 х 2 х 5 мм (ширина : ширина : высота). Полученные блоки закрепляют в специальном держателе и затачивают острой бритвой в виде усеченной пирамиды под бинокулярным микроскопом;
ж) срезы толщиной до 80 нм получают на ультрамикротоме с помощью алмазного или стеклянного ножа. Срезы переносят на бленды или сетки, покрытые формваровой пленкой и высушивают не менее 1 ч на воздухе. Данная процедура должна выполняться опытным специалистом.
5.1.5.4.2. Подготовка с использованием стандартной процедуры проводки и контрастирования:
а) образцы (кусочки ткани 1 x 1 x 1 мм) отмывают от фиксатора 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 однократко 20 мин при комнатной температуре;
б) образцы дофиксируют и контрастируют 1%-м раствором четырехокиси осмия ![]()
на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,4 в течение 2 ч. Раствор готовят разбавлением 2% водного раствора ![]()
непосредственно перед использованием! (Глутаровый альдегид лучше, чем четырехокись осмия фиксирует белки, но хуже стабилизирует липиды, что и обусловливает использования обоих фиксаторов, как дополняющих друг друга);
в) проводят обезвоживание образцов в водных растворах этилового спирта:
- отмывают образцы от ![]()
холодным (4°С) 50%-м раствором этилового спирта 3-4 раза по 5 мин до прекращения потемнения раствора. Использование холодного 50%-го этанола предотвращает выпадение осмия в осадок;
- обрабатывают образцы 60%-м раствором этилового спирта 2 раза по 20 мин (4°С);
г) проводят контрастирование образцов 2%-м спиртовым (70%-й раствор этилового спирта) раствором уранилацетата при 4°С в течение 12 ч (оставляют на ночь в холодильнике);
д) обезвоживают образцы холодным (4°С) 80 и 96%-м раствором этилового спирта по 15 мин (комнатная температура). Использование холодного 80%-го раствора этилового спирта предотвращает выпадение в осадок уранила;
е) обезвоживают образцы ацетоном 3 раза по 45 мин при комнатной температуре;
ж) проводят пропитку материала и последующую заливку в эпоксидные смолы, используя смесь Эпон 812, DDSA (додецил янтарный ангидрид), MNA (метилэндиковый ангидрид) в соотношении 13:8:7. Для полимеризации добавляется катализатор DMP-30 (тридиметиламинофенол);
з) для пропитки образцы при комнатной температуре помещают на 2 ч в смесь смолы и ацетона 1:3, затем на 2 ч в смесь смолы и ацетона 1 : 1 и на ночь (12 ч) в смесь смолы и ацетона 3:1. Перед окончательной заливкой материал помещают на 2 ч в смолу. Для заливки используют специальные тефлоновые платы с лунками для заливки (допустимо использование блистеров от таблеток);
и) полимеризацию материала проводят в течение 24 ч при 37°С, затем в течение 48 ч при 60°С. Окончательная твердость блока может быть подобрана изменением соотношения смолы и катализатора;
к) из полученного блока с помощью лобзика выпиливают прямоугольный участок, размером 2 x 2 x 5 мм (ширина : ширина : высота). Полученные блоки закрепляют в специальном держателе и затачивают острой бритвой в виде усеченной пирамиды под бинокулярным микроскопом. Такие органы, как кожа, мышечные волокна, отделы желудочно-кишечного тракта требуют правильной ориентации при изготовлении срезов. Предварительно изготавливают полутонкие срезы толщиной 3-5 мкм с помощью пиромитома (используют стеклянный нож). Срезы помещают на предметное стекло, окрашивают красителем толлуидиновым синим (0,1%-й раствор) и проверяют правильность ориентации с помощью светового микроскопа. Для исследования кожи и отделов желудочно-кишечного тракта срез должен проходить строго в поперечном направлении;
л) срезы толщиной до 80 нм получают на ультрамикротоме с помощью алмазного или стеклянного ножа. Для выяснения локализации наночастиц рекомендуется использовать серийные срезы;
м) срезы переносят на бленды или сетки, покрытые формваровой пленкой, и высушивают не менее 1 ч на воздухе;
н) для анализа ультраструктуры клеток в присутствии наночастиц полученные срезы контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца 15 мин при комнатной температуре. Для этого срезы помещают в каплю 30-40 ![]()
соответствующего раствора, нанесенную на парафильм в чашке Петри. Важным моментом является необходимость при контрастировании цитратом свинца поместить в чашку Петри рядом со срезами кристаллический NaOH для предотвращения выпадения свинца.
5.1.5.4.3. Приготовление образцов для определения наноматериалов в тканевых гомогенатах методом просвечивающей электронной микроскопии.
Важным пунктом подготовки образца к электронно-микроскопическому исследованию, является подготовка сеточек и нанесение на них формваровой или углеродной пленки.
Процедура нанесения формваровой пленки на сеточки аналогична описанной для бленд в разделе "Пропись приготовления образцов для определения наноматериалов в срезах тканей методом просвечивающей электронной микроскопии".
Для получения сеток с углеродной пленкой необходимо вначале напылить слой углерода на поверхность слюды, непосредственно перед напылением расщепленную для получения чистой гладкой поверхности. Напыление производят с помощью прибора для напыления пленок углерода в вакууме (например, Emitech K950X фирмы "Emitech", Великобритания, или аналогичным). Напыление производят в вакууме не выше 4-10 мБар импульсно, делают 2-4 импульса в течение 2-5 с с перерывами по 30 с между ними. Готовую пленку спускают на поверхность дистиллированной воды, налитой в непрозрачный контейнер. Предварительно отмытые (как описано для бленд в разделе Пропись приготовления образцов для определения наноматериалов в срезах тканей методом просвечивающей электронной микроскопии") сетки для микроскопии укладывают на прямоугольный листок фильтровальной бумаги, вырезанный по размеру углеродной пленки и помещенный на поддерживающую сетчатую металлическую пластинку на расстоянии 1-2 мм под поверхностью воды. Зажав пинцетом фильтровальную бумагу с сетками и поддерживающей пластинкой, осторожно вылавливают углеродную пленку так, чтобы она покрыла сетки. Фильтровальную бумагу с покрытыми углеродной пленкой сетками помещают в чашку Петри или другую удобную посуду с поглотителем влаги в термостат (50°С) не менее, чем на 1 ч. Хранят сетки в закрытой чашке Петри или другой удобной посуде:
а) образец замороженной ткани оттаивают при комнатной температуре;
б) измельчают образец и готовят из него гомогенат с помощью гомогенизатора;
в) дальнейшую подготовку гомогената к измерениям проводят по одной из следующих методик:
- с использованием концентрированных неорганических кислот:
а) помещают 40 ![]()
приготовленного гомогената в полипропиленовую пробирку;
б) добавляют 30 ![]()
концентрированной азотной кислоты, перемешивают смесь;
в) помещают смесь в термостат (37°С) на ночь;
г) после инкубации нейтрализуют смесь 10 М раствором NaOH, проверив рН смеси универсальным индикатором.
Недостаток такой методики - образование многочисленных кристаллов соли при переносе и высушивании образца на сеточке для электронной микроскопии;
- с использованием протеазы "Флавозим":
а) помещают 40 ![]()
приготовленного гомогената в полипропиленовую пробирку;
б) добавляют протеазу "Флавозим" из расчета 1 г гомогената - 25 ед. активности протеазы, перемешивают смесь;
в) помещают смесь в термостат (50°С) минимум на 6 ч, оптимально на 20 ч.
Примечание: активность протеазы максимальна при рН 6,0;
- с использованием протеиназы К:
а) помещают 40 ![]()
приготовленного гомогената в полипропиленовую пробирку;
б) добавляют протеиназу К из расчета 1 г гомогената - 30 ед. активности протеиназы, перемешивают смесь;
в) помещают смесь в термостат (37°С) на 4 ч;
г) на чистую фильтровальную бумагу выкладывают медную сеточку с предварительно нанесённой формваровой плёнкой или с напыленным тонким слоем углерода;
д) на сеточку наносят 2,5 ![]()
образца, подготовленного из гомогената, сразу же стягивая края капли на фильтровальную бумагу;
е) подсушивают сеточку на воздухе в течение 5-10 мин, закрывая от попадания пыли крышкой чашки Петри или стеклянного бюкса, затем переносят в бокс для хранения электронно-микроскопических образцов.
5.1.5.4.4. Приготовление образцов сыворотки или плазмы крови для определения наноматериалов методом просвечивающей электронной микроскопии:
а) к 20 ![]()
сыворотки или плазмы крови добавляют 5 ![]()
10%-го раствора додецилсульфата натрия;
б) к полученной смеси добавляют 5 ![]()
раствора протеиназы К (1 ![]()
);
в) инкубируют в термостате при 37°С в течение 1 ч;
г) на чистый бумажный фильтр (типа Whatman или аналогичный) выкладывают медную сеточку с предварительно нанесённой формваровой плёнкой или с напыленным тонким слоем углерода;
д) на сеточку наносят 2,5 ![]()
образца, подготовленного из гомогената, сразу же стягивая края капли на фильтровальную бумагу;
е) подсушивают сеточку на воздухе в течение 5-10 мин, закрывая от попадания пыли крышкой чашки Петри или стеклянного бюкса, затем переносят в бокс для хранения электронно-микроскопических образцов.
5.1.5.4.5. Приготовление образцов молока для определения наночастиц методом ТЭМ:
а) помещают 40 ![]()
образца в полипропиленовую пробирку;
б) добавляют протеазу "Флавозим" из расчета на 40 ![]()
молока - 0,1 ед. активности протеазы, перемешивают смесь;
в) помещают смесь в термостат (50°С) минимум на 6 ч, оптимально на 20 ч.
Примечание: см. п. 5.1.5.4.3;
г) на чистую фильтровальную бумагу выкладывают медную сеточку с предварительно нанесённой формваровой плёнкой или с напыленным тонким слоем углерода;
д) на сеточку наносят 2,5 ![]()
пробы молока, сразу же стягивая края капли на фильтровальную бумагу;
е) подсушивают сеточку на воздухе в течение 5-10 мин, закрывая от попадания пыли крышкой чашки Петри или стеклянного бюкса, затем переносят в бокс для хранения электронно-микроскопических образцов.
