Методические указания МУК 4.2.2872-11 "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий-возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путём передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека)

1) не открывать ПЦР-пробирки после амплификации, удалять отходы с продуктами ПЦР только в закрытом виде,

2) перед входом в рабочую зону снимать уже использованные перчатки. Заранее готовить новые перчатки, перед тем как покинуть рабочую зону,

3) сбрасывать наконечники с пипеток в пластиковый пакет и выносить его после каждого использования из рабочей зоны,

4) промывать рабочую зону после каждого использования дезсредством*(3),

5) для биологической защиты рабочей зоны использовать ультрафиолетовые облучатели до и после работы в течение 15-30 мин,

6) деконтаминировать пипетки еженедельно согласно рекомендациям производителя (121°С в течение 30 мин),

7) обрабатывать охлаждающие блоки в следующей последовательности: обработка дезсредством*(2), ополаскивание водой и протирка сухой салфеткой перед размещением в холодильнике,

8) убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезсредства*(2),

9) утилизировать неиспользованные образцы и реактивы.

10) санитарную обработку проводить в перчатках,

11) протереть наружные поверхности раствором дезсредства*(2). Оставить жидкость на поверхности примерно на 10 мин, затем вытереть насухо одноразовыми салфетками. Затем протереть поверхности 70% этиловым спиртом. Облучить поверхности ультрафиолетом в течение ночи,

12) утилизировать все расходные материалы (наконечники для пипеток, растворы реагентов и т.д.), которые были извлечены из упаковок и частично израсходованы, путем автоклавирования при 121°С в течение 30 мин,

13) очистить наружные поверхности всех используемых приборов и инструментов (амплификатор, пипетки и т.д.) с применением дезсредства и спирта,

14) простерилизовать пипетки и все использованные инструменты и приспособления, стойкие к автоклавированию, при 121°С в течение 30 мин или в соответствии с рекомендациями производителей.

7.1.1. Растворы и реактивы общего назначения

7.1.1.4. Забуференную пептонную воду (ЗПВ) готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

пептон - 10 г,

хлористый натрий - 5 г,

двухзамещенный фосфорнокислый натрий 12-водный, - 9 г,

однозамещенный фосфорнокислый калий, - 1,5 г,

вода - 1000 .

Растворяют ингредиенты в воде при нагревании, доводят объём до метки, устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С. Разливают в широкогорлые колбы и флаконы подходящей вместимости с учётом засеваемой навески продукта (например, 225  при посеве 25 г, 450  при посеве 50 г образца и т.п.). Стерилизуют при температуре °С в течение 15 мин.

7.1.2. Растворы и реактивы предназначенные для выявления определенных групп патогенов

7.2.1. Среды сухие промышленного изготовления, аналогичные поименованным в п. 6.3., готовят согласно прописям, указанным на этикетках.

Допускается применение сред лабораторного приготовления из отдельных компонентов, в соответствии с нижеследующими п.п.:

7.2.2. Питательный агар с 1% глюкозы и питательный бульон с 1% глюкозы (МПА с 1% глюкозы, МПБ с 1% глюкозы) готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".

7.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (ТСБДЭ и ТСАДЭ) готовят в соответствии с нижеследующей прописью :

ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для ТСАДЭ) - 15,0.

Компоненты растворяют в 1000  дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН и автоклавируют при 121°С в течение 15 мин. Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8°С.

7.2.4. Среду Кесслер с глюкозой готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

пептон - 10 г,

глюкоза - 2,5 г,

желчь крупного рогатого скота сухая - 5 г (натуральная 50 ),

1%-ный водный раствор кристаллического фиолетового (генцианвиолета, метилвиолета) - 2 ,

дистиллированная вода - 1000 .

Компоненты растворяют в 1000  дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, доводят объём до 1 , фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С. Разливают в пробирки с поплавками по 10 , автоклавируют при °С в течение 20 мин.

7.2.5. Глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

пептон - 10 г,

глюкоза - 5 г,

двухзамещенный фосфорнокислый натрий безводный, - 6,45 г,

однозамещенный фосфорнокислый калий безводный, - 2 г,

желчь крупного рогатого скота сухая - 20 г (натуральная 200 ),

0,5%-ный водный раствор бриллиантового зеленого - 3 ,

дистиллированная вода - до 1000 .

Компоненты растворяют в 1000  дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, доводят объём до 1 , фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы он составлял при температуре 25°С, после чего повторно доводят до кипения. Разливают в стерильные пробирки с поплавками по 10 .

7.2.6. Бульон Мак-Конки с глюкозой готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

пептон - 20 г,

глюкоза - 10 г,

хлористый натрий - 5 г,

желчь крупного рогатого скота сухая - 5 г (натуральная 50 ),

1,0%-ный щелочной (в растворе гидроокиси натрия с концентрацией 0,02 ) раствор бромкрезолового пурпурного - 1 ,

дистиллированная вода - до 1000 .

Компоненты растворяют в 1000  дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, доводят объём до 1 , фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С. Разливают в пробирки с поплавками по 10 , автоклавируют при °С в течение 15 мин.

7.2.7. Среду Кесслер с лактозой готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

пептон - 10 г,

лактоза - 2,5 г,

желчь крупного рогатого скота сухая - 5 г (натуральная 50 ),

1%-ный водный раствор кристаллического фиолетового (генцианвиолета, метилвиолета) - 2 ,

дистиллированная вода-до 1000 .

Компоненты растворяют в 1000  дистиллированной воды, нагревают на слабом огне до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объём до 1 , охлаждают до 45-55°С. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С. Разливают в пробирки с поплавками по 10  или в колбы (флаконы) по 225 , автоклавируют при °С в течение 20 мин.

7.2.8. Лактозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

Ферментативный перевар казеина - 10 г,

лактоза - 10 г,

желчь крупного рогатого скота сухая - 20 г (натуральная 200 ),

0,5%-ный водный раствор бриллиантового зелёного - 2,66 ,

дистиллированная вода - до 1000 .

При нагревании растворяют компоненты в воде. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С. Разливают в пробирки с поплавками по 10  или в колбы (флаконы) по 225 , автоклавируют при °С в течение 15 мин.

7.2.9. Грам-негативный обогащающий бульон (GN-бульон) по Хайну готовят по прописи, указанной на этикетке из сухой среды промышленного производства "GN Enrichment Broth асе.to HAJNA", Cat. N 10756, фирма "MERCK", Германия или Cat. N M 242, фирма "Hi-Media", Индия.

7.2.10. Селенитовый бульон в модификации Лейфсона готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

кислый селенистокислый натрий - 4 г,

пептон - 5 г,

натрий фосфорнокислый однозамещенный безводный - 3 г,

натрий фосфорнокислый двухзамещённый безводный - 7 г,

лактоза - 4 г,вода дистиллированная - до 1000 .

Среду готовят из 2-х растворов. Раствор 1: смешивают компоненты и при нагревании растворяют в воде. Путём изменения количественные соотношений фосфатов устанавливают рН . Разливают во флаконы или колбы по 100 , стерилизуют при °С 30 мин. Раствор можно хранить в холодильнике 1-2 мес. Раствор 2: 10%-й раствор кислого селенистокислого натрия готовят ex tempore на стерильной дистиллированной воде. Перед началом посева в каждый флакон с 100  раствора 1 добавляют по 4  раствора 2.

Готовую среду асептически разливают в стерильные пробирки по 10  или в колбы (флаконы) по 225  и плотно закрывают пробками. Дальнейшей стерилизации не требуется.

7.2.11. Маннитный селенитовый бульон готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

пептон - 5 г,

маннит - 4 г,

натрия фосфат - 10 г,

кислый селенистокислый натрий - 4 г,

вода дистиллированная - 1000 .

В 1000  дистиллированной воды добавить 4 г натрия селенистокислого кислого. После перемешивания добавляют остальные ингредиенты, вновь перемешивают при подогревании до полного растворения солей, разливают в колбы (флаконы) по 225 . Стерилизуют текучим паром в течение 10 мин.

7.2.12. Среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

Раствор 1:

ферментативный гидролизат сои - 5 г,

хлористый натрий - 8 г,

двухзамещенный фосфорнокислый калий безводный, - 0,2 г,

однозамещенный фосфорнокислый калий безводный, - 1,4 г,

дистиллированная вода - 1000 .

Компоненты растворяют в воде при нагревании до температуры 70°С. Раствор готовят за день до приготовления среды.

Раствор 2:

хлористый магний 6-водный - 400 г,

вода дистиллированная - 1000 .

Растворяют хлористый магний в воде, переносят в бутыль из темного стекла с притёртой пробкой и хранят при комнатной температуре. В виду гигроскопичности хлористого магния раствор следует готовить, используя вновь вскрытую упаковку реактива.

Раствор 3:

малахитовый зелёный оксалат - 0,4 г,

вода дистиллированная - 100 .

Готовят раствор, растирая малахитовый зелёный оксалат в ступке. Переливают в мерную колбу, доводят водой до метки. Хранят в бутылке из тёмного стекла не более 8 мес.

Среду готовят, прибавляя к 1000  раствора 1 100  раствора 2 и 10  раствора 3. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при температуре 25°С. Разливают в пробирки по 10 , автоклавируют при °С в течение 15 мин.

7.2.13. Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (MKT-бульон) готовят в соответствии с прописью, указанной в ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579-2002) "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonellan, Приложение В, п. 4.

7.2.14. Селективный бульон Престона для накопления кампилобактерий готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

Основа среды:

пептон - 10 г,

мясной экстракт - 10 г,

натрия хлорид - 5 г,

вода - 920 .

