Методические указания МУК 4.2.2963-11 "Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 19 августа 2011 г.)

4.2. Методы контроля. биологические и микробиологические факторы

Методические указания
МУК 4.2.2963-11
"Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 19 августа 2011 г.)

Дата введения: с момента утверждения
Введены впервые

1. Область применения

1.1. Методические указания определяют схемы выделения из клинического материала и пищевых продуктов трех групп эшерихий, продуцирующих шига-токсины, и их идентификацию: a) E.coli О104:Н4, эпидемического штамма, вызвавшего вспышку STEC-инфекции в Германии и других странах весной 2011 года б) E.coli О157:H7/О157:H-, основного представителя группы энтерогеморрагических эшерихий; и в) энтерогеморрагических эшерихий, не относящихся к серовару E.coli О157:H7"

Ключевым поражающим фактором этих трех групп эшерихий являются шига-токсины - Stx1 и Stx2.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и других организаций, независимо от их организационно-правовой формы, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на работу с микроорганизмами I - IV групп патогенности.

2. Нормативно-методические документы

В настоящих методических указаниях использованы ссылки и положения следующих документов:

2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.

2.2. Закон Российской Федерации от 07.02.1992 г. N 2300-I "О защите прав потребителей".

2.3. Федеральный закон от 02.01.2000 г. N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых продуктов".

2.4. "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.

2.5. Приказ Минздрава СССР от 24.04.1985 N 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений".

2.6. "Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)", утвержденные Решением Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 года N 299.

2.7. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

2.8. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

2.9. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней и СП 1.3.2885-11 "Дополнения и изменения N 2 к СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

2.10. СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность".

2.11. МУК 4.2.992-00 "Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157:Н7".

2.12. МУК 4.2.2812-11, Москва, 2011, "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией".

2.13. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации НК при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".

2.14. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия): Методические рекомендации. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 23 с.

2.15. Методические указания "МУ N 04-723/3 от 17.12.84 г. "По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями".

2.16. ГОСТ Р 52816-2007 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)".

2.17. ГОСТ Р 53430-2009 "Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа".

2.18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц".

2.19. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического анализа".

2.20. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленного мяса. Правила приемки и методы испытания".

ГАРАНТ:

Приказом Ростехрегулирования от 27 декабря 2006 г. N 446-ст применение ГОСТ 4288-76 прекращено на территории РФ с 1 января 2008 г в связи с утверждением и введением в действие ГОСТ Р 52675-2006

Приказом Росстандарта от 12 июля 2011 г. N 180-ст применение ГОСТ 4288-76 в части пункта 2.11 прекращено на территории РФ с 1 января 2013 г. в связи с утверждением и введением в действие ГОСТ Р 54354-2011 "Мясо и мясные продукты. Общие требования и методы микробиологического анализа"

2.21. ГОСТ Р 50396.0-92 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям".

ГАРАНТ:

Приказом Росстандарта от 29 июля 2013 г. N 460-ст взамен ГОСТ Р 50396.0-92 с 1 июля 2014 г. утвержден ГОСТ Р 50396.0-2013 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям"

2.22. ГОСТ 7702.2.2-93 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек".

2.23. ГОСТ Р ИСО 7218-2008 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

3. Общие положения

3.1. Острые кишечные инфекции с проявлениями геморрагического колита (ГК) и гемолитикоуремического синдрома (HUS), вызываемые эшерихиями, продуцирующими шигатоксины (STEC), распространены во многих странах мира и регистрируются в виде спорадических случаев или вспышек с охватом больших количеств людей: от десятков до нескольких тысяч.

Среди штаммов E.coli особое значение имеют патогенные штаммы, синтезирующие веротоксины (шигаподобные токсины). Выделяется группа энтерогеморрагических штаммов E.coli (EHEC) с высокопатогенными сероварами О157:Н7, О26, О103, О111, О145 и др. Продукция веротоксинов является наиболее общим критерием для определения данной группы бактерий. Веротоксины можно классифицировать по основным группам: веротоксины 1 (VT1, SLT1, Stx1) и веротоксины 2 (VT2, SLT2, Stx2). Штаммы ЕНЕС способны продуцировать либо только токсины первой (VT1) или второй группы (VT2), либо обе группы токсинов (VT1) и (VT2) одновременно.

Резервуаром данной инфекции являются крупный рогатый скот, козы и овцы. Загрязнение пищевых продуктов происходит в процессе их приготовления при неудовлетворительном состоянии гигиены на производстве, а также при недостаточной термической обработке продуктов.

3.2. Люди заболевают STEC-инфекциями после употребления недоброкачественных мясных продуктов, непастеризованного молока, йогуртов, сыра, овощей, шпината, разных салатов, пророщенных зерен бобовых, соков, других пищевых продуктов и воды, обсемененных STEC-бактериями. Возможно заражение людей при контакте с сельскохозяйственными и домашними животными, а также при непосредственном контакте с больными STEC-инфекцией. Штаммы ЕНЕС представляют серьезную угрозу жизни особенно для пожилых людей и детей до 5 лет.

