Государственный стандарт СССР ГОСТ 18963-73* "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа" (введен в действие постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 29 июня 1973 г. N 1612)

Drinking water. Methods of sanitary-bacteriological analysis

Дата введения - 1 июля 1974 г.
Взамен ГОСТ 5215-50 и ГОСТ 5216-50

Постановлением Госстандарта СССР
от 25 декабря 1991 г. N 2121
снято ограничение срока действия

ГАРАНТ:

Приказом Ростехрегулирования от 15 октября 2009 г. N 457-ст применение на территории РФ настоящего ГОСТа прекращено с 1 июля 2011 г. в части раздела 1 "Метод отбора, хранения и транспортирования проб воды" в связи с утверждением и введением в действие ГОСТ Р 53415-2009 "Вода. Отбор проб для микробиологического анализа"

Настоящий стандарт распространяется на питьевую воду и устанавливает методы санитарно-бактериологического анализа, отбора, хранения и транспортирования проб воды.

1. Метод отбора, хранения и транспортирования проб воды

1.1. Для отбора проб воды используют стерильные флаконы вместимостью 0,5 с притертой каучуковой или корковой пробкой.

1.2. Место и время отбора пробы определяют в зависимости от цели анализа в наиболее характерных точках водопроводной сети: ближайших к насосной станции, наиболее удаленных от нее, наиболее возвышенных, в тупиках, а также в точках, качество воды в которых вызывает сомнение.

1.3. Пробы воды периферической водопроводной сети отбирают в периоды наибольшего расхода воды при соблюдении правил стерильности, после предварительной стерилизации кранов обжиганием пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего спуска воды в течение 10 - 15 мин при полностью открытом кране. Бумажный пакет или колпачок с флакона снимают вместе с пробкой непосредственно перед отбором пробы, не касаясь пробки руками. Наполняют флаконы с таким расчетом, чтобы при транспортировании не замочить пробку. Объем отбираемой пробы - 500 . Наполненные флаконы закрывают притертыми, каучуковыми или корковыми пробками и стерильными бумажными колпачками, которые обвязывают ниткой и бечевкой.

1.4. Пробы хлорированной водопроводной воды (с аммонизацией или без нее) отбирают во флаконы с дехлоратом: во флакон, предназначенный для отбора 500  воды, до стерилизации вносят 10 мг серноватистокислого натрия.

1.5. Отобранные пробы должны сопровождаться документом, содержащим:

точное наименование этапа очистки и обеззараживания;

при отборе проб из периферической водопроводной сети - точное месторасположение крана, из которого отбирают пробу;

дату отбора пробы (с указанием года, месяца, числа и часа);

особые обстоятельства, имевшие место при отборе проб (время спуска воды из крана, условия транспортирования и т.п.);

цель исследования: сделан ли отбор пробы в порядке текущего санитарного надзора или по особым показаниям (рекомендации санитарно-эпидемиологической службы, сигналы, поступающие от населения об изменении органолептических качеств воды, и т.п.).

Все сопроводительные документы должны быть подписаны лицом, отбиравшим пробу, с указанием его места работы и должности.

1.6. Проба должна быть исследована не позже чем через 2 ч после ее отбора.

При невозможности выполнения этих условий анализ допускается проводить не позже чем через 6 ч после отбора пробы, сохраняя при этом пробу при температуре от 1 до 5°С.

1.7. При невозможности исследовать пробы на месте допускается транспортировать их в пределах времени, указанных в п. 1.6.

1.8. Посуда с пробами должна быть упакована в сумки-холодильники или в ящики с теплоизолирующей прокладкой.

1.9. Температуру, указанную в п. 1.6, необходимо поддерживать, применяя резиновые или пластмассовые мешки, наполненные летом льдом, а зимой теплой водой.

1.10. Необходимо избегать при транспортировании резких толчков, которые могут привести к намоканию пробок.

2. Аппаратура, материалы, реактивы, питательные среды

2.1. Для проведения анализа должны применяться следующие аппараты, реактивы и питательные среды:

банки широкогорлые с притертыми пробками;

воронки стеклянные по ГОСТ 23932-90;

колбы конические вместимостью 250 и 500  по ГОСТ 25336-82;

колбы с тубусом по ГОСТ 25336-82;

флаконы стеклянные вместимостью 100 - 250 ;

посуда мерная лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770-74;

пипетки вместимостью 1, 5, 10  с ценой деления 0,1 , исполнения 4, 5, 6 по НТД;

пипетки Мора вместимостью 50 и 100;

цилиндры вместимостью 100, 250, 500  исполнений 1, 3 или мензурки вместимостью 250, 500, 1000  по ГОСТ 1770-74.