Растворяют основные компоненты в дистиллированной воде. При необходимости подогревают до кипения для полного растворения частиц. Устанавливают рН с помощью 0,1 М HCl или 0,1 М NaOH. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут. Остужают до 45-50°С.

Готовая среда:

Перед использованием в 920  бульона асептически добавляют: 70  стерильной дефибринированной крови барана; растворенное в 50%-ном растворе ацетона содержимое двух флакончиков с добавкой антибиотиков для кампилобактерий IV (по Престону) и растворенное в стерильной дистиллированной воде содержимое двух флакончиков ростовой добавки для кампилобактерий или 4  аэротолерантной добавки по п. 7.1.4., тщательно перемешивают и разливают среду в соответствующие емкости, в количествах, необходимых для проведения исследования.

7.2.15. Селективный бульон Дойла для накопления кампилобактерий готовят в соответствии с нижеследующей прописью

Основа среды:

гидролизат казеина - 10 г,

пептический перевар животной ткани - 10 г,

дрожжевой экстракт - 2 г,

глюкоза - 1 г,

натрия хлорид - 5 г,

натрия бисульфит - 0,1,

натрия сукцинат - 3 г,

L-цистеина гидрохлорид - 0,1 г,

дистиллированная вода - 920 .

Растворяют сухую основу порошка в дистиллированной воде (при использовании готовой основы указанного состава промышленного изготовления количество согласно прописи на этикетке). При необходимости подогревают до кипения для полного растворения частиц. Устанавливают рН при 25°С. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 минут. Остужают до температуры 45°С.

Готовая среда:

Перед использованием в 460  основы асептически добавляют 35  стерильной дефибринированной крови барана, а также растворенное в 5 мл 50%-ного раствора этанола содержимое 1 флакончика с добавкой антибиотиков модифицированной III (по Дойлу). Тщательно перемешивают и разливают в соответствующие емкости, в количествах, необходимых для проведения исследования.

7.2.16. Бульоны Фрейзера для предварительного селективного (первичного) обогащения и селективного (вторичного) обогащения листерий готовят в соответствии с нижеследующей прописью:

Основа среды*:

ферментативный гидролизат казеина - 5,0 г,

пептон - 5,0 г,

мясной экстракт - 5,0 г,

дрожжевой экстракт - 5,0 г,

натрий хлористый - 20,0 г,

калий фосфорнокислый однозамещенный безводный - 1,35 г,

натрий фосфорнокислый двухзамещённый безводный - 12 г,

эскулин - 1,0 г,

литий хлористый - 3,0 г,

железо аммонийное цитрат - 0,25 г.

Растворяют компоненты в 1000  дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН и автоклавируют при 121°С 15 мин. *) - допускается готовить основу среды без добавления эскулина и цитрата железа аммонийного.

Готовые среды:

В зависимости от предназначения среды перед употреблением к 1  основы бульона Фрейзера асептически добавляют селективные компоненты, предварительно растворённые в 10  стерильного раствора гидроокиси натрия с концентрацией
0,2  , в количестве:

Готовые среды разливают в стерильные колбы: бульон Фрейзера для предварительного селективного обогащения - в объёмах, в 9 раз превышающих массу (объём) навески засеваемого продукта; бульон Фрейзера для селективного обогащения - по 90 , и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 6°С не более 3 недель.

8.1.1. Отбор образцов пищевых продуктов для исследований проводят в установленном порядке согласно методам отбора проб по ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ Р ИСО 7218-2008 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям", МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", Инструкции о порядке расследования и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях, М.-1975, а также в соответствии с требованиями нормативных и технических документов на конкретные виды продуктов.

8.1.2. От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной отбирают точечные пробы с помощью стерильных инструментов из разных мест с различной глубины, включая поверхность, небольшими порциями (около 50 г), в которых должны быть представлены все компоненты продукта. Пробы жидких и полужидких продуктов отбирают после тщательного перемешивания. Точечные пробы соединяют в объединённую пробу и перемешивают.

8.1.3. Общая масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования  г (). Допускается раздельное упаковывание и последующее исследование точечных проб.

8.1.4. Пробы, взятые для исследования, помещают в стерильные флаконы, банки с корковыми или ватно-марлевыми пробками или завинчивающимися крышками; пробы в потребительской таре - в новые пакеты из полимерных материалов или плотной бумаги.

Пробы сыпучих продуктов допускается отбирать в стерильные пакеты из нескольких слоев плотной бумаги; суточные пробы блюд - непосредственно в той посуде, в которой они хранились в холодильнике.

Для анализа на наличие микроаэрофильных бактерий рода Campylobacter пробы твердых продуктов отбирают по МУК 4.2.2321-08 в стерильные газонепроницаемые пакеты, пробы жидких продуктов - в герметично закрывающуюся стерильную стеклянную посуду или иные ёмкости и приспособления, ограничивающие доступ кислорода.

8.1.5. Отобранные образцы пломбируют или опечатывают, маркируют в установленном порядке.

8.1.6. Доставка образцов скоропортящихся продуктов в лабораторию осуществляют в термоконтейнерах при температуре не выше 6°С; замороженных продуктов - при температуре, указанной в нормативной или технической документации на продукт. Анализ доставленных образцов проводят по возможности в кратчайшие сроки, но не более чем через 4 часа от момента отбора.

8.2.1. Для предотвращения ингибиции или утраты жизнеспособности патогенной флоры, все манипуляции с пробами пищевых продуктов необходимо осуществлять с учётом биологических особенностей и чувствительности искомых патогенных бактерий к изменениям температуры, рН и редокс-потенциала, воздействию УФ, нагреванию, длительному хранению.

8.2.2. До проведения анализа пробы сохраняют в сухом защищенном от света месте, в том числе образцы скоропортящихся продуктов - при температуре °С, охлаждённых сырых мясных и рыбных продуктов - при температуре °С. После вскрытия упаковки пробы подвергают исследованию немедленно.

8.2.3. Подготовку проб проводят по ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", ГОСТ Р ИСО 7218-2008 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям", а также в соответствии с действующими нормативно-методическими документами на конкретные виды продуктов:

- пробы мяса, включая мясо птицы, субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных продуктов - по ГОСТ Р 51448-99 (ИСО 31002-88) "Мясо и мясные продукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований", ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы бактериологического анализа", ГОСТ Р 52675-2006 "Полуфабрикаты мясные и мясосодержащие. Общие технические условия", ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса", ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц", ГОСТ 7702.2.0-95 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим испытаниям"

- проб молока, молочных и молокосодержащих продуктов - по ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию", ГОСТ Р 53430-2009 "Молоко и продукты переработки молоха. Методы микробиологического анализа", ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приёмки. Методы отбора и подготовки проб к анализу";

- проб рыбы, рыбных и морепродуктов - по ГОСТ 31339-2006 "Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб";

- проб плодоовощной продукции - по ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб"; быстрозамороженных и поверхностно-контаминированных плодоовощных продуктов по "Инструкции по микробиологическому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции" (МЗ СССР 29.09.89);

- проб детского и диетического питания - по МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов";

- проб кремово-кондитерских изделий - по МУК 4.2.762-99 "Методы микробиологического контроля готовых изделий с кремом";

- жировых продуктов - по ГОСТ Р 52179-2003 "Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля" и ГОСТ 30004.2-93 "Майонезы. Правила приёмки и методы испытаний" ГОСТ Р 52969-2008 Масло сливочное. Технические условия; ГОСТ Р 52971-2008 Масло топленое и жир молочный. Технические условия

- напитков - ГОСТ 6687.0-86 "Продукция безалкогольной промышленности. Правила приемки и методы отбора проб". ГОСТ 30712-2001 "Продукты безалкогольной промышленности. Методы микробиологического анализа"

- продуктов и блюд общественного питания - ГОСТ Р 50763-2007 "Услуги общественного питания. Продукция общественного питания, реализуемая населению. Общие технические условия".

8.2.4. Замороженные продукты предварительно размораживают в защищенном от света месте при температуре °С в течение не более 18 часов, или в течение 1 часа в термостате при температуре °С.

Пробы жировых продуктов (топленое масло, молочный жир, спрэды, маргарины, кремы) расплавляют при температуре 40-45°С на водяной бане, перемешивают до получения однородной эмульсии; масло сливочное и мороженое - до сметанообразной консистенции.

8.2.5. Отобранные объединённые образцы доводят до однородной консистенции для суспендирования содержащихся в пробе микроорганизмов; жидкие и порошкообразные перемешивают, твёрдые измельчают в перистальтическом или ножевом гомогенизаторе (при необходимости плотные пробы предварительно измельчают ножницами или добавляют определённые количества соответствующей среды для неселективного или селективного обогащения) с соблюдением требований асептики.

При исследовании на наличие микроаэрофильных бактерий рода Campylobacter продукт измельчают только в перистальтическом гомогенизаторе или в фарфоровой ступке, избегая активного перемешивания; жидкие продукты перемешивают круговыми движениями.

8.2.6. Из суспензии или гомогената готовят навеску необходимой массы в стерильной чашке Петри, в стерильном контейнере с крышкой или бюксе, на куске стерильного пергамента*(4). Если нормативной документацией не предусмотрено иное, для пищевых продуктов и блюд массового потребления масса навески (объём) для анализа на патогены должна составлять  г (), не менее. Величина навески для продуктов детского и диетического питания находится в диапазоне от -  г и должна определяться установленными гигиеническими нормативами.

8.2.7. От подготовленной пробы жировых продуктов отбирают навеску не менее 50 г, которую центрифугируют при 10000-20000 x g (12000-16000 об/мин) в течение 1 мин при охлаждении (допускается проводить центрифугирование при температуре не выше 15°С). Удаляют асептически супернатант и слой жира, исследованию подвергают седимент (осадок).

8.2.8. В кислых или кислотосодержащих (с рН<6,0) пищевых продуктах жидких для предотвращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более рН при посеве доводят рН аналитической навески до стерильными растворами гидроокиси натрия и соляной кислоты перед посевом; в высококислотных продуктах твёрдых - рН доводят до после посева непосредственно в посевной жидкости. Измерения рН проводят в условиях асептики.

8.2.9. Приготовление объединенной пробы, навесок продукта и посев осуществляют в максимально короткие сроки.

8.3.1. Для подращивания находящихся в пищевых продуктах патогенных бактерий и накопления их биомассы подготовленные по п. 8.2. образцы засевают в жидкие питательные среды и инкубируют в соответствии с процедурами обогащения, предусмотренными утверждёнными в установленном порядке методами исследований для конкретных микроорганизмов.

Материалом для дальнейшего исследования в ПЦР служат пробы культуральной жидкости, представляющей собой биомассу искомых микроорганизмов с совокупностью образованных ими продуктов метаболизма в питательных средах для селективного обогащения, полученную при оптимальных для данных микроорганизмов режимах инкубации.

8.3.2. Первичный посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Salmonella проводят в неселективную жидкую среду [5, 8] - ЗПВ (п. 7.1.5.), подогретую до °С, при соотношении навески продукта и среды 1 : 9, не менее. Например, навеску массой 25 г засевают в 225  ЗПВ, 50 г - в 450  ЗПВ и т.п. Инкубируют при этой температуре часа. При исследовании какао и какаосодержащих продуктов используют ЗПВ с обезжиренным молочным порошком (п. 7.1.6.), в которую после 2 часов инкубации добавляют 0,5% водный раствор бриллиантового зелёного из расчёта 3,6  на 1  инокулята.

По истечении инкубации в ЗПВ проводят вторичное обогащение параллельно в двух жидких селективных средах: по п. 7.2.12. (Раппапорта-Вассилиадиса с соей) и одной из двух сред по п. 7.2.10. (селенитовом бульоне) или п. 7.2.13. (Мюллер-Кауфман тетратионатном бульоне), для чего по 1  инокулята в ЗПВ пересевают в 10  каждой из указанных сред. Посевы в среде Раппапорта-Вассилиадиса с соей инкубируют при °С 24 часа, в селенитовом бульоне и Мюллер-Кауфман тетратионатном бульоне при °С 24 часа.

Допускается высевать образцы свежих пищевых продуктов, не содержащих сублетально повреждённых бактерий рода Salmonella в результате сушки, замораживания, непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения, при соотношении продукта и среды 1 : 9, не менее, при тех же режимах инкубации.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость среды Раппапорта-Вассилиадиса с соей и одной из двух сред - селенитового бульона или Мюллер-Кауфман тетратионатного бульона.

8.3.3. Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Shigella проводят непосредственно в среды селективного обогащения - селенитовый бульон в модификации Лейфсона (п. 7.2.10.) и маннитный селенитовый бульон (п. 7.2.11.), используя соотношение 9:1 (среда:материал) по [6, 15]. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18 часов, не более. Дальнейшая инкубация может привести к ингибиции роста бактерий рода Shigella, чувствительных к накоплению кислых продуктов метаболизма.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость обеих вышеуказанных селективных сред.

8.3.4. Первичный посев пищевых продуктов для неселективкого накопления энтеригеморрагических веротоксигенных E.coli, в том числе серотипа 0157:Н7, проводят аналогично посеву на бактерии рода Salmonella, при соотношении навески продукта и среды 1:9, засевая по 25 г пробы в 225  неселективной жидкой среды ЗПВ по п. 7.1.5., подогретой до °С по [3, 14]. Инкубируют при этой температуре часа.

По истечении инкубации в ЗПВ проводят вторичное обогащение, для чего по 1  инокулята пересевают параллельно в пробирки с 10  жидкой селективной среды с лактозой: Кесслер с лактозой по 7.2.7., лактозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью по п. 7.2.8., грам-негативный обогащающий бульон (GN-бульон) по Хайну по п. 7.2.9.

Молочные продукты подлежат посеву только в среду Кесслер с лактозой по 7.2.7.

Посевы термостатируют при °С в течение 18-24 час.

Допускается высевать образцы свежих пищевых продуктов (мясопродукты сырые, молоко-сырьё, цельномолочные продукты, в том числе творог, сыр, плодоовощные продукты), не содержащих сублетально повреждённых веротоксигенных E.coli в результате сушки, замораживания, непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения, при соотношении продукта и среды 1 : 9, не менее, при тех же режимах инкубации.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость любой из вышеуказанных селективных сред.

При необходимости подтверждения отсутствия веротоксигенных штаммов в массе продукта, в которой нормируется отсутствие E.coli (продукты и блюда общественного питания, колбасы и мясопродукты ферментированные), посев производят по [3]. При этом подготовленные по п. 8.2. навески продуктов нормируемой массы или их соответствующие децимальные разведения в ЗПВ засевают непосредственно в пробирки с селективными средами с лактозой по п.п. 7.2.7. или 7.2.8. Посевы просматривают через 18-24 часа инкубации при °С, отмечая образование кислоты и газа из лактозы (при отсутствии признаков роста инкубируют посевы ещё 24 часа), после чего используют для исследования в ПЦР.

8.3.5. Первичный посев пищевых продуктов для детей раннего возраста (молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей I года жизни, подлежащие контролю на наличие Е. (О.) sakazakii согласно [13]) проводят в неселективные жидкие среды: ФБР (п. 7.1.1.3.1.) или ЗПВ (п. 7.1.5.), исходя из соотношения навески продукта и среды 1:10.

К навеске массой  г добавляют 2,7  неселективной среды, подогретой до °С, термостатируют при температуре °С в течение 18-24 часов.

По истечении инкубации в ФБР или ЗПВ проводят вторичное обогащение, для чего по 10  суспензии пересевают в 90  жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae - среду Кесслер с глюкозой (п. 7.2.4.), или глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью (п. 7.2.5.), или бульон Мак-Конки (п. 7.2.6.). Посевы термостатируют при температуре °С в течение часов.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость не менее чем из 2-х указанных выше питательных сред для селективного обогащения.

8.3.6. Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Campylobacter проводят непосредственно в среду селективного обогащения.

К необходимому количеству подготовленной по п.п. 8.1.4. и 8.2.5. пробы добавляют 9-кратный объем селективного бульона Престона (п. 7.2.14.) или селективного бульона Доила (п. 7.2.15.). При исследовании жировых молочных продуктов седимент, приготовленный согласно п. 8.2.7., предварительно растворяют в 10  обогащающего бульона и добавляют к остальному объёму среды. Полученную взвесь инкубируют в течение 4 часов при 37°С (а в случае посевов замороженных продуктов или продуктов, которые хранились более 10 дней, - в течение 3 часов при температуре 32°С и 2 часов при 37°С). Далее температуру инкубации изменяют, и все посевы продолжают инкубировать в течение 18-24 часов при °С.

Инкубация на всех этапах осуществляется в микроаэрофильных условиях в соответствии с [12].

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость любой из вышеуказанных селективных сред.

8.3.7. Первичный посев пищевых продуктов для накопления бактерий L.monocytogenes проводят в бульон Фрейзера для предварительного селективного обогащения (п. 7.2.16.1.). Подготовленную навеску массой 25 г () вносят непосредственно в 225  среды, предварительно прогретой в течение 15 минут при температуре 45°С. Содержимое в колбе встряхивают круговыми движениями руки в радиусе 30 см. При необходимости анализа других масс (объёмов) продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему [4, 9].

Посевы термостатируют при °С в течение часов. В среде предобогащения, содержащий эскулин и цитрат железа аммонийного, отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria, способных к гидролизу гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. На среде без эскулина почернения не наблюдается.

После инкубации продукта в среде для первичного обогащения независимо от наличия или отсутствия признаков роста, в том числе почернения, пересевают 1,0  суспензии в 10  бульона Фрейзера для вторичного селективного обогащения листерий по п. 7.2.16.2., предварительно нагретого до температуры 41°С. Посевы термостатируют при температуре °С в течение часов.

Для исследований в ПЦР используют культуральную жидкость среды (бульона Фрейзера) для вторичного селективного обогащения листерий.

Допускается использовать культуральную жидкость среды (бульона Фрейзера) для первичного селективного обогащения листерий при наличии в нём признаков роста (почернение, помутнение) без проведения этапа вторичного обогащения.

8.4.1. Подготовленные по п.п. 8.3.2.-8.3.7. образцы используют для ПЦР-анализа сразу после окончания инкубации. Для подтверждения жизнеспособности допускается однократное замораживание (сразу после инокуляции в среду обогащения) и хранение образцов культуральной жидкости при температуре минус 20°С на время инкубации парного образца.

8.4.2. При подтверждении жизнеспособности выявляемых патогенных микроорганизмов путём ПЦР-анализа в режиме реального времени (п. 9.2.2.), параллельно с пробами, обогащаемыми в питательных средах, готовят контрольные образцы пищевых продуктов, не подвергающиеся инкубации.

Эти образцы после инокуляции подвергают замораживанию и сохраняют до момента исследования в ПЦР при температуре минус 20°С исследуя впоследствии одновременно с образцами, прошедшими подращивание. Инокуляты образцов, подлежащие подращиванию, направляют на инкубацию, как описано в п.п. 8.3.2.-8.3.7.