Наиболее частый путь распространения инфекции - фекально-оральный.

Инкубационный период при STEC-инфекции - в среднем от трех до восьми дней.

Основными клиническими симптомами при STEC-инфекциях являются острые абдоминальные боли, диареи, часто с кровью (геморрагический колит), рвота, тошнота, температура может быть незначительно повышена. Большинство заболевших выздоравливает в течение 5 - 10 дней без каких-либо осложнений. У части больных (до 30%) спустя неделю после начала диареи может развиться гемолитико-уремический синдром (HUS). Основные симптомы HUS - снижение частоты мочеиспускания, чувство сильной усталости, анемия кожи и слизистых. У больных с HUS развивается острая почечная недостаточность, гемолитическая анемия и тромбоцитопения. Лечение больных с HUS для клиницистов является непростой задачей, поскольку антимикробная терапия STEC-инфекций пока не разработана. Смертность среди больных HUS высокая и колеблется от 3 до 30%. У переболевших людей может отмечаться непродолжительный период бактерионосительства.

3.3. Настоящие методические указания определяют алгоритм выделения из клинического материала и пищевых продуктов и идентификации эшерихий, продуцирующих веротоксины (шигаподобные токсины): а) серовара О104:Н4, возбудителя эпидемической вспышки геморрагического колита и HUS в Германии и других странах весной 2011 года; б) энтерогеморрагического серовара ; и в) сероваров, "не относящихся к О157:Н7".

Выделение указанных патогенов проводят на дифференциально-диагностических питательных средах с последующим исследованием чистых культур в реакции латексной агглютинации (РЛА), или методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле, или их дальнейшей идентификацией на иммунохроматографическом тесте с применением питательного бульона для индукции синтеза веротоксинов (содержащий индуктор синтеза веротоксинов - карбадокс).

3.4. Серовар является доминирующим представителем энтерогеморрагической группы эшерихий, наиболее часто вызывающих геморрагический колит и HUS у людей во многих странах мира.

Источником и основным резервуаром этого патогена являются сельскохозяйственные животные: крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи и птица, а также дикие животные. Носительство этого серовара среди сельскохозяйственных животных в России составляет от 2 до 3 процентов.

По культурально-морфологическим свойствам штаммы серовара - типичные представители вида E.coli, но имеют некоторые биохимические особенности: не образует -Д-глюкоронидазу и не ферментирует многоатомный спирт сорбитол. Эти свойства патогена используют при его выделения из клинического материала и пищевых продуктов.

Основными факторами патогенности серовара являются веротоксины (шигаподобные токсины) Stx1 и Stx2 (или только Stx2), белок интимин, ответственный за адгезию возбудителя к эпителиальным клеткам кишечника, энтерогемолизин и жгутиковый антиген Н7. Перечисленные факторы патогенности детерминируются соответственно генами stx1, stx2, еае, hly и flic. Указанные гены, а также rfb гены, ответственные за синтез соматического О антигена, являются основными генами-мишенями для диагностических ПЦР-тест-систем, используемых при идентификации серовара E.coli .

3.5. Причиной геморрагического колита и HUS у человека, помимо серовара , могут выступать энтерогеморрагические эшерихии других серологических О-групп, хотя их удельный вес в структуре STEC-инфекций значительно меньше, чем серовара . В настоящее время уже насчитывается более 25 таких сероваров E.coli. Среди этой группы STEC-патогенов чаще всего от больных выделяют эшерихии серогрупп О26, О111, О55, О103, О45, О121, О113, О117 и О145.

Группа этих возбудителей, в отличие от серовара , не имеет каких-либо фенотипических маркеров, которые можно было бы использовать в качестве селективных при высеве анализируемых образцов на питательные среды. Это обстоятельство значительно затрудняет выделение и идентификацию возбудителей геморрагического колита и HUS, "не относящихся к О157:Н7".

В геноме этой группы патогенов, как правило, обнаруживают гены синтеза интимина - еае и гены веротоксинов (шигаподобных токсинов) - stx1 и stx2 (либо только stx1 или stx2). Поэтому реально диагностировать группу STEC штаммов "не относящихся к О157:Н7", возможно либо только по обнаружению у них способности продуцировать шига-токсины, либо по индикации у них генов stx1 и stx2.