пробирки бактериологические по ГОСТ 25336-82;

флаконы для отбора проб с притертыми пробками или без них вместимостью 500 ;

спиртовки по ГОСТ 25336-82;

стаканы лабораторные по ГОСТ 25336-82;

стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672-75;

стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284-75;

чашки бактериологические (Петри);

кристаллизаторы;

насос водоструйный стеклянный лабораторный по ГОСТ 25336-82;

поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм и диаметром соответственно 5, 9 и 10 мм;

автоклав электрический по ТУ 27-31-2939-86;

аппараты фильтровальные с диаметром фильтрующей поверхности 32 мм;

баня водяная;

вакуум-насос;

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-88, 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 200 г, допускаемая погрешность не более 0,02 г; весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-88, 4-го класса точности, наибольший предел взвешивания 1 кг, допускаемая погрешность не более 0,1 г;

дистиллятор;

лупа с увеличением по ГОСТ 25706-83;

микроскоп биологический по НТД;

осветитель ОИ-19;

пеналы металлические для пипеток;

пластинка с сеткой для счета колоний;

рН-метр;

прибор для счета колоний бактерий;

термостаты электрические для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до 50°С и с термометром с ценой деления 0,2°С;

холодильник электрический или газовый бытовой, поддерживающий температуру на 4 - 6°С;

холодильники походные (сумки) или ящики для транспортирования проб с теплоизоляцией и резиновыми мешками (для льда или теплой воды);

часы сигнальные или песочные по ОСТ 25-11-38-84;

шкаф сушильный;

агар-агар в волокнах или в порошке по ГОСТ 17206-84;

агар сухой питательный;

кислота борная по ГОСТ 9656-75;

индикатор бриллиантовый зеленый;

индикатор бромтимоловый синий;

вата гигроскопическая медицинская по ГОСТ 5556-81;

вата хлопчатобумажная не гигроскопическая по ТУ-17 РСФСР 63-9022-83;

индикатор генциан фиолетовый;

глюкоза, х.ч. по ГОСТ 6038-79;

диметил-п-фенилендиамин;

желчь крупного рогатого скота свежая или сухая обезвоженная;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

желатин;

йод по ГОСТ 4159-79;

калий йодистый по ГОСТ 4232-74;

калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493-75;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75;

кислота соляная по ГОСТ 3118-77;

кислота розоловая;

индикатор кристаллический фиолетовый;

лактоза;

марля медицинская в кусках и бинтах по ГОСТ 9412-77;

масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739-78;

натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77;

натрий серноватисто-кислый по СТ СЭВ 223-75;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

- нафтол по ТУ 6-09-5417-88;

нептон сухой ферментативный для бактеоиологическнх целей по ГОСТ 13805-76;

проволока из никелевых сплавов диаметром 0,3 - 0,5 мм;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;

среда Эндо сухая питательная;

препарат с индикатором ВР и глюкозой;

препарат с индикатором ВР и лактозой;

фенол по ТУ 6-09-5303-86;

фильтры мембранные N 2 и 3 и фильтры планктонные N 6 или фильтрующие мембраны "Владипор" марки МФА-МА N 5, 6, 7, 8, 10 диаметром 35 мм;

фуксин основной;

фуксин кислый;

бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76;

пробки резиновые разных размеров для флаконов.

сторож для молока.

(Измененная редакция, Изм. N 1, 2).

3. Подготовка к анализу

3.1. Подготовка посуды и материалов

3.1.1. Вся бактериологическая посуда должна быть перед стерилизацией тщательно вымыта и высушена.

3.1.2. Пробирки и флаконы должны быть заткнуты ватными пробками и завернуты в бумагу. На горлышки флаконов следует надеть бумажные колпачки, которые обвязывают шнурком (ниткой) .

3.1.3. Флаконы для отбора проб должны быть заткнуты ватными пробками, снабжены бумажными колпачками. Хорошо подобранные притертые, каучуковые или корковые пробки, завернутые , в бумагу, привязывают к горлышку флакона.

3.1.4. Пробки для пробирок и флаконов готовят из ваты, обертывают слоем марли и завязывают ниткой на свободном конце.

3.1.5. Чашки Петри укладывают в металлические пеналы или завертывают в бумагу. Между крышкой и дном бактериологических чашек, предназначенных для разливки среды Эндо, можно проложить кружки фильтровальной бумаги диаметром на 1 - 2 см больше диаметра чашки.

3.1.6. В конец пипетки, который берется в рот, вкладывают кусочек ваты. Пипетки помещают в металлические пеналы не более 6 - 10 шт. в каждый или завертывают в бумагу.

3.2. Стерилизация посуды

3.2.1. Подготовленную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при (1605)°С в течение 1 ч, считая с момента достижения этой температуры. Флаконы с привязанными к ним каучуковыми пробками стерилизуют отдельно в автоклаве при (1262)°С (Па) 30 мин.

3.2.2. Простерилизованную посуду вынимают из сушильного шкафа после его охлаждения ниже 60°С.

3.2.3. Стерильную посуду хранят в плотно закрытых шкафах или ящиках лабораторных столов.

3.2.4. При отсутствии сушильного шкафа посуду стерилизуют в автоклаве при (1262)°С ( Па) 30 мин.

3.3. Приготовление сред и реактивов

3.3.1. Приготовление стерильной воды

Водопроводную (колодезную, речную) воду разливают в пробиркой по 10  в каждую или во флаконы по 100  в каждый, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при (1202)°С ( Па) 20 мин. Срок хранения не более двух недель.

Целесообразнее воду стерилизовать во флаконе и разливать в пробирки по 9  непосредственно перед посевом, соблюдая правила стерильности.

3.3.2. Приготовление мясной воды

500 г мясного фарша без жира и сухожилий заливают 1 дистиллированной воды, настаивают 12 ч на холоду или 1 ч в водяной бане при 50 - 60°С. Затем настой кипятят, фильтруют через марлю или вату и опять доводят дистиллированной водой до 1 , разливают во флаконы, стерилизуют в автоклаве при (120 2)°С ( Па) 20 мин или приступают непосредственно к приготовлению мясного бульона или других питательных сред.

3.3.3. Приготовление мясо-пептонного бульона

К 1 мясной воды прибавляют 10,г пептона и 5 г хлористого натрия, нагревают до полного растворения пептона и соли, устанавливают рН (7,2 - 7,4), осветляют, фильтруют и разливают в пробирки или флаконы в количествах, необходимых для анализа, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при (122)°С ( Па) 20 мин.

Примечание. Допустимая погрешность, взвешивания 0,1%.

3.3.4. Приготовление мясо-пептонного агара

К 1 мясо-пептонного бульона прибавляют 15 г агара в волокнах или порошке, нагревают до полного растворения, проверяют рН (7,2 - 7,4), осветляют, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр и разливают во флаконы или пробирки в количествах, необходимых для анализа. Стерилизуют в автоклаве при (1202)°С ( Па) 20 мин.

Вместо мясо-пептонного бульона также используют перевар Хоттингера с концентрацией аминного азота не менее 100 .

3.3.5. Приготовление питательного агара Дагестанского НИИ питательных сред

Готовят по прописи на этикетке.

3.3.6. Приготовление глюкозо-пептонной среды

Среду готовят двух видов: нормальную и концентрированную.

Среда нормальной концентрации: 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г глюкозы, 1 дистиллированной воды. После растворения указанных ингредиентов прибавляют индикатор (2  1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего или 10  индикатора Андреде), устанавливают рН (7,4 - 7,6), разливают по 10  в пробирки с поплавками или комочками ваты, стерилизуют в автоклаве при 112°С ( Па) 12 мин. Приготовляя концентрированную среду, количество всех ингредиентов, кроме воды, увеличивают в 10 раз.

3.3.7. Приготовление лактозо-пептонной среды

Готовят так же, как глюкозо-пептонную среду, заменив глюкозу лактозой.

3.3.8. Приготовление индикатора Андреде

1 г фуксина кислого растворяют в 32  нормального раствора гидрата окиси натрия, прибавляют 200 дистиллированной воды, настаивают 24 ч при 37°С, фильтруют, стерилизуют 5 мин при 100°С. Хранят во флаконе из темного стекла с притертой пробкой.

3.3.9. Приготовление полужидкой среды с индикатором ВР а глюкозой

Готовят по прописи на этикетке. Срок хранения не более 7 суток.

3.3.10. Приготовление полужидкой среды с глюкозой. Полу жидкую среду применяют при отсутствии сухих сред. Для этого в 1 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 4 - 5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН (7,2 - 7,4), добавляют 1  1,6%-го спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (1202)°С ( Па) 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г глюкозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки столбиком высотой около 3 см и стерилизуют при 112°С ( Па) 12 мин. Срок хранения не более 7 суток.

3.3.11. Приготовление среды Эндо (модификация)

Готовят из сухого препарата по прописи на этикетке.

В готовую и охлажденную до 60 - 70°С среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100  среды: 0,2  10%-ного спиртового раствора основного фуксина для повышения дифференцирующих свойств среды и 0,2  5%-го спиртового раствора розоловой кислоты во избежание зарастания посевов споровыми аэробными бактериями. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки по 20 - 25 . Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Для этого можно оставить чашки со средой на 0,5 - 1 ч для застывания и подсушивания накрытыми стерильными кружками фильтровальной бумаги. Хранить чашки со средой допускается не более двух - трех суток в темноте или в холодильнике. Срок хранения растворов фуксина и розоловой кислоты не более одного месяца.

3.3.12. Приготовление желчно-лактозного бульона с бриллиантовым зеленым

10 г пептона, 10 г лактозы, 200  свежей фильтрованной желчи крупного рогатого скота (или 20 г сухой обезвоженной желчи, растворенной в 200  дистиллированной воды) растворяют при нагревании в 700  дистиллированной воды, устанавливают рН (7,2 - 7,4), прибавляют 13,3  1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого, доливают дистиллированной водой До общего объема 1 , фильтруют через ватный фильтр, разливают по 5  в пробирки с поплавками и стерилизуют при 112°С ( Па) 12 мин или три дня при 100°С. Срок хранения не более двух недель.

3.3.13. Приготовление борнокислой буферной среды с лактозой

10 г пептона, 12,2 г калия фосфорнокислого двузамещенного (безводного), 4,1 калия фосфорнокислого однозамещенного (безводного), 3,2 г борной кислоты, 5 г лактозы растворяют в 1 дистиллированной воды, разливают по 5  в пробирки с поплавками, стерилизуют при 112°С ( Па) 12 мин. Срок хранения не более двух недель.

3.3.14. Приготовление реактивов для окраски по Граму**

Карболовый раствор генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10  ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100  дистиллированной воды.

Раствор Люголя готовят следующим образом; 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300  дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.

Фуксин Циля готовят следующим образом: 1 г основного фуксина, 10  спирта этилового ректификованного, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100  дистиллированной воды.

Мазок на предметном стекле фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового на 0,5 - 1 мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя на 0,5 - 1 мин, сливают раствор Люголя и стекло прополаскивают в этиловом спирте, в течение 0,5 - 1 мин, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают от 1 до 2 мин фуксином Циля, разведенным 1:10 дистиллированной водой. После промывки и просушивания препарата мазок микроскопируют.

Экспресс-метод окраски по Граму.

Приготовление реактива N 1: - 0,5%-ный спиртовой раствор кристаллического фиолетового.

Приготовление реактива N 2: в 100  этилового спирта ректификованного растворяют 0,4 г йодистого калия, нагревают на водяной бане или оставляют на сутки при комнатной температуре. Затем прибавляют 0,2 г кристаллического йода и 0,1 г основного фуксина. Хранить во флаконе из темного стекла.

На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей одну каплю дистиллированной воды (при приготовлении препарата из колоний и плотных средах) или одну каплю бульонной культуры. В каплю дистиллированной воды вносят небольшое количество микробных клеток из анализируемой колонии или газона чистой культуры на плотной среде. Затем в каплю вносят петлей одну каплю реактива N 1, распределяют смесь по стеклу и подсушивают мазок при комнатной температуре. Затем фиксируют на пламени горелки, промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и наносят реактив N 2, покрывая им всю поверхность стекла, на 1 - 5 мин (продолжительность окраски не влияет на ее результат). Тщательно и быстро прополаскивают препарат водой, просушивают фильтровальной бумагой, микроскопируют. При приготовлении на одном стекле нескольких мазков на лицевую сторону стекла наносят восковым карандашом линии, делящие поверхность стекла на необходимое количество квадратов.

3.3.15. Приготовление реактива для определения оксидазной активности бактерий

30 - 40 мг -нафтола растворяют в 2,5  ректификованного этилового спирта, прибавляют 7,5 дистиллированной воды и растворяют 40 - 60 мг диметил-п-фенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением.

Оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Psendomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий, которые обладают активным ферментом оксидазой и окисляют фенилендиаминовые соединения до индофенола ярко-синего цвета.

3.3.15.1. Поставка оксидазного теста при работе методом мембранных фильтров

Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом. Через 2 - 4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии или с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceae, их учитывают.

Колонии, не изменившие своего первоначального цвета, в подавляющем большинстве образованы бактериями группы кишечных палочек, но среди них могут быть кокки, спорообразующие и грамотрицательные палочки, не имеющие санитарно-показательно-го значения, которые не учитывают после микроскопирования и отсутствия образования газа на полужидкой среде с глюкозой при (370,5)°С. Учитывая бактерицидность реактива для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее чем через 5 мин) пересеивают оксидазо-отрицательные колонии в полужидкую среду с глюкозой.

3.3.15.2. Постановка оксидазного теста при работе бродильным методом

По 2 - 3 изолированных колоний каждого типа, выросших на секторах среды Эндо, снимают петлей или стеклянной палочкой и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом. В месте нанесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин, если бактерии имеют активную оксидазу. Исследование изолированных колоний является обязательным, иначе можно необоснованно отбросить кишечную палочку при ложном посинении за счет примеси оксидазоположительных бактерий.

Примечание. Если оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко из-за того, что мешают ингибиторы (это относится в основном к темно-красным колониям), то для получения правильного результата такие колонии можно пересеять на сектора или на скошенный питательный агар и после подращивания повторить оксидазный тест.

4. Проведение анализа

4.1. Определение общего количества бактерий в воде

Сущность метода заключается в определении в 1  воды общего содержания мезофильных, мезотрофных аэробов и факультативных анаэробов, способных расти на питательном агаре данного состава при температуре (370,5)°С в течение (242) ч, образуя колонии, видимые при увеличении в 2 - 5 раз.

4.1.1. Питательный агар расплавляют в водяной бане и охлаждают до температуры (455)°С.

4.1.2. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе и подписывают на крышках номер пробы, дату посева и объем посеянной воды.

4.1.3. Из каждой пробы должен быть сделан посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При исследовании водопроводной воды засевают в каждую из двух чашек по 1 .

4.1.4. С флаконов с пробой воды снимают бумажные колпачки, вынимают пробки, горлышки фламбируют, после чего воду тщательно перемешивают осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.

4.1.5. Стерильной пипеткой отбирают соответствующие, объемы воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.

4.1.6. Для посева 0,1  и меньших объемов воды используют разведения анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9  стерильной воды, приготовленной по п. 3.3.1, вносят 1  анализируемой воды. При этом пипетка должна быть опущена ниже поверхности воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1  и переносят в чашку, что будет соответствовать посеву 0,1  анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды, этой же пипеткой переносят 1  содержимого первой пробирки в следующую с 9  стерильной воды. Посев 1  из второй пробирки будет соответствовать посеву 0,03  анализируемой воды и т.д.

4.1.7. После внесения воды в чашки Петри ее заливают 10 - 12 остуженного питательного агара при фламбировании краев пробирки или бутылки, где он содержится.

Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания среды.

4.1.8. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном не более чем по 3 - 4 чашки вместе. Посевы выращивают при (370,5)°С в течение (242) ч.

4.1.9. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с увеличением в 2 - 5 раз или прибора для счета колоний. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.

4.1.10. Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При посеве 1  неразведенной пробы учитывают любые количества колоний, но не превышающие 300.

Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, то допускается подсчитывать колонии при помощи пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1  каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число колоний на 1 , величину которого умножают на площадь чашки в , вычисленную по формуле

.

4.1.11. Результат подсчета колоний в каждой чашке выражают в количестве бактерий на 1  анализируемой воды с учетом посеянного объема. За окончательное количество бактерий принимают среднее арифметическое результата подсчета на двух параллельных чашках или разных разведений. Результаты округляют следующим образом:

если результат находится в пределах чисел от 1 до 100, то записывают те числа, которые получены; если результат находится в пределах чисел от 101 до 1000, то результат округляют до 10; если результат находится в пределах чисел от 1001 до 10000, то результат округляют до 100 и т.д.

4.1.12. Количество колоний учитывают, ориентируясь на одну чашку в случаях: если на другой чашке при посеве из разведения выросло менее 20 колоний; при ползучем росте бактерий, распространившимися на всю поверхность чашки или значительные зоны и маскирующим ростом других колоний; при количестве колоний свыше 300.

Счетную пластинку рекомендуется применять при подсчете количества колоний, когда на обеих чашках отмечен ползучий рост.

При этом просчитывают квадраты на свободных от сплошного роста местах чашки.

4.1.13. Окончательный результат заносят в протокол анализа или в журнал регистрации, где должны быть приведены сведения из сопроводительного документа к пробе воды. Кроме того, отмечают особые обстоятельства анализа (превышение срока хранения. пробы, изменение температуры и времени инкубации посевов, применение заменителей при приготовлении питательных сред и прочие вынужденные отклонения).

4.2. Определение количества бактерий группы кишечных палочек

К бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при (370,5)°С в течение 24 - 48 ч или сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при (370,5)°С в течение 24 ч и не обладающие оксидазной активностью.

Обнаружение в воде бактерий группы кишечных палочек следует рассматривать как показатель фекального загрязнения воды, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения.

Количество бактерий группы кишечных палочек определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом.

Метод мембранных фильтров

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их при (370,5)°С на среде Эндо, дифференцировании выросших колоний и подсчета количества бактерий группы кишечных палочек на 1 воды.

4.2.1. Подготовка к анализу

При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть и в-наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 , профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. При этом необходимо ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах (например, для воды после первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и 100 ; для воды необеззараженной 0,1, 1 и 10 ).

При анализе воды неизвестного качества следует заседать 3 - 4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3, 30; 100; 200  воды; по этапам очистки - 0,1; 1; 10, 100 воды).

4.2.2. Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры N 2 или 3, а также планктонные фильтры N 6, проверенные'на отсутствие трещин, отверстий и т.п., помешают по одному на поверхность дистиллированной воды, нагретой до 80°С в стакане (в чашке для выпаривания, эмалированной кастрюле), и медленно доводят до кипения на слабом огне, после чего воду заменяют и кипятят 10 мин. Смену воды и последующее кипячение повторяют 3 - 5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. Подготовленные фильтры сохраняют сухими или в широкогорлой банке с дистиллированной водой. Перед употреблением фильтры стерилизуют кипячением в дистиллированной воде

Фильтрующие мембраны "Владипор" марки МФА-МА N 5, 6, 7, 8 и 10, визуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей, и т.п., стерилизуют кипячением. При этом во избежание скручивания мембран необходимо строго соблюдать следующие правила. На дно сосуда, в котором производят кипячение (химический стакан, эмалированная кастрюля и т.п.), помещают "сторож для молока" или нержавеющую сетку (для ограничения бурного кипения). Дистиллированную воду заливают в этот сосуд в небольшом объеме, ограничивающем свободное вращение в ней фильтрующих мембран, но достаточном для того, чтобы предназначенные для стерилизации фильтрующие мембраны были покрыты водой. Дистиллированную воду доводят в сосуде до 80 - 90°С, после чего, убавив нагрев, на поверхность воды по одной помешают фильтрующие мембраны. Воду, с помещенными в нее мембранами, медленно доводят до кипения и кипятят на слабом огне в течение 10 - 15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количеством (чтобы покрыть фильтрующие мембраны) стерильной дистиллированной воды. После этого фильтрующие мембраны готовы к употреблению. При необходимости может производиться повторное кипячение фильтрующих мембран.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4.2.3. Подготовка фильтровального аппарата к анализу

Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

4.2.4. Фильтрование воды

В воронку (стакан) фильтрованного прибора при соблюдении правил стерильности наливают необходимый объем воды и создают вакуум в приемном сосуде. Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтрованный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании небольших объемов воды (1 ) в воронку сначала наливают 10 стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, дата посева и номера пробы. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

4.2.5. Если анализируемая вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, то ее фильтруют сначала через предварительный фильтр 6, для удаления крупной взвеси. Для этого фильтр N 6 помещают в фильтровальный прибор над фильтром N 2 или 3. После окончания фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. При выведении результатов анализа учитывают рост бактерий на обоих фильтрах.

При работе с фильтрующими мембранами "Владипор" марки МФА-МА в качестве предварительной мембраны для удаления крупной взвеси используют мембрану "Владипор" марки МФА-МА N 10, которую помещают в фильтровальный прибор над основной мембраной, задерживающей бактерии группы кишечной палочки. В качестве основной используется фильтрующая мембрана "Владипор" марки МФА-МА N 5, 6, 7 или 8. После окончания фильтрования предварительную и основную мембраны переносят на среду Эндо. При определении результатов анализа учитывают рост бактерий на обеих фильтрующих мембранах.

(Измененная редакция, Изм. N  1).

4.2.6. Чашки с фильтрами на среде Эндо помещают в термостат дном вверх и инкубируют при (370,5)°С в течение 18 - 24 ч.

4.2.7. Обработка результатов

При. отсутствии каких-либо колоний на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых, с неровной поверхностью и краями, плесневых и других, не характерных для кишечных палочек колоний дают отрицательный результат на присутствие бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ на этом этапе заканчивают через 18 - 24 ч.

4.2.8. При наличии на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, розовых, прозрачных), из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек дает отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18 - 24 ч.

4.2.9. При наличии в мазках грамотрицательных, коротких, полиморфных, не образующих спор палочек (возможны удлиненные нитевидные формы, а также крупные палочки, полярно окрашенные) выполняют оксидазный тест (п. 3.3.15.1).

4.2.10. Наличие активной оксидазы у всех колоний, кроме перечисленных в п. 4.2.7, позволяет дать отрицательный результат.

4.2.11. Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском и без него (лактозоположительных) колоний позволяет отнести их к бактериям группы кишечных палочек и немедленно дать положительный ответ.

Анализ питьевой воды может быть завершен на этом этапе, если нет других колоний, не обладающих оксидазной активностью.

Анализ воды по этапам очистки заканчивают через 18 - 24 ч подсчетом этих колоний для вычисления коли-индекса.

4.2.12. При наличии на фильтратах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2 - 3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4 - 5 ч инкубации при (370,5)°С. При образовании кислоты и газа результат анализа считают положительным. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат. Анализ заканчивают через 24 - 48 ч.

При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования - положительный результат.

4.2.13. Вычисление коли-индекса

Результат выражают в виде коли-индекса, т.е. количества бактерий группы кишечных палочек в 1 воды. Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТ 2874-82, если коли-индекс не превышает 3.

Коли-индекс высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000  и делят на этот объем воды.

При отсутствии на фильтрах бактерий группы кишечных палочек коли-индекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки.

Пример 1. При посеве 300  воды не выросло ни одной колонии. (1 X 1000) : 300 = 3 Коли-индекс менее 3.

При наличии бактерий группы кишечных палочек вычисляют коли-индекс, учитывая весь объем анализируемой воды.

Пример 2. При посеве трех объемов воды по 100  на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3 X 1000) : 300= 10. При посеве 10 и 100  воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6 X 1000): 110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Пример 3. В 100  - сплошной рост, в 10  - 12 бактерий группы кишечных палочек; коли-индекс равен (12x1000) : 10 = 1200.

При подсчете коли-индекса в пробах воды не обеззараженной с большим фекальным загрязнением, когда для анализа профильтровывают объем воды менее 10  или ее разведения, то для учета выбирают тот фильтр, на котором выросло не менее 10 и не более 30 изолированных колоний кишечных палочек. Количество колоний на нем, относимых к бактериям группы кишечных палочек, пересчитывают на 1 с учетом только того объема воды, который профильтрован через этот фильтр.

Если на всех фильтрах получен более густой рост и анализ невозможно повторить, то допускается подсчет колоний на фильтре с наименьшим разведением, но с записью в протоколе исследования и в журнале регистрации.

Результат в виде коли-индекса заносят в журнал регистрации и в протокол анализа, где помечают особые обстоятельства, имевшие место при анализе воды (отклонения в температуре инкубации, составе используемых сред, особенно добавки в среду Эндо и т.п.).

Бродильный метод

Сущность метода заключается в посеве определенных объемов; анализируемой воды и подращивании при (370,5)°С в средах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо, дифференцировании выросших бактерий и определении наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 воды по таблицам.

4.2.14. Подготовка к анализу:

а) при исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100,0; 10,0; 1,0 и 0,1  воды;

б) на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100,0 , три объема по 10,0  и три объема по 1,0 .

4.2.15. Указанные в п. 4.2.14 объемы воды помещают во флаконы и пробирки с глюкозо-пептонной или лактозо-пептонной средой и индикатором, снабженные поплавками или комочками ваты, погруженными на дно сосуда. Посев 100,0 и 10,0  воды производят во флаконы и пробирки соответственно с 10,0 и 1,0  концентрированной среды; посев 1,0 и 0,1  воды в пробирки с 10,0  среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют 24 ч при (370,5)°С. Отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках позволяет получить отрицательный результат на наличие бактерий группы кишечных палочек в исследованном объеме воды и закончить исследование через 24 ч.

4.2.16. Из каждого флакона, где отмечено помутнение, кислота и газ, а также помутнение и кислота при использовании глюкозопептонной среды или помутнение при использовании лактозопептонной среды, высевают петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3 - 4 сектора. Посевной материал следует брать с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. При получении сплошного роста необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения изолированных колоний. Чашки помещают крышками вниз в термостат и инкубируют 16 - 18 ч при ()°С.

4.2.17. При отсутствии роста колоний на секторах среды Эндо, а также при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями к поверхностью, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний получают отрицательный результат,

4.2.18. Если при высеве из флаконов и пробирок, где отмечено-помутнение, кислота и газ на секторах среды Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него (лактозоноположительные) колонии, то их принадлежность к бактериям группы кишечных палочек подтверждают микроскопированием и постановкой оксидазного теста по п. 3.3.15.1.

Наличие грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест позволяют немедленно дать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды. Анализ воды по этапам очистки заканчивают учетом результатов по наличию или отсутствию на подтверждающей среде Эндо темно-красных колоний грамотрицательных палочек, не обладающих оксидазной активностью.

4.2.19. При анализе питьевой воды учитывают и те сектора,, где выросли только розовые и бесцветные колонии, или где темно-красные колонии оказались оксидазоположительными. В этом случае из двух - трех разного типа колоний каждого сектора приготовляют мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, а также проверяют оксидазную активность, по п. 3.3.15.2.

4.2.20. При наличии только грамоположительных спорообразующих бактерий получают отрицательный результат.

4.2.21. Наличие активной оксидазы у всех бактерий, высеянных из флаконов или пробирок, кроме перечисленных в п. 4.2.17, позволяет также получить отрицательный результат. Анализ во всех этих случаях заканчивают через 40 - 42ч.

4.2.22. При росте на секторах оксидазоотрицательных не окрашивающихся по Граму палочек две - три изолированные колонии разного типа с каждого сектора засеивают в полужидкую среду с глюкозой и инкубируют 4 - 5 ч при (370,5)°С.

При наличии кислоты и газа получают положительный результат. При отсутствии кислоты и газа получают отрицательный результат, анализ заканчивают через 44 - 48ч.

При наличии только кислоты пробирки оставляют на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования через 24 ч получают окончательный отрицательный результат, при наличии газа - положительный результат.

Примечание. Допускается высев из пробирок и флаконов производить на среду Эндо с добавкой молока или желатина, что даст возможность дифференцировать бактерии группы кишечных палочек от других водных сапрофитов, обладающих протеолитической активностью.

В готовую среду Эндо перед разливкой в чашки помимо 0,2  10%-го спиртового раствора основного фуксина и 0,2  5%-го спиртового раствора розоловой кислоты вводят 10  стерильного снятого молока (можно использовать cvxoe молоко, приготовленное по прописи на этикетке, или 15  стерильного 30%-го водного раствора желатина на 100  среды). При изготовлении среды Эндо следует учитывать воду, вводимую впоследствии с молоком или желатином. Вокруг колоний микробов, обладающих протеолитической активностью, образуются зоны просветления в результате предипитации при выпадении в осадок и араказеина или углубления (кратеры) при разжижений желатина. В последнем случае после 16 - 18 ч инкубации чашки вынимают из термостата и оставляют на 1 - 2 ч при температуре 20°С или в холодильнике для образования кратеров.

В этом случае о наличии на секторах среды Эндо бактерий группы кишечных палочек судят по обнаружению колоний грамотрицательных неспороносных палочек, сбраживающих глюкозу до кислоты и газа при (370,5)°С и не обладающих прогеолитической активностью.

4.2.23. Результат анализа выражают в виде коли-индекса (наиболее вероятное число бактерий группы кишечных палочек в 1 воды), величину которого определяют по таблицам приложения. При анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть п из нее коли-индекс определяют по табл. 1 и 2 приложения. При .анализе воды на этапах очистки и обеззараживания коли-индекс определяют по табл. 3 приложения.

4.3. Дополнительные исследования на наличие бактерий - показателей свежего фекального загрязнения

При обнаружении бактериального загрязнения воды свыше допустимых норм должен производиться повторный отбор проб с дополнительным их исследованием на наличие бактерий - показателей свежего фекального загрязнения.

Свежее фекальное загрязнение в воде устанавливают, определяя наличие кишечных палочек (преимущественно Escherichia coli), обладающих способностью ферментировать лактозу до кислоты и газа при (430,5)°С в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры.

4.3.1. Дополнительные исследования при работе методом мембранных фильтров

Если при повторном исследовании воды обнаружены на фильтрах темно-красные с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) колонии бактерий группы кишечных палочек, то параллельно с определением коли-индекса эти колонии (но не более 15} засевают в лактозную среду с борной кислотой, предварительно нагретую на водяной бане до (430,5)°С Затем засеянные пробирки вместе с баней переставляют в термостат и инкубируют 24 ч при (430,5)°С. Наличие мути и газа указывают на присутствие в воде бактерий - показателей свежего фекального загрязнения. Признаки роста (помутнение) без образования газа во внимание не принимают.

Вместо лактозной среды с борной кислотой можно использовать желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым, инкубируя посевы при (44,50,5)°С.

4.3.2. Дополнительные исследования при работе бродильным методом

Если при повторном исследовании на секторах среды Эндо выросли темно-красные колонии с металлическим блеском и без него (лактозоположительные), то по две-три такие колонии с каждого сектора засевают в лактозную среду с борной кислотой или в желчно-лактозную среду с бриллиантовым зеленым. Анализ выполняют по п. 4.3.1.

При необходимости ускоренного анализа высев в эти лактозные среды можно производить параллельно с посевом на сектора среды Эндо непосредственно из пробирок и флаконов, где обнаружены признаки роста, кислота и газообразование.

Примечание. Дополнительные исследования на наличие бактерий - показателей свежего фекального загрязнения можно выполнять не только во время повторных, но и первичных анализов при резком ухудшении санитарно-бактериологической характеристики воды.

4.3.3. В протоколе анализа необходимо указать величину коли-индекса, определяемую по основным методам и свидетельствующую о степени фекального загрязнения воды, а также наличие или отсутствие бактерий-показателей свежего фекального загрязнения, что устанавливают по дополнительным исследованиям.

4.3.4. При наличии на фильтрах или секторах среды Эндо бесцветных, прозрачных, нежных (реже слегка мутноватых) оксидазоотрицательных колоний, необходимо их выделить и изучить для установления их принадлежности к патогенным бактериям кишечной группы.

_____________________

* Переиздание (август 1993 г.) с Изменениями N 1,2, утвержденными в июле 1982 г., ноябре 1984 г. (ИУС 10-82, 2-85)

** Вместо карболового раствора генциана фиолетового и фуксина Циля допускается использовать полоски фильтровальной бумаги, пропитанные соответствующими растворами и высушенные.