8.4.3. Стерильные образцы соответствующих сред для первичного обогащения должны сохраняться для использования в качестве отрицательных контрольных образцов исследования методом ПЦР

8.5.1. При идентификации культур, выделенных из пищевых продуктов согласно утверждённым в установленном порядке методам исследований [3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 14, 15], используют изолированные колонии, характерные для патогенных микроорганизмов, указанных в п. 1.1., полученные на чашках с селективными агаризованными средами после соответствующего обогащения, в том числе для бактерий*(5):

- рода Salmonella - с ксилозализин-дезоксихолатным агаром, висмут-сульфитным агаром, средой Плоскирева, Эндо, Левина, бриллиантовым зелёным агаром;

- рода Shigella - средой Плоскирева, дезоксихолат-цитратным агаром с лактозой и сахарозой, сальмонелла-шигелла (SS) агаром;

- вида E.(Cr.) sakazakii - фиолетово-красным желчным агаром с глюкозой (VRBG agar), средой Эндо;

- серотипа E.coli 0157:Н7 - сорбитол E.coli 0157:Н7 агаром, флуорокульт Е. coli 0157 : Н7 агаром, сорбитол Мак-Конки агаром (SMAC), средой Эндо;

- рода Campylobacter - селективным агаром Престона, угольным селективным агаром для кампилобактерий, колумбийским агаром;

- вида L.monocytogenes - ПАЛКАМ-агаром (полимиксин-акрифлавин-лития хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол агаром), оксфордским агаром, ПАЛ-агаром.

8.5.2. Не менее 3-х характерных колоний для бактерий родов Salmonella, Shigella, серотипа E.coli 0157:Н7, вида L.monocytogenes отбирают с одной или нескольких указанных в п. 8.4.1. селективных сред, производят посев штрихом на поверхность плотных питательных сред МПА или ТСАДЭ п. 7.2.3. в отдельных чашках Петри, или в пробирки с жидкими средами (МПБ или триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом) и инкубируют в течение 18-24 часов при °С.

Изоляты, предположительно относящиеся к роду Campylobacter, засевают на поверхность кровяного колумбийского агара или в бульон для бруцелл и инкубируют при °С в течение 24-48 часов в микроаэрофильной атмосфере.

Изоляты, предположительно относящиеся к E.(Cr.) sakazakii, пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25°С в течение 72 часов.

8.5.3. При необходимости культуры могут быть представлены на исследование в пробирках на агаризованной среде в соответствии с СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности". В указанном случае производят проверку штамма на чистоту путём микроскопирования, пересевают в пробирки с жидкими средами (ТСБДЭ) или другими средами, предназначенными для обогащения данного патогена, и инкубируют в течение 24 часов при °С.

8.5.5. Суточные культуры, полученные по п. 8.4.2. на плотных питательных средах, смывают с поверхности агара небольшим количеством стерильного физиологического раствора (или снимают петлёй) и переносят в стандартную пробирку. Концентрацию бактериальных клеток в суспензии проверяют по оптическому стандарту МакФарланда, либо ден-ситометрически на приборах, откалиброванных также по шкале МакФарланда (плотность суспензии должна составлять не менее 1,5-2,0 ед. по шкале Макфарланда). При использовании отраслевого стандарта для визуальной оценки мутности ГИСК им.Л.А. Тарасевича расчетная концентрация клеток в пробе должна составлять не менее 107 .

Аналогичным образом устанавливают плотность культур на жидких средах. Содержимое пробирки тщательно перемешивают на гомогенизаторе типа "вортекс" для получения гомогенной суспензии.

Для исследований в ПЦР используют подготовленные указанным образом взвеси микроорганизмов или бульонные культуры, содержащие не менее , которые подвергают дальнейшим манипуляциям для выделения ДНК. Подготовленные образцы используют для анализа в тот же день.

8.6.1. Образцы пищевых продуктов, предназначенные к исследованию в нативном виде при расследовании вспышек пищевых бактериальных отравлений и инфекций с пищевым путём передачи (в соответствии с п. 3.4.), подлежат первичной обработке в зависимости от консистенции: путём концентрирования (для жидких продуктов) или перевода в жидкую фазу с последующим концентрированием (для сухих или твёрдых продуктов) по [15, 11].

8.6.2. Концентрирование образцов жидкой консистенции объёмом до 50  путём центрифугирования проводят в условиях асептики по одному из двух режимов:

а) одномоментно при 6000 об/мин в течение минут,

б) дробно при 1000 об/мин в течение 5 минут для осаждения крупных частиц и при 6000 об/мин в течение 15 минут.

По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 5  фосфатного буферного 0,9% раствора NaCl (п. 7.1.1.3.2.), ресуспендируют.

Для проведения экстракции ДНК отбирают 1  взвеси в отдельную пробирку; оставшаяся часть подготовленной пробы используется для посева на питательные среды.

8.6.3. Концентрирование образцов жидкой консистенции объёмом до 50  фильтрацией проводят в 2 этапа:

1) для освобождения от крупных частиц во избежание засорения мембранных фильтров - с использованием стерилизованных ватно-марлевых или бумажных фильтров,

2) через мембранные фильтры N 3 с величиной пор 600-800 нм.

Для фильтрования через мембранные фильтры используют предварительно простерилизованные фильтровальные аппараты, подключенные к вакуумному насосу, или фильтрующие устройства шприцевого типа соответствующей ёмкости.

Перед началом фильтрования мембранные фильтры проверяют на отсутствие дефектов, и в случае необходимости двукратно кипятят в дистиллированной воде по 10-15 минут. С соблюдением правил асептики фильтры закрепляют в аппарате матовой стороной вверх. Фильтрование проводят дробно, пропуская через каждый фильтр не более 25  жидкости, подвергнутой на 1 этапе фильтрации через ватно-марлевый или бумажный фильтр.

После окончания фильтрации, фильтрат удаляют, а все использованные фильтры переносят в стерильную чашку Петри, бюкс, измельчают стерильными ножницами и заливают 5-6  стерильного изотонического раствора натрия хлористого для десорбции бактерий.

Из полученного смыва отбирают 1  в отдельную пробирку для экстракции ДНК; оставшаяся часть подготовленной пробы используется для посева на питательные среды.

8.6.4. Пробы пищевых продуктов твёрдой консистенции и сухих переводят во взвешенное состояние в жидкости для суспендирования содержащихся в них микроорганизмов. Для этого образцы массой 25-50 г в условиях асептики предварительно измельчают ножницами, растирают в фарфоровой ступке или в гомогенизаторе при добавлении ФБР (п. 7.1.1.3.1.) или стерильной деионизированной воды в соотношении
1 : 10 или 1 : 5 для получения 10-20% концентрации продукта. Доводят до гомогенного состояния.

Полученную суспензию отстаивают 3-10 минут для осаждения грубых частиц, жидкую фазу центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут.

Если полученный осадок вязкий, из него отбирают 1  для экстракции ДНК в отдельную пробирку и не менее 2  - для посева на питательные среды; если плотный - предварительно ресуспендируют в 0,2-0,5  стерильной деионизированной воды.

8.6.5. Подготовленные по п.п. 8.5.2.-8.5.4. образцы хранению не подлежат и используются для экстракции ДНК сразу после окончания пробоподготовки.

9.1.1. При работе в зоне подготовки и выделения нуклеиновых кислот из проб, содержащих патогенные биологические агенты, необходимо строго соблюдать правила техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены: работают только в боксированном помещении или в боксе биологической безопасности II класса, используют одноразовые перчатки, используют и меняют при каждой операции одноразовые наконечники для дозаторов с аэрозольным барьером. Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) обеззараживают в специальном контейнере с дезинфицирующим 0,2% раствором ДП-2Т.

9.1.2. Экстракция ДНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии неконкурентного внутреннего контрольного образца ("ВКО") на основе рекомбинантной ДНК, для контроля правильности (точности) этапов выделения и амплификации ДНК.

9.1.3. В качестве отрицательного контроля ("ОК") этапа экстракции ДНК из культуральной жидкости, используют стерильный образец питательной среды для обогащения исследуемого продукта, предварительно протестированный на отсутствие ДНК искомых патогенных бактерий; из проб нативных продуктов - стерильный изотонический раствор натрия хлористого или ФБР для десорбции бактерий. При наличии спорных или невалидных результатов ПЦР используют ОК этапа выделения из набора реагентов.

9.1.4. Экстракцию ДНК из культуральной жидкости, взвесей микроорганизмов и бульонных культур, подготовленных по п.п. 8.3. и 8.5., проводят без дополнительной обработки, применительно к используемым наборам реагентов и в соответствии с утверждёнными в установленном порядке инструкциями [1, 2].

9.1.5. Допускается проводить экстракцию ДНК из проб нативных пищевых продуктов по п. 9.1.4.1. настоящих МУК или по п. 6.2. МУК 4.2.2304-07 [10]. При повышенном содержании жиров перед экстракцией ДНК проводят дополнительную обработку пробы суспензией неполярных растворителей с водой для перевода содержащейся в пищевом продукте ДНК в водную фазу, в которой и производится дальнейшая очистка.

9.2.1. При положительных результатах ПЦР-анализа образцов исследуемых нативных пищевых продуктов и культуральной жидкости от посева пищевых продуктов в среды обогащения (обнаружение ДНК искомых патогенных бактерий) должна подтверждаться жизнеспособность выявленных микроорганизмов. Оценка жизнеспособности микроорганизмов проводится параллельно с основным исследованием в обоих предусмотренных вариантах ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (FEP и FRT):

9.2.2. Оценку жизнеспособности патогенных бактерий при осуществлении варианта ПЦР в режиме "реального времени" (FRT) допускается проводить путём одновременного исследования двух образцов культуральной жидкости, подготовленных по п. 8.3.9. Интерпретация и оценка результатов проводится по п. 10.4.

9.2.3. При исследовании штаммов чистых культур по п. 8.4. подтверждение жизнеспособности не требуется.