3.6. Серовар E.coli O104:H4, явившийся причиной крупной эпидемической вспышки геморрагического колита и тяжелых случаев HUS в Германии и других странах Европы весной - летом 2011 года, и охватившей более 4000 человек, по своим культуральным, биохимическим и другим фенотипическим свойствам является типичным представителем вида E.coli. Однако его генотип существенно отличается от генотипа "классического" представителя группы энтерогеморрагических эшерихий - E.coli : он не содержит генов интимина (еае), вероцитотоксинов (шигаподобных токсинов) 1-го типа (Stx1) и энтерогемолизина. Его геном на 93% идентичен геному штамма E.coli 55989, относящемуся к группе энтероаггрегативных эшерихий (ЕАЕС), возбудителей диареи у человека, выделенному в Центральной африканской республике. Однако в отличие от энтероаггрегативных штаммов в геноме штамма E.coli О104:Н4 присутствует ген синтеза веротоксина (шигаподобного токсина) 2-го типа (Stx2), то есть генотип этого высоковирулентного для человека штамма вобрал в себя факторы патогенности энтероаггрегативных эшерихий (способность к аггрегации и образованию биопленки на слизистой кишечника) и энтерогеморрагических (способность к синтезу веротоксина (шигаподобного токсина) Stx2 - основного фактора, обусловливающего HUS у человека). Кроме того, эпидемический штамм E.coli O104:H4 характеризуется широким спектром устойчивости к антибактериальным препаратам: к бета-лактамам - ампициллину, амоксициллину/клавулонату, пиперациллину/сульбактаму, пиперациллину/тазобактаму, цефуроксину, цефуроксиму, цефокситину, цефотаксиму, цефтазидиму, цефподоксиму, а также к стрептомицину, налидиксовой кислоте, тетрациклину и триметоприму/сульфаметоксазолу. Устойчивость к бета-лактамам обусловлена присутствием в геноме штамма бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) - СТХ-М-15 и ТЕМ-1. Наличие у штамма E.coli O104:H4 маркеров резистентности к антибиотикам может быть использовано при его выделении из клинического материала и пищевых продуктов.

4. Правила сбора клинического (секционного) материала

Взятие материала от клинически больных и контактных и его доставка в лабораторию для исследования осуществляется в соответствии с МУК 4.2.992-00 "Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157:Н7" и МУ N 04-723/3 от 17.12.84 г. "По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями".

4.1. Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактического учреждения, обученный требованиям и правилам биологической безопасности при работе и сборе материала, подозрительного на зараженность энтерогеморрагическими эшерихиями (STEC-культуры) E.coli O104:H4. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры, стерильными инструментами. Все виды работ проводят с соблюдением противоэпидемического режима, согласно СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

4.2. Процедуры по забору клинического материала обученный медицинский персонал осуществляет в резиновых перчатках. После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками в соответствии с СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

От одного больного должно забираться не менее трех видов клинического материала. Обязательно следует забирать пробы фекалий, промывные воды из желудка. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

Для постмортальной диагностики используют аутоптаты желудка, тонкого и толстого кишечника, печени, селезенки, красного костного мозга.

4.3. Сбор материала производят в пробирки с транспортной средой, предоставляемой (или рекомендуемой) фирмой-производителем тест-систем.

5. Упаковка и транспортирование образцов

5.1. Все материалы, доставляемые в лабораторию, должны быть герметично упакованы в соответствии с СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности" и настоящих методических указаний:

1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, парафильм и др.); емкость маркируют;

2) в полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять;

5.1.1. Образцы от одного пациента могут быть упакованы в один полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывание образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.

5.1.2. В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименование направляющего учреждения, ФИО больного, возраст, место жительства, предварительный диагноз, эпидемиологический анамнез, вид материала, дата и время взятия материала.

5.2. Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий плотно закрывающийся контейнер (термос), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

5.2.1. В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения.

5.3. Транспортирование проб клинического материала в референс-лаборатории, лаборатории центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации и лаборатории учреждений противочумной системы Роспотребнадзора осуществляется нарочным(и), информированным о правилах доставки материала в соответствии с п. 3.4. СП 1.2.036-95.

6. Выделение и идентификация эпидемического штамма E.coli О104:Н4 из клинического материала и пищевых продуктов

6.1. Выделение и идентификация E.coli О104.Н4 из клинического материала

6.1.1. Исследование материала

Первый день исследований.

1) Исследуемый материал засевают на дифференциально-диагностические плотные питательные среды МакКонки и Левина с антибиотиками: цефотаксимом (25 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (4 мкг/мл), селективный агар с сорбитолом, а также на жидкие питательные среды: питательную среду для выделения и идентификации энтеробактерий - SDS-бульон, Мак-Конки-бульон или питательную среду для предварительного обогащения бактерий семейства Enterobacteriaceae - среду N 11 с теми же антибиотиками: цефотаксимом (25 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (4 мкг/мл).

Посевы инкубируют при 37°С в течение 18 - 24 часов.

Посевы на плотные среды производят таким образом, чтобы получить изолированный рост колоний кишечной палочки.

Приготовление указанных выше сред с антибиотиками см. в Приложении 1.

Второй день исследований.

1) Со сред МакКонки и Левина с антибиотиками отсевают по 10 типичных для E.coli колоний на отдельные сектора питательного агара (среда N 1 - ГРМ, СПА или аналог), разлитого в чашки Петри (по 10 изолятов на одну чашку). Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

2) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, на селективном агаре с сорбитолом, с последующим индукцией синтеза веротоксинов на питательном бульоне, содержащий индуктор синтеза веротоксинов - карбадокс, с дальнейшим определением веротоксинов с помощью иммунохроматографических экспресс-тестов для определения энтерогеморрагических E.coli. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2). При получении положительных результатов в иммунохроматографическом тесте дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце энтерогеморрагических кишечных палочек.

3) Проводят анализ культур, выросших на бульоне с антибиотиками, с помощью диагностической мультиплексной ПЦР-тест-системы, предназначенной для индикации клеток штамма E.coli O104:H4 по наличию в генов rfb, stx2 и flic. Подготовку образца для анализа и постановку ПЦР проводят в соответствии с Инструкцией по ее применению (см. Приложение 3).

При получении положительных результатов в ПЦР дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце клеток штамма E.coli О104:Н4.

4) Проводят высев культур микроорганизмов, выросших на SDS-бульоне и других бульонах, на чашки Петри со средами МакКонки и Левина, содержащих цефотаксим (25 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (4 мкг/мл), селективный агар с сорбитолом с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии E.coli. Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

Третий день исследований.

1) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, селективном агаре с сорбитолом, с последующим индукцией синтеза веротоксинов на питательном бульоне, содержащий индуктор синтеза веротоксинов - карбадокс и определении веротоксинов с помощью иммунохроматографических экспресс-тестов для определения энтерогеморрагических E.coli.. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2). При получении положительных результатов в иммунохроматографическом тесте дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце энтерогеморрагических кишечных палочек.

2) Используя антительную латексную тест-систему для индикации эшерихий серогруппы О104, в реакции латексной агглютинации (РЛА) среди 20 выросших на питательном агаре изолятов проводят поиск культур серогруппы О104. Постановку РЛА проводят согласно Инструкции по ее применению (см. Приложение 4). Давшие положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом изоляты в этот же день анализируют с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы согласно инструкции по ее применению (см. Приложение 3). Одновременно у культур, которые по результатам РЛА были отнесены к серогруппе О104, изучают биохимические свойства и определяют у них чувствительность к антибиотикам (см. Приложение 5).

3) Проводят пересев 20 типичных для E.coli изолятов, выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, селективном агаре с сорбитолом (после пересева культур со сред обогащения - SDS-бульона и др.) на отдельные сектора чашек Петри с питательным агаром (по 10 изолятов на чашку).

Четвертый день исследований.

1) В случае, если при положительном иммунохроматографическом тесте, ПЦР-анализе в культурах изолятов, полученных прямым высевом из образца (см. Второй день исследований, п. 1.) и давших положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом (см. Третий день исследований, п. 1.) и, были обнаружены культуры, продуцирующие веротоксин, или были идентифицированы гены rfb, stx2 и flic, специфичные для эпидемического штамма E.coli О104:H4, и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении эпидемического штамма E.coli O104:H4 в анализируемом образце. В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, а изолированные культуры E.coli O104:H4 пересылают для дальнейшего их изучения в референс-центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора) и референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней ФГУЗ "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора) (далее референс-центры) с учётом оптимальной транспортной схемы.

В том случае, если ни один из 20 изолятов, полученных при прямом высеве анализируемого материала на среды МакКонки и Левина с антибиотиками, на селективный агар с сорбитолом не дали положительную реакцию на наличие энтеротоксинов, определяемых в экспрессном иммунохроматографическом тесте, не дали положительную реакцию в РЛА и ПЦР-исследовании, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

2) Продолжают работать с 20 изолятами, полученными со сред обогащения (см. Третий день исследований, п. 1.). У изолятов определяют наличие веротоксинов после инкубации на питательном бульоне, содержащий индуктор синтеза веротоксинов - карбадокс (и далее тестируют с помощью иммунохроматографических экспресс-тестов, изучают серологические свойства в РЛА, предназначенной для идентификации серогруппы E.coli О104.

В случае обнаружения изолятов, давших положительную реакцию на наличие веротоксинов в иммунохроматографическом тесте, положительную реакцию агглютинации в РЛА, их анализируют в ПЦР для обнаружения в геноме исследуемых изолятов специфических для E.coli О104:Н4 генов rfb, stx2 и flic. У этих же изолятов изучают биохимические свойства и чувствительность к антибиотикам.

Пятый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах изолятов, давших положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, stx2 и flic, специфичные для штамма E.coli O104:H4, а культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении эпидемического штамма E.coli O104:H4 в анализируемом образце.

В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, образец уничтожают, а изолированные культуры E.coli O104:H4 пересылают для дальнейшего их изучения в референс-центры.

В том случае, если ни одна из 20 культур, полученных со сред обогащения, не была отнесена к серогруппе О104, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

Делается заключение об отсутствии в исследуемом материале эпидемического штамма Е.coli О104:Н4.

6.2. Выделение и идентификация E.coli О104.H4 из пищевых продуктов

6.2.1. Взятие материала и пересылка его для лабораторного исследования

При отборе и подготовке образцов различных видов пищевых продуктов к исследованию руководствуются МУК 4.2.2812-11, Москва, 2011, "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией".

6.2.2. Исследование материала

Выделение культур E.coli O104:H4 из исследуемых образцов пищевых продуктов и их последующую идентификацию с помощью имунохроматографических экспресс-тестов на веротоксины, реакции латексной агглютинации (РЛА) и мультиплексной ПЦР, определение биохимических свойств и чувствительности культур к антибиотикам проводят по той же схеме, как и в случае исследования клинических образцов (см. п. 6.1.).

6.3. Схема выделения и идентификации E.coli O104:H4

7. Выделение и идентификация эпидемического штамма E.coli из клинического материала и пищевых продуктов

7.1. Выделение и идентификация E.coli из клинического материала

7.1.1. Исследование материала

Первый день исследований.

1) Исследуемый материал засевают на среду для выделения и дифференциации E.coli - Сорбитол-E.coli О157:Н7-агар или Мак-Конки сорбитол агар и параллельно на обычный агар Эндо или МакКонки агар, а также на жидкие питательные среды - SDS-бульон и др.

Прямой высев анализируемого образца на Сорбитол E.coli О157:Н7-агар или идентичные среды необходимо производить не менее чем на три чашки Петри с таким расчетом, чтобы на пластинках среды вырастали десятки, сотни изолированных колоний микроорганизмов. Получение большого количества колоний на дифференциальной среде повышает вероятность обнаружения и выделения серовара E.coli .

Посевы инкубируют при 37°С в течение 18 - 24 часов.

Второй день исследований.

1) Среди выросших колоний на Сорбитол-E.coli О157:Н7-агаре отбирают неокрашенные сорбитолнегативные колонии, характерные для E.coli О157:Н7, и засевают их на отдельные сектора в чашки Петри с питательным агаром. При наличии большого количества неокрашенных колоний необходимо отсеять не менее 20 изолятов (по 10 на чашку). Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

2) С помощью иммунохроматографических экспресс-тестов определения E.coli или иммунохроматографических экспресс-тестов для определения энтерогеморрагических E.coli проводят анализ культур, выросших на твёрдых питательных средах. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографических экспресс тестов проводят в соответствии с инструкцией по их применению (см. Приложение 6).

3) С помощью мультиплексной ПЦР (набор "ТЭК-О157" или аналоги), предназначенной для индикации клеток E.coli по наличию в них генов rfb, eae, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2), проводят анализ смеси культур, выросших на SDS-бульоне или других жидких средах. Подготовку образца для анализа и постановку ПЦР проводят в соответствии с Инструкцией по ее применению (см. Приложение 7).

При получении положительных результатов иммунохроматографических экспресс-тестов или в ПЦР-исследовании дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце клеток энтерогеморрагического серовара E.coli .

3) Проводят пересев культур микроорганизмов, выросших на жидких средах, на чашки Петри со средой Сорбитол-E.coli О157:Н7-агар, (по три чашки из каждой среды) с таким расчетом, чтобы получить десятки и сотни изолированные колонии микроорганизмов. Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

Третий день исследований.

1) Используя иммунохроматографические экспресс-тесты определения E.coli , антительную латексную тест-систему для индикации E.coli серогруппы О157, в реакции латексной агглютинации (РЛА) среди выросших на питательном агаре изолятов, полученных из неокрашенных сорбитолнегативных колоний (взятых после прямого посева образца с Сорбитол-E.coli О157:Н7-агара, проводят поиск культур E.coli серогруппы О157. Постановку РЛА проводят согласно Инструкции по ее применению (см. Приложение 8). Давшие положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс-тестах определения E.coli или реакции агглютинации с латексным диагностикумом культуры в этот же день анализируют с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы. Одновременно у культур, которые по результатам РЛА были отнесены к серогруппе О157, изучают биохимические свойства.

2) Производят пересев сорбитолнегативных неокрашенных колоний, выросших на Сорбитол-E.coli О157:Н7-агаре или идентичных средах (после пересева культур со сред обогащения), на отдельные сектора пластинок питательного агара, разлитого в чашки Петри. При наличии на Сорбитол-E.coli О157:Н7-агаре большого количества сорбитолнегативных колоний необходимо отсеять для последующих исследований не менее 20 изолятов (по 10 колоний на чашку).

Четвертый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах изолятов, выделенных прямым высевом анализируемого образца на Сорбитол-E.coli О157:Н7-агар и давших положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс-тестах для определения E.coli или агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, eae, stx1 и stx2 (или только stx1 или stx2), специфичные для серовара E.coli , и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении в анализируемом материале клеток энтерогеморрагического серовара E.coli . В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, а изолированные культуры E.coli пересылают для дальнейшего их изучения в референс-центры.

В том случае, если ни один из изолятов, полученных при прямом высеве анализируемого материала на Сорбитол-E.coli О157:Н7-агар, не дал положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс-определения E.coli или РЛА, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

2) У сорбитолнегативных изолятов, полученных со сред обогащения (см. Третий день исследований, п. 2.), определяют принадлежность к E.coli на иммунохроматографических экспресс-тестах, изучают серологические свойства в РЛА, предназначенной для идентификации E.coli серогруппы О157.

В случае обнаружения изолятов, давших положительную реакцию на иммунохроматографических экспресс-тестах, положительную реакцию агглютинации в РЛА, их анализируют в ПЦР для обнаружения в их геноме специфических для E.coli генов rfb, eae, stx1 и stx2 (или только stx1 или stx2). У этих же изолятов изучают биохимические свойства.

Пятый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах изолятов, давших положительную реакцию на иммунохроматографических экспресс-тестах, положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, eae, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2), специфичные для E.coli , и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении штамма E.coli в анализируемом образце.

В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, образец уничтожают, а изолированные культуры E.coli пересылают для дальнейшего их изучения в референс-центры.

В том случае, если ни один из изолятов, полученных со сред обогащения, не был отнесен к серогруппе О157, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

Делается заключение об отсутствии в исследуемом материале бактерий энтерогеморрагического серовара E.coli .

7.2. Выделение и идентификация E.coli из пищевых продуктов

7.2.1. Взятие материала и подготовка его для лабораторного исследования

При отборе и подготовке образцов различных видов пищевых продуктов к исследованию руководствуются МУК 4.2.2812-11, Москва, 2011, "Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией", МУК 4.2.992-00 "Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157:Н7" и МУ N 04-723/3 от 17.12.84 г. "По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями".

7.2.2. Исследование материала

Выделение культур E.coli из исследуемых образцов и их последующую идентификацию с помощью иммунохроматографических экспресс-тестов, реакции латексной агглютинации (РЛА) (для обнаружения серогруппы О157) и мультиплексной ПЦР-тест-системы, определение биохимических свойств культур проводят по той же схеме, как и в случае исследования клинических образцов (см. п. 5.1.).

7.3. Схема выделения и идентификация E.coli

8. Выделение и идентификация энтерогеморрагических E.coli, "не относящихся к E.coli О157:Н7-" из клинического материала и пищевых продуктов

8.1. Выделение и идентификация E.coli, "не относящихся к E.coli О157:Н7" из клинического материала

8.1.1. Исследование материала

Первый день исследований.

1) Исследуемый материал засевают на три чашки Петри с питательной средой для выделения энтеробактерий - агар Эндо, селективный агар Мак Конки с сорбитолом и на среды для предварительного обогащения энтеробактерий - SDS-бульон, МакКонки-бульон или среду N 11.

Высев материала на дифференциально-диагностические плотные среды производят с таким расчетом, чтобы в каждой чашке или в сумме на трех чашках получить не менее 100 изолированных колоний энтеробактерий.

Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

Второй день исследований.

1) Просматривают результаты посевов на дифференциально-диагностических средах и оценивают морфологию выросших изолированных колоний энтеробактерий (определяют морфотип колоний). Затем на чашки Петри с питательным агаром засевают по три - пять колоний каждого морфотипа (на отдельные сектора среды). Число отсеянных изолятов при любом количестве морфотипов не должно быть менее 20. Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

2) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, селективном агаре МакКонки с сорбитолом, с помощью иммунохроматографических экспресс-тестов для определения энтерогеморрагических E.coli. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2).

3) Используя мультиплексную ПЦР-тест-систему, проводят анализ смеси культур энтеробактерий, выросших на жидких накопительных средах (SDS-бульон, среда N 11), на присутствие в них энтерогеморрагических эшерихий, "не относящихся к E.coli О157:H7". Идентифицируют такие эшерихии на основании обнаружения в смеси энтеробактерий генов еае, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2). Ген rfb, определяющий синтез антигена О157, в этой группе патогенов не обнаруживается. Следует также учитывать, что в отдельных случаях у энтерогеморрагических культур, "не относящихся к E.coli О157:H7", может не обнаруживаться и ген еае.

При получении положительных результатов иммунохроматографических экспресс-тестов для определения энтерогеморрагических E.coli, в ПЦР (обнаружение генов еае, stx1, stx2) дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце клеток энтерогеморрагических эшерихий, "не относящихся к E.coli О157:H7".

3) Производят высев культур энтеробактерий, выросших на жидких накопительных средах (SDS-бульон, среда N 11 или аналоги), на чашки Петри со средой Эндо, МакКонки-агаром с сорбитолом (не менее чем на три чашки с каждой среды обогащения) с таким расчетом, чтобы получить не менее 100 изолированные колонии микроорганизмов. Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

Третий день исследований.

1) С помощью ПЦР-исследований проводят анализ 3 - 5 смешанных в одной пробирке изолятов энтеробактерий каждого морфотипа, отобранного при прямом высеве исследуемого материала (см. Второй день исследований, п. 1). Для получения более объективных результатов анализа, при любом количестве отобранных морфотипов, число изучаемых в ПЦР изолятов должно быть не менее 20.

Результатами ПЦР анализа смеси изолятов могут быть:

а) в смеси изолятов обнаруживают гены еае, stx1, stx2;

б) в смеси изолятов обнаруживают еае-ген и один из stx-генов;

в) в смеси изолятов обнаруживают только stx1- и stx2-гены (или один из них) и не обнаруживают ген еае.

При обнаружении в смеси изолятов одной из перечисленных выше комбинаций генов проводят дополнительную ПЦР с каждым из входящих в смесь трех-пяти изолятов. У каждого изолята, давшего положительную ПЦР, определяют биохимические свойства для подтверждения принадлежности его к виду Е. coli.

2) Просматривают результаты посевов со сред накопления на среду Эндо (см. Второй день исследований п. 3) и оценивают морфологию изолированных колоний энтеробактерий. Затем по три-пять колоний бактерий каждого морфотипа засевают на отдельные сектора питательного агара в чашках Петри. Число отсеянных изолятов, независимо от количества выявленных среди колоний морфотипов, должно составлять не менее 20. Посевы выращивают при 37°С в течение 18 - 24 часов.

3) Проводят анализ культур выросших на средах МакКонки и Левина с антибиотиками, с помощью иммунохроматографических экспресс-тестов для определения энтерогеморрагических E.coli. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографического теста проводят в соответствии с инструкцией по применению (см. Приложение 2).

Четвертый день исследований.

1) Учитывают результаты изучения биохимических свойств изолятов, в которых с помощью ПЦР были обнаружены специфические для энтерогеморрагических эшерихий гены еае, stx1, stx2 (или только один из генов шигатоксинов) (см. Третий день исследований, п. 1). В случае, если изолят по своим биохимическим свойствам соответствует виду E.coli, делают заключение о присутствии в анализируемом образце энтерогеморрагических эшерихий, "не относящихся к E.coli О157:H7".

В том случае, если изолят по своим биохимическим свойствам соответствует виду E.coli, определяется положительный результат в иммунохроматографическом экспресс-тесте для определения энтерогеморрагических E.coli, но у культуре не обнаружен ген еае, а присутствуют лишь гены шига-токсинов, делают заключение о присутствии в анализируемом образце шига-токсинпродуцирующих эшерихий (STEC-культур).

При обнаружении в образце энтерогеморрагических изолятов эшерихий или STEC-изолятов, исследования прекращают, а выделенные культуры направляют в референс-центры для дальнейшего изучения.

Если у изученных штаммов с помощью ПЦР-исследований обнаружены гены еае, stx1, stx2 или же эти гены в разной комбинации, но изоляты по своим биохимическим свойствам не могут быть отнесены к виду E.coli, делают заключение об отсутствии в исследуемом образце энтерогеморрагических или STEC-культур. Выделенные культуры с генами еае, stx1, stx2, но не относящиеся к виду E.coli, также направляют в референс-центры.

2) Если в четвертый день исследований по п. 1 получены отрицательные результаты, продолжают поиск энтерогеморрагических эшерихий или STEC-культур среди изолятов энтеробактерий, выделенных из сред обогащения (см. Третий день исследований, п. 2).

Изучение изолятов в ПЦР проводят по той же схеме, как это описано выше (см. Четвертый день исследований, п. 1). Если в результате проведенного анализа идентифицированы культуры энтеробактерий с генами еае, stx1, stx2, изучают их биохимические свойства.

Пятый день исследований.

1) Учитывают результаты изучения биохимических свойств изолятов энтеробактерий с генами еае, stx1, stx2. В случае, если эти изоляты по биохимическим свойствам относятся к виду E.coli, то делают положительное заключение о наличии в исследуемом образце энтерогеморрагических эшерихий или STEC-культур.

Выделенные культуры направляют в референс-центры.

8.2. Выделение и идентификация E.coli, "не относящихся к E.coli О157:Н7", из пищевых продуктов

8.2.1. Исследование материала

Выделение энтерогеморрагических культур E.coli "не относящихся к E.coli О157:H7" из исследуемых образцов и их последующую идентификацию в иммунохроматографических экспресс-тестах, с помощью мультиплексной ПЦР и определения биохимических свойств культур проводят по той же схеме, как и в случае исследования клинических образцов (см. п. 6.1.).

8.3. Схема выделения и идентификации энтерогеморрагических эшерихий, "не относящихся к E.coli О157:H7"

9. Организация лабораторных исследований на E.coli О104:Н4 и О157:Н7 и другие энтерогеморрагические кишечные палочки

В соответствии с утвержденными санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2885-11 "Дополнения и изменения N 2 к СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", утвержденными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 N 86 (зарегистрированы в Минюсте России 30.06.2011, регистрационный номер 63953), дополнено приложение 1 "Классификация микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности" раздел "Бактерии", подраздел "II группа" следующим пунктом: Escherichia coli О157:Н7, О104:Н4 и другие серотипы - продуценты веротоксина (возбудители геморрагического колита, гемолитико-уремического синдрома). Таким образом, возбудители E.coli O104:H4 и О157:Н7 относятся к II группе патогенности, и для работы с ними требуется наличие у лаборатории соответствующего санитарно-эпидемиологического заключения.

9.1. Общие требования

Все работы по сбору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала осуществляют в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", СП 1.3.2518-09 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08", СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности", методических указаний МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

9.2. Координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику острых кишечных заболеваний, вызванных энтерогеморрагическими эшерихиями (STEC-культуры)

Лабораторные исследования на энтерогеморрагические кишечные палочки, в том числе E.coli О104:Н4 и О157:Н7, проводят бактериологические лаборатории юридических лиц, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности, в том числе центров гигиены и эпидемиологии, лечебно-профилактических, ведомственных и противочумных учреждений, имеющих санитарно-эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами II - IV и III - IV групп патогенности.

3.1. Показания к проведению исследований.

Исследования клинического материала проводятся в случае:

- Наличия у пациента гемолитико-уремического синдрома после (на фоне) перенесенного диарейного заболевания.

- Наличия у пациента гемолитической анемии после (на фоне) перенесенного диарейного заболевания.

- Наличия у пациента любого (по тяжести и синдромальному диагнозу) диарейного заболевания при наличии эпидемиологических данных о возможной связи заболевания с ЕНЕС.

Исследования образцов продуктов питания проводятся по эпидемиологическим показаниям в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.

Бактериологические лаборатории учреждений лечебно-профилактических и ведомственных служб, центров гигиены и эпидемиологии, имеющих санитарно-эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности:

Проводят плановые диагностические исследования материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды.

Забор материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекционное заболевание, вызванное STEC-культурами, проводят в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ), в максимально ранние сроки до назначения антибактериальной терапии. В качестве клинического материала для исследований используют образцы фекалий. Для постмортальной диагностики используют содержимое кишечника, аутоптаты желудка, тонкого и толстого кишечника, почек. Сбор материала производят в пробирки с транспортной средой, предоставляемой (или рекомендуемой) фирмой-производителем тест-систем.

Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или выделения культур микроорганизмов, подозрительных на энтерогеморрагические кишечные палочки (положительные результаты при использовании иммунохроматографических экспресс-тестов для определения энтерогеморрагических E.coli, реакцией РЛА или ПЦР на E.coli O104:H4 и О157:Н7.

При подозрении на положительный результат выделения культур энтерогеморрагических кишечных палочек сотрудники лабораторий немедленно сообщают в Управление Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации. Для окончательной идентификации выделенные культуры по согласованию с Управлением Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации направляют в установленном порядке в лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, имеющих санитарно-эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами II - IV групп патогенности.

Доставка материала производится транспортом лечебно-профилактических учреждений по согласованию с управлением Роспотребнадзора субъекта Российской Федерации с учётом оптимальной транспортной схемы

Лаборатории особо опасных инфекций центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, имеющих санитарно-эпидемиологические заключения и лицензии на право работы с микроорганизмами II - IV групп патогенности:

- выполняют исследование материала от больных и умерших с подозрением на эшерихиозную инфекцию и объектов окружающей среды с целью индикации возбудителя;

- идентифицируют культуры, выделенные в лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, и эпидемическую значимость (токсигенность), а также чувствительность к антибиотикам;

- осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в лабораториях;

- представляют оперативную информацию о выделенных культурах в Управление Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации;

- контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора.

При необходимости проведения оценки идентичности изолятов - направляют культуры ЕНЕС в референс-центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора) и референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней ФГУЗ "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора) с учётом оптимальной транспортной схемы.

Референс-центры:

- проводят исследования материала или культур от больных и умерших с подозрением на заболевание эшерихиозом, а также объектов окружающей среды;

- подтверждают таксономическую принадлежность культур, выделенных на курируемой территории;

- проводят субвидовое типирование выделенных изолятов STEC-культур в соответствии с поставленными эпидемиологическими задачами с применением унифицированных протоколов анализа набора продуктов рестрикции тотальной ДНК в пульсирующем электрическом поле - пульс-электрофорез (PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis).

- идентифицируют все атипичные культуры с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

- определяют эпидемическую значимость (токсигенность) культур, с использованием комплекса регламентированных методов, антибиотикочувствительность;

- осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора на курируемой территории;

- в установленном порядке передают с паспортами выделенные культуры в Государственную коллекцию патогенных бактерий ФБУН ГНЦ ПМБ.

Референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора) осуществляет ведение единой общероссийской базы данных по циркулирующим в Российской Федерации штаммам STEC-культур и их депонирование в Национальном центре верификации диагностической деятельности на базе ФГУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора.

Результаты исследований, проводимых на каждом уровне, передают в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации, в учреждение, направившее материал, в день получения результата.

Персонал лабораторий, выполняющих исследования на эшерихиозы, должен быть подготовлен по вопросам лабораторной диагностики, техники безопасности и обеспечен соответствующими инструктивно-методическими материалами.

Усовершенствование врачей-бактериологов и лаборантов по микробиологии и лабораторной диагностике эшерихиозов проводят на специальных курсах усовершенствования.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко