Методические указания МУК 4.1.3053-13 "Определение остаточных количеств дифловидазина в огурцах, зеленой массе, зерне и масле сои методом газожидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 июля 2013 г.)

Методические указания МУК 4.1.3053-13
"Определение остаточных количеств дифловидазина в огурцах, зеленой массе, зерне и масле сои методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 5 июля 2013 г.)

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.092/01.00043/2012

Введены впервые

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии с термоионным детектором для определения массовой концентрации дифловидазина в огурцах в диапазоне концентраций 0.01 - 0.1 мг/кг, в зеленой массе 0.02 - 0.2 мг/кг, зерне сои 0.01 - 0.1 мг/кг, масле сои 0.05 - 0.5 мг/кг или метод газожидкостной хроматографии с насадочной колонкой и электронозахватным детектором (ДПР) в огурцах в диапазоне концентраций 0.002 - 0.02 мг/кг, в зеленой массе 0.004 - 0.04 мг/кг, зерне сои 0.002 - 0.02 мг/кг, масле сои - 0.01 - 0.1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Дифловидазин (синоним флуфензин)

3-(2-хлорфенил)-6-(2,6-дифторфенил)-1,2,4,5-тетразин (IUPAC).

Химически чистый препарат - кристаллическое вещество пурпурного цвета без запаха.

Температура плавления: °С

Давление паров - < mPa

Коэффициент распределения н-октанол/вода: (20°С)

Растворимость: в воде при 20°С -  мг/л; в н-гексане - 168, метаноле - 1.3, ацетоне - 24 (в г/л при 20°С). Стабилен в ацетоне, метаноле и гексане.

Вещество стабильно на свету и на воздухе, разлагается около точки плавления; стабильно в кислой среде, гидролизуется при рН >7, 60 час (рН 9, 25°С, 40% ацетонитрил).

Краткая токсикологическая характеристика: Относится к III классу опасности (малоопасен). Острая пероральная токсичность для крыс 594-979 мг/кг. Практически не токсичен для пчел, птиц и почвенных микроорганизмов Гигиенические нормативы: МДУ (для импортируемой продукции) в плодовых семечковых 0.04, в винограде 0.02 мг/кг.

Область применения: контактный акарицид с трансламинарной активностью, применяется на винограде, яблоне, сое и других культурах.

1. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей %, при доверительной вероятности 0.95.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Метрологические параметры

Диапазон измерений, массовая концентрация, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель промежуточной прецизионности (относительное средне-квадратическое отклонение в условиях вариации факторов "время", "оператор" в одной лаборатории), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) , %	Показатель точности * (границы относительной погрешности при вероятности Р=0,95), , %
Метод капиллярной ГЖХ с ТИД
огурцы от 0,01 до 0,1 вкл.	9	11	12	24
зеленая масса от 0,02 до 0,2 вкл.	8	9	11	22
зерно от 0,01 до 0.1 вкл.	9	11	12	24
масло от 0,05 до 0.5 вкл.	9	11	12	24
Метод ГЖХ с насадочной колонкой и ЭЗД (ДПР)
огурцы От 0.002 до 0.02 вкл.	9	11	12	24
зеленая масса от 0.004 до 0.04 вкл.	8	9	11	22
зерно сои от 0.002 до 0.02	9	11	12	24
масло сои от 0.01 до 0.1 вкл.	9	11	12	24

______________________________

* соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k=2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n=20, Р=0.95) приведены в таблице 2.

Таблица 2

Полнота определения дифловидазина в огурцах, зеленой массе, зерне и масле сои (N=5 для каждой концентрации)

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, , %
Метод капиллярной ГЖХ с ТИД
огурцы	0.01	0.01- 0.1	88	4.6	4.2
зеленая масса	0.02	0.02 - 0.2	89	3.2	2.9
зерно сои	0.01	0.01 - 0.1	84	4.7	4.3
масло сои	0.05	0.05 - 0.5	79	4.9	4.5
Метод ГЖХ с насадочной колонкой и ЭЗД (ДПР)
огурцы	0.002	0.002 - 0.02	88	4.7	4.3
зеленая масса	0.004	0.004 - 0.04	89	4.0	3.6
зерно сои	0.002	0.002 - 0.02	85	4.7	4.3
масло сои	0.01	0.01 - 0.1	82	4.8	4.4

2. Метод измерений

Методика основана на извлечении дифловидазина из растительных проб органическим растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями и на патронах с силикагелем. Количественное определение проводят методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора или газовой хроматографии с насадочной колонкой с электронозахватным детектором (или детектором постоянной скорости рекомбинации). Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф с термоионным детектором и капиллярной колонкой или газовый хроматограф с электронозахватным детектором и насадочной колонкой.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0.2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0.1 г, ГОСТ 24104-2001.

Микрошприц объемом 10 , ТУ 2-833-106.

Колбы мерные на 10, 100 и 1000 , ГОСТ 23932-90.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 , ГОСТ 29227-91.

Микродозаторы переменного объема от 100 до 1000  и от 1 до 5 , ГОСТ 50444.

Цилиндры мерные на 100 , ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Аналитический стандарт дифловидазина 99.9%

Ацетон, химически чистый, ТУ 6-09-3513-82.

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Азот газообразный в баллонах с редуктором, ТУ-6-16-40-14-88.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Гексан, химически чистый, ТУ 2631-003-05807999-98.

Насадка для аналитической колонки с 5% полярной фазы на инертном носителе (0.16-0.20 мм).

Натрий сернокислый безводный, чистый, ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, химически чистый, ГОСТ 4233-77.

Хлороформ, химически чистый, ГОСТ 20015-94

Этиловый эфир уксусной кислоты, чистый для анализа, ГОСТ 22300-76.

Элюент для очистки на патронах N 1: гексан - этилацетат (90:10 по объему).

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Воронки лабораторные, ГОСТ 25 336-82Е.

Воронки делительные объемом 500 , ГОСТ 8613-75.

Колбы плоскодонные на шлифах объемом 500 , ГОСТ 25 336-82Е.

Колбы круглодонные на шлифах объемом 50 , ГОСТ 25 336-82Е.

Колонка капиллярная кварцевая 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с полярной фазой (0,25 мкм).

Колонка стеклянная насадочная, длиной 2 м; внутренним диаметром 3 мм.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0.6 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Пробирки с притертыми пробками на 5 , ГОСТ 25336-82.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 35 кГц, ТУ 3.836.008.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1007-76).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 ) необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением" ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха °С и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 1726-85 "Огурцы свежие". Пробы огурцов и зеленой массы сои хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18°С.

Отбор проб зерна и масла сои производится по ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла сои хранят в холодильнике при 0-4°С в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

8. Подготовка к определению.

8.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40°С до объема 1,0  и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

8.2. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа насадочную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250°С в течение 8-10 часов.

Капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 280°С до получения стабильной нулевой линии.

8.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску дифловидазина (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 , растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (основной раствор с концентрацией 1.0 ). Градуировочные растворы с концентрациями 0.1, 0.2, 1.0 и 2.0  готовят методом последовательного разбавления по объему в 100, 50, 10 и 5 раз, используя для разбавления гексан. Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4°С в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют градуировочные растворы.

8.4. Подготовка патронов для твердофазной экстракции

Непосредственно перед употреблением через патрон, заполненный гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, пропускают 5  гексана.

8.5. Построение градуировочного графика.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифловидазина в растворе) в хроматограф вводят по 1  градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации дифловидазина в градуировочном растворе .

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С=KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0.99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

,

С - аттестованное значение массовой концентрации дифловидазина в градуировочном растворе,

- результат контрольного измерения массовой концентрации дифловидазина в градуировочном растворе,

- норматив контроля градуировочного коэффициента, %. при Р = 0.95).

9. Проведение определения

9.1.1. Определение дифловидазина в огурцах

Навеску измельченных огурцов массой  г помещают в коническую колбу на 250 , заливают 50  ацетона и экстрагируют дифловидазин в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Экстракцию повторяют еще раз 30  ацетона. Объединенный фильтрат упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С до водного остатка. К водному остатку добавляют 30  дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор помещают в делительную воронку на 250 , добавляют 10  насыщенного раствора хлористого натрия и 30  хлороформа. Воронку встряхивают в течение 2-3 мин и после разделения слоев нижний хлороформный слой собирают. Экстракцию дифловидазина повторяют еще 2 раза порциями по 30  хлороформа. Объединенные хлороформные экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40°С до полного удаления хлороформа. Сухой остаток растворяют в 100  ацетона, добавляют 1.9  гексана и хроматографируют. При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Определение дифловидазина в зеленой массе, зерне и масле сои

Зеленая масса и зерно сои. Навеску измельченной зеленой массы  г или измельченного на лабораторной мельнице зерна  г заливают 50  ацетона и экстрагируют дифловидазин в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют 30  ацетона. Полученный объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40°С до объема 4-5 , добавляют к остатку 30  дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр. К полученной смеси добавляют 10  насыщенного раствора хлористого натрия и 30  хлороформа и помещают в делительную воронку объемом 250 . После расслоения нижний хлороформный слой сливают, из верхнего водно-ацетонового слоя экстрагируют дифловидазин хлороформом еще дважды порциями по 30 . Объединенные хлороформные экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40°С до полного удаления хлороформа. Далее очистку проводят на патронах с силикагелем по п. 9.2.

Масло сои. Навеску масла  г растворяют в 50  гексана, отбирают 1/5 часть раствора (что соответствует 2 г масла) в делительную воронку, добавляют 50  ацетонитрила и встряхивают воронку в течение 2 минут. После расслоения жидкости нижний ацетонитрильный слой собирают, гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрил удаляют на ротационном испарителе при температуре 40°С до сухого остатка. Дальнейшую очистку проводят на патронах с силикагелем по п. 9.2.

9.2. Очистка экстрактов на патронах

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п. 9.1.1 и 9.1.2. экстрактов, растворяют в 50  ацетона и затем количественно переносят тремя порциями по 0.5  гексана в патрон. Гексановый элюат отбрасывают. Дифловидазин элюируют 3  элюента N 1 (гексан:этилацетат 90:10). Элюат собирают в пробирку и упаривают в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100  ацетона, добавляют 1.9  гексана и хроматографируют. Для проб масла сухой остаток растворяют в 100  ацетона, добавляют 0.9  гексана и 1  раствора вводят в хроматограф.

9.3. Условия хроматографирования

9.3.1. Газовый хроматограф с термоионным детектором и кварцевой капиллярной колонкой длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, (толщина слоя неподвижной фазы - 0.25 мкм). Температура колонки программируется от 120°С (2 мин) до 250°С (2 мин) со скоростью 20°С/мин. Температура детектора 380°С, испарителя 300°С. Расход газа-носителя 1 (азот) - 7.2  (170 кПа), сброс 4.2 , поддув в детектор 20 , расход водорода 11.6 , воздуха 200 . Деление потока 1:2. Дозируемый объем
1 .

9.3.2. Газовый хроматограф с электронозахватным детектором и насадочной колонкой.

Колонка стеклянная 2 м х 3 мм, заполненная инертным носителем с 5% полярной фазы.

Температура колонки 250°С, испарителя 300°С, детектора 330°С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 40 .

Объем вводимой пробы 1 мм

Линейный диапазон детектирования 0.1-2 нг.

9.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифловидазина в образце огурцов, зеленой массы, зерна или масла сои (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

,

где - высота (площадь) пика дифловидазина в стандартном растворе, мм ;

- высота (площадь) пика дифловидазина в анализируемой пробе, мм ;

V - объём экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация дифловидазина в стандартном растворе, .

Содержание остаточных количеств дифловидазина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифловидазина 2 (анализ с термоионным детектором) или 0.2  (анализ с электронозахватным детектором), разбавляют.

10. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости(1):

(1)

где - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

11. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р=0.95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0.01 мг/кг*, где *- 0.01 мг/кг - предел обнаружения в масле сои).

12. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

12.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

,

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

,

где - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, (3)

где - